網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)篩選天麻素防治糖尿病的分子機制

貴州中醫(yī)藥大學(xué)，貴州 貴陽 550025

天麻(GastrodiaelataBL.) 為貴州道地藥材，是常用而較名貴的中藥材，臨床應(yīng)用廣泛，在頭痛眩暈、癲癇、小兒驚風(fēng)等方面發(fā)揮重要作用[1]。主要含有：香莢蘭醇、香莢蘭醛、天麻素、多糖等化學(xué)成分，其中天麻素(gastrodin)含量最高[2]。天麻素藥理作用廣泛，毒副作用較，現(xiàn)代藥理學(xué)研究表明，天麻素在心血管疾病、糖尿病、神經(jīng)疼痛、帕金森病等有較好的治療效果[3-4]。已經(jīng)有文獻表明：天麻素注射液、天麻素聯(lián)合丹紅注射液、天麻醇提物、乙酰天麻素等在糖尿病及其并發(fā)癥中發(fā)揮作用[5-6]，但是作用機制尚未明確，為了進一步明確天麻素防治糖尿病調(diào)節(jié)的靶點，本研究采用網(wǎng)絡(luò)藥理方法，篩選天麻素作用的靶點，對其靶點進行通路分析、GO(Gene Ontology)功能注釋、相互作用分析等，明確天麻素防治糖尿病的分子機制。

1 材料與方法

1.1 數(shù)據(jù)庫與軟件 STRING(https://stringdb.org/)；DAVID(https://david.ncifcrf.gov/)； Cytoscape 3.5.1軟件(http://www.cytoscape.org)；KOBAS3.0(http://kobas.cbi.pku.edu.cn/index.php)；軟件運行于 Windows 操作系統(tǒng)平臺下，使用的相關(guān)軟件已授權(quán)或開源軟件。

1.2 天麻素靶標(biāo)蛋白篩選 天麻素的mol2結(jié)構(gòu)基于中藥系統(tǒng)藥理學(xué)數(shù)據(jù)庫和分析平臺(Traditional Chinese Medicine Systems Pharmacology ,TCMSP)[7]下載，采用SYBYL對薏苡仁化合物加氫、加電荷，每個化合物進行能量優(yōu)化。采用靶標(biāo)蛋白篩選基于Swiss Target Prediction(http://www.swisstarge-tprediction.ch/)數(shù)據(jù)庫，根據(jù)化學(xué)成分的2D 和 3D結(jié)構(gòu)進行預(yù)測。可以預(yù)測五種不同來源的生物，基于Daylight FP2的分子指紋方法，并采用了Tanimoto系數(shù)定義的相似度度量方法。通過Swiss Target Prediction進行靶標(biāo)預(yù)測，在線打開Swiss Target Prediction，在Choose an organism一欄中選擇Homo sapiens。輸入天麻素化學(xué)成分的SMILES,篩選天麻素靶標(biāo)蛋白。

1.3 天麻素靶標(biāo)蛋白生物功能分析 靶點GO功能分析基于DAVID 6.8(DAVID 6.8，https://david. ncifcrf.gov/)在線分析，將100個靶點導(dǎo)入DAVID數(shù)據(jù)庫，點擊限定物種為人源，設(shè)定閾值P<0.01，GO注釋分析包含，即細胞組分(cellular component，CC)、生物過程(biological process，BP)以及分子功能(molecular function，MF)。

1.4 天麻素靶標(biāo)蛋白靶標(biāo)通路分析及ggplot 2構(gòu)建網(wǎng)絡(luò)模型 基于KOBAX3.0(KEGG Orthology Based Annotation System)對天麻素靶標(biāo)蛋白進行通路富集分析，共有表達差異基因通過數(shù)據(jù)庫整合到相應(yīng)的Pathway條目。結(jié)果得到靶標(biāo)蛋白參與的所有途徑，篩選靶標(biāo)蛋白顯著參與的途徑(P≤0.01)，通過Rstudio中的ggplot 2輸出top 20通路，顯示通路名稱、Rich factor、富集分析的P值和Q值等。

1.5 靶標(biāo)蛋白相互作用分析 基于STRING對天麻素靶標(biāo)蛋白進行相互作用分析，物種設(shè)為“Homo sapiens”(人源)，下載string_ interactions.tsv文件，導(dǎo)入Cytoscape 3.5.1軟件，基于 Cytoscape 3.5.1 軟件中的的Cytohubba模塊篩選關(guān)鍵靶點[8-9]。

1.6 分子對接及關(guān)鍵氨基酸位點 采用Surflex-Dock 模塊完成分子對接研究[10]。甘油醛-3-磷酸脫氫酶(1U8F)從蛋白質(zhì)晶體結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù)庫RCSB (http://www.rcsb.org/pdb ) 獲取 3D 晶體結(jié)構(gòu)[11]?；赟urflex-Dock 模塊完成分子對接研究(標(biāo)準(zhǔn)模式)。選擇配體(Ligand)模式產(chǎn)生活性口袋；其他參數(shù)均采用 SYBYL默認(rèn)值，篩選結(jié)果以Total-Score>5為閾值[12]?；贚igplot 對天麻素和GAPDH進行相互作用分析。

