克氏原螯蝦微衛(wèi)星文庫構(gòu)建及多態(tài)性分析

宋丹丹，王 龍，魏紅靜，史文競(jìng)，朱傳坤

( 淮陰師范學(xué)院 生命科學(xué)學(xué)院，江蘇省特色水產(chǎn)繁育工程實(shí)驗(yàn)室，江蘇省區(qū)域現(xiàn)代農(nóng)業(yè)與環(huán)境保護(hù)協(xié)同創(chuàng)新中心，江蘇 淮安 223300 )

克氏原螯蝦(Procambarusclarkii)，俗稱小龍蝦，屬節(jié)肢動(dòng)物門、甲殼動(dòng)物亞門、十足目、蝲蛄科、原螯蝦屬，原產(chǎn)于北美，后經(jīng)日本引入我國(guó)[1]?？耸显r具有生長(zhǎng)迅速、生命力強(qiáng)、數(shù)量增長(zhǎng)快、耐運(yùn)輸、易銷售、市場(chǎng)價(jià)值高等優(yōu)點(diǎn)，成為我國(guó)重要的水產(chǎn)經(jīng)濟(jì)物種[2]。除具有很高的食用價(jià)值之外，克氏原螯蝦蝦殼中富含鈣、磷、鐵等多種重要營(yíng)養(yǎng)元素，可以加工為飼料添加劑；此外，從蝦殼中提取的蝦青素、甲殼素制備的殼聚糖等也是重要的工業(yè)原料，在多個(gè)領(lǐng)域中廣泛應(yīng)用[3]。

微衛(wèi)星又稱簡(jiǎn)單序列重復(fù)，它是由少數(shù)幾個(gè)核苷酸(大多數(shù)為2～6個(gè))為單位多次串聯(lián)重復(fù)的DNA序列，根據(jù)串聯(lián)重復(fù)是否連續(xù)，微衛(wèi)星序列可以分為完美型、非完美型和復(fù)合型3類[4]。微衛(wèi)星標(biāo)記具有分布廣泛、多態(tài)性高、PCR擴(kuò)增簡(jiǎn)單、節(jié)約樣品、易檢測(cè)、共顯性等優(yōu)點(diǎn)，已在多種水生生物群體遺傳結(jié)構(gòu)分析[5]、親子鑒定[6]、遺傳圖譜構(gòu)建及數(shù)量性狀位點(diǎn)定位[7]等研究中得到廣泛應(yīng)用。常用的微衛(wèi)星獲取方法主要包括：從公共數(shù)據(jù)庫獲取，從近緣物種跨種篩選及從基因組中自主開發(fā)等[8]。目前，克氏原螯蝦中已有微衛(wèi)星標(biāo)記開發(fā)的報(bào)道[9-10]，但是數(shù)量仍然較少，無法滿足當(dāng)前的研究需求。因此，本研究擬采用磁珠富集法構(gòu)建克氏原螯蝦微衛(wèi)星富集文庫并篩選多態(tài)性微衛(wèi)星標(biāo)記，以期為今后克氏原螯蝦及其近緣物種的遺傳學(xué)研究及分子標(biāo)記輔助育種提供有利工具。

1 材料與方法

1.1 基因組DNA提取及檢測(cè)

試驗(yàn)用41尾克氏原螯蝦樣本均購于江蘇省常州市集貿(mào)市場(chǎng)，每尾個(gè)體取肌肉組織置于2 mL離心管中，加入無水乙醇后保存在4 ℃冰箱中備用。基因組DNA提取采用苯酚—氯仿法進(jìn)行。用1%瓊脂糖凝膠電泳及NanoDrop2000型微量紫外分光光度計(jì)進(jìn)行DNA質(zhì)量檢測(cè)，并將DNA稀釋為50 ng/μL備用。

1.2 基因組酶切及片段回收

取1尾克氏原螯蝦DNA樣本1.5 μL，加入Mse-I限制性內(nèi)切酶，于冰上混勻后在37 ℃水浴中酶切2 h，酶切完畢后，用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)酶切效果。將等體積的MseI-1(5′-GACGATGAGTCCTGAG-3′)和Mse-2(5′-TACTCAGGACTCAT-3′)接頭混合后，在95 ℃條件下變性5 min后緩慢冷卻至室溫，制備成Mse-I接頭。用T4 DNA連接酶將Mse-I接頭和酶切產(chǎn)物于16 ℃恒溫生化培養(yǎng)箱中過夜連接。

將連接產(chǎn)物稀釋10倍后作為模板，以MseI-N(5′-GATGAGTCCTGAGTAAN-3′)作為引物，進(jìn)行預(yù)擴(kuò)增。預(yù)擴(kuò)增反應(yīng)體系如下：總體積為25 μL，包含10×PCR Buffer(不含Mg2+)2.5 μL，MgCl21.6 μL，dNTPs 0.4 μL，MseI-N 0.8 μL，DNA模板1.0 μL，Taq DNA 聚合酶0.2 μL。為確定最佳預(yù)擴(kuò)增效果，在進(jìn)行PCR反應(yīng)過程中，設(shè)置了20、22、24、26和28共5個(gè)不同循環(huán)梯度，PCR反應(yīng)程序如下：94 ℃預(yù)變性5 min，94 ℃變性1 min，53 ℃退火1 min，72 ℃延伸1 min，72 ℃終延伸20 min。預(yù)擴(kuò)增完成后，用1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)各循環(huán)梯度的擴(kuò)增效果，確定最佳循環(huán)數(shù)。循環(huán)數(shù)確定后，將PCR反應(yīng)體系擴(kuò)大至50 μL，依照上述PCR程序設(shè)定及最佳循環(huán)數(shù)進(jìn)行PCR擴(kuò)增，并對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行純化回收。

1.3 生物素探針雜交

取“1.2”中回收產(chǎn)物29 μL與70 μL雜交液(6×SSC+0.1% SDS)混合，加入生物素標(biāo)記的(GT)13探針1 μL，配制成100 μL雜交反應(yīng)混合液。雜交反應(yīng)在PCR儀中進(jìn)行，程序設(shè)定如下：95 ℃變性5 min，65 ℃退火1 h，緩慢降溫至室溫，使混合液充分雜交。

1.4 磁珠富集

吸取150 μL鏈霉親和素包被的磁珠于1.5 mL離心管中，于室溫下用300 μL TEN100溶液洗滌3次，每次洗滌5 min，之后，向含磁珠的管內(nèi)加入300 μL TEN100溶液及“1.3”中所得雜交產(chǎn)物混勻，室溫下靜置30 min后，用磁力架固定磁珠并棄去雜交混合液。加入400 μL TEN100溶液對(duì)磁珠進(jìn)行3次非嚴(yán)謹(jǐn)洗脫，每次5 min。再用400 μL 0.2×SSC和0.1% SDS混合的洗滌液對(duì)磁珠進(jìn)行3次嚴(yán)謹(jǐn)洗脫，每次5 min。最后向管中加入50 μL pH8.0的TE緩沖液，并在100 ℃沸水中水浴5 min，得到第一次洗脫片段，重復(fù)該操作一次，獲得第二次洗脫片段，對(duì)兩次洗脫產(chǎn)物進(jìn)行電泳檢測(cè)。

1.5 洗脫片段預(yù)擴(kuò)增及純化

對(duì)得到的洗脫產(chǎn)物進(jìn)行預(yù)擴(kuò)增，預(yù)擴(kuò)增體系與PCR程序設(shè)定同“1.2”，擴(kuò)增30個(gè)循環(huán)。根據(jù)瓊脂糖凝膠電泳后的結(jié)果選擇第二次洗脫產(chǎn)物并利用快速瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒進(jìn)行純化。

1.6 目的片段克隆及陽性檢測(cè)

將“1.5”中所得純化產(chǎn)物連接到pMD18-T載體后轉(zhuǎn)化入DH5α感受態(tài)大腸桿菌(Escherichiacoli)細(xì)胞，并涂布在含氨芐青霉素的固體LB培養(yǎng)基上于37 ℃培養(yǎng)16 h。

用無菌牙簽挑選單個(gè)克隆于含氨芐青霉素的50 μL液體LB培養(yǎng)基的離心管中，在37 ℃恒溫?fù)u床中以200 r/min速度振蕩培養(yǎng)24 h。利用通用引物M13對(duì)培養(yǎng)的各克隆進(jìn)行PCR擴(kuò)增及瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，挑選出片段大小在250～800 bp的克隆送至武漢艾康健生物技術(shù)有限公司測(cè)序。

1.7 同源序列查找

將各克隆測(cè)序所得序列在GenBank(https:∥blast.ncbi.nlm.nih.gov)中利用BLASTn進(jìn)行同源序列比對(duì)，當(dāng)E值小于10-10時(shí)，認(rèn)為是同源序列，當(dāng)序列有多個(gè)同源序列時(shí)，取E值最低的序列作為相應(yīng)克隆的同源序列。