2 結(jié)果

2.1 天麻素靶點GO功能注釋分析 基于DAVID對天麻素靶點進行GO注釋分析(表1)，生物過程中，100個靶點主要參與one-carbon metabolic process(碳代謝過程)、response to drug(藥物反應(yīng))、proteolysis(蛋白水解)；主要存在plasma membrane(質(zhì)膜)、melanosome(黑素體)、dendrite cytoplasm(樹突細胞質(zhì))等；分子功能上，100個靶點主要有insulin receptor substrate binding(胰島素受體底物結(jié)合)、phosphatidylinositol 3-kinase binding(磷脂酰肌醇3-激酶結(jié)合)等分子功能。

2.2 天麻素靶標(biāo)蛋白通路分析 采用DAVID 數(shù)據(jù)庫對天麻素靶點進行通路富集分析，100個靶標(biāo)蛋白顯著參與102條通路途徑(P<0.05)，采用R語言的ggplot 2輸出20條通路(圖1)，其中包括胰島素信號通路(Insulin signaling pathway)、TNF信號通路、胰島素抵抗等，詳見表2。

表1 潛在靶點的GO生物學(xué)過程富集分析

續(xù)表1

表1 潛在靶點的GO生物學(xué)過程富集分析

表2 通路富集分析

續(xù)表2

表2 通路富集分析

圖1 通路分析

2.3 天麻素靶標(biāo)蛋白相互作用分析 基于Cytoscape 3.5.1中的Cytohubba模塊，對100個靶標(biāo)基因進行相互作用分析，根據(jù)degree(度)的大小，輸出前30個靶標(biāo)基因(表3)，顏色越深，靶點越重要。100個靶標(biāo)蛋白中GAPDH為最關(guān)鍵靶點。

表3 關(guān)鍵基因

通過靶點相互作用分析，發(fā)現(xiàn)GAPDH為核心靶點，將采用分子對接進一步研究。天麻素與GAPDH形成4個氫鍵：Asp 35，Arg 16，Thr 99，Ser 122；天麻素與氨基酸Phe 37，Ser 98，Gly 100，Ile 14，Gly 12，Pro 191和Ile 38形成疏水作用(圖2)。

2.4 分子對接及氨基酸位點分析 利用 Surflex-Dock 分子對接模塊的 Total-Score 打分函數(shù)對小分子與靶標(biāo)蛋白相互作用進行評分，Total-Score值愈大，說明小分子化合物與大分子蛋白質(zhì)的匹配結(jié)合作用越好。天麻素與GAPDH分子對接結(jié)果為Total-Score=7.5，進一步驗證靶點相互作用的結(jié)果。說明天素與GAPDH有較強列的結(jié)合。

注: a:天麻素化學(xué)結(jié)構(gòu) b:天麻素與GAPDH相互作用分析圖2 天麻素調(diào)節(jié)的關(guān)鍵基因

3 討論

天麻素藥理作用廣泛，具有較好的應(yīng)用前景[13]。已經(jīng)文獻[14-15]表明：天麻素在腦缺血再灌注損傷、短暫性腦缺血、眩暈癥等多種疾病中發(fā)揮較好的治療效果。通過分子對接發(fā)現(xiàn)天麻素與甘油醛-3-磷酸脫氫酶( glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase, GAPDH )有較好的結(jié)合(Total-Score=7.5)，GAPDH參與能量代謝，同時也具有其他生理功能，與糖尿病密切相關(guān)。GAPDH在多種組織和細胞中表達。Min等[16]研究表明：GAPDH通過激活磷酸酶的活性對胰島素通路具有調(diào)節(jié)作用；同時由于糖尿病引起的視網(wǎng)膜病變、血管內(nèi)皮組織的損傷等并發(fā)癥的發(fā)生與GAPDH關(guān)系密切。GAPDH為多功能蛋白，目前，對機體的生理和病理狀態(tài)下的作用值得深入的研究。對于開發(fā)GAPDH的抑制劑和誘導(dǎo)劑有較好的應(yīng)用前景，尤其是GAPDH與胰島素通路關(guān)系密切，為糖尿病的防治提供一個嶄新的藥理靶向。

已有文獻[17]證實天麻素具有防治糖尿病的作用。白永等人通過免疫組化、蛋白印記、PCR等技術(shù)明確天麻素可以降低胰島素抵抗的同型半胱氨酸的含量；Sun等[18]觀察天麻素對STZ誘導(dǎo)痛性糖尿病神經(jīng)病變(PDN)的實驗動物模型的作用。對糖尿病引起的瞬態(tài)鈉電流、鉀電流有一定的對抗作用。目前，天麻素作用的靶點尚未完全明確，本研究通過分子對接發(fā)現(xiàn)GAPDH為天麻素核心靶點，通過分子對接發(fā)現(xiàn)天麻素與GAPDH有較好的結(jié)合。而且明確Phe37、Ser98、Gly100、Ile14、Gly12、Pro191、Ile38為關(guān)鍵氨基酸位點?？梢酝茰y這些殘基就是 GAPDH的重要殘基，其在決定酶的催化特性中起到了重要作用。

基于DAVID對天麻素調(diào)節(jié)的靶點進行通路分析，包括胰島素信號通路、TNF信號通路、胰島素抵抗等與糖尿病發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)的通路。目前，天麻素藥理作用的研究尚未全面、系統(tǒng)的分析，本研究采用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)篩選天麻素調(diào)節(jié)的靶標(biāo)蛋白，對靶標(biāo)蛋白進行功能分析、通路分析、蛋白相互作用分析，最后采用分子對接技術(shù)驗證天麻素與關(guān)鍵靶點的結(jié)合，明確其發(fā)揮藥理作用的分子機制，從而為天麻素的應(yīng)用及天麻制劑開發(fā)奠定基礎(chǔ)。