1.8 微衛(wèi)星引物設(shè)計(jì)及多態(tài)性篩選

克隆測(cè)序完成后，利用SSRHunter軟件從已獲得的序列中查找微衛(wèi)星序列，并輔以人工校對(duì)。對(duì)于含微衛(wèi)星的片段，通過Primer premier 5.0軟件設(shè)計(jì)引物并送生工生物工程(上海)股份有限公司進(jìn)行合成。合成的引物在10尾克氏原螯蝦中進(jìn)行擴(kuò)增效果檢測(cè)與多態(tài)性篩選。將篩選出的多態(tài)性引物在含有30尾個(gè)體的克氏原螯蝦群體中進(jìn)行多態(tài)性特征分析。檢測(cè)過程中所用PCR反應(yīng)體系總體積為12.5 μL：包括10×PCR buffer(含Mg2+)1.3 μL，dNTPs 0.4 μL，上、下游混合引物 0.4 μL，DNA模板 1 μL，Taq DNA聚合酶 0.1 μL，無菌超純水9.3 μL。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物用10%的聚丙烯酰胺凝膠進(jìn)行電泳，經(jīng)GoldviewⅠ型染色劑染色后通過紫外凝膠成像系統(tǒng)成像，并以Super DNA marker的梯度大小為標(biāo)準(zhǔn)，判斷各微衛(wèi)星標(biāo)記的等位基因，并將分型數(shù)據(jù)輸入Excel表格中備用。

1.9 多態(tài)性數(shù)據(jù)分析

利用Arlequin 3.01軟件分析各多態(tài)性微衛(wèi)星標(biāo)記的等位基因數(shù)、期望雜合度、觀測(cè)雜合度、連鎖不平衡以及哈迪—溫伯格平衡的偏離情況，所涉及參數(shù)的顯著值通過Bonferroni法進(jìn)行校正[11]。此外，多態(tài)信息含量采用基于Excel的軟件MS-TOOLS[12]進(jìn)行計(jì)算，而標(biāo)記中的潛在零等位基因則利用軟件Micro-Checker 2.2.3[13]進(jìn)行預(yù)測(cè)。各軟件分析多態(tài)位點(diǎn)分型數(shù)據(jù)時(shí)所涉及的格式轉(zhuǎn)換均通過CONVERT軟件進(jìn)行。

2 結(jié) 果

2.1 微衛(wèi)星富集文庫陽性克隆檢測(cè)

本研究中所構(gòu)建的克氏原螯蝦微衛(wèi)星富集文庫獲得克隆約1000個(gè)，隨機(jī)選擇其中的82個(gè)克隆進(jìn)行陽性檢測(cè)(圖1)。檢測(cè)結(jié)果顯示，挑選的克隆中含陽性單克隆75個(gè)，陽性雙克隆3個(gè)，假陽性克隆4個(gè)，因此，該文庫的陽性率達(dá)到95.1%。

圖1 克氏原螯蝦微衛(wèi)星富集文庫部分克隆電泳檢測(cè)圖1～24號(hào)為克隆泳道，M為Marker.

2.2 微衛(wèi)星富集效率

將檢測(cè)出的75個(gè)陽性單克隆送交武漢艾康健生物科技有限公司測(cè)序后，有8個(gè)克隆因質(zhì)粒抽提失敗未進(jìn)行測(cè)序，另外的10個(gè)因含有高級(jí)結(jié)構(gòu)而未能成功測(cè)序，因此，成功測(cè)序的克隆有57個(gè)。在這57條克隆序列中，含微衛(wèi)星重復(fù)序列的有43條，因而本文庫的微衛(wèi)星富集效率為75.4%。

2.3 微衛(wèi)星特征分析

在含有微衛(wèi)星的43條序列中，完美型微衛(wèi)星序列有25條(58.1%)，非完美型序列有8條(18.6%)，復(fù)合型序列有7條(16.2%)，3條為重復(fù)單元大于6堿基的小衛(wèi)星序列(7.0%)(圖2a)。在測(cè)得43條微衛(wèi)星序列中共含51個(gè)微衛(wèi)星位點(diǎn)，平均每條序列含1.2個(gè)，33條(76.7%)序列中含一個(gè)微衛(wèi)星位點(diǎn)，10條(23.3%)序列含一個(gè)以上微衛(wèi)星位點(diǎn)，最多的序列具有3個(gè)微衛(wèi)星位點(diǎn)(圖2b)。

本研究中所用的探針重復(fù)類型為GT，因而獲得的微衛(wèi)星序列重復(fù)單元多為CA/AC與GT/TG(66.7%)，但也有GA、ACC等其他堿基重復(fù)類型(圖2c)，甚至還有以13、38和30堿基為重復(fù)單元的3條小衛(wèi)星序列(圖2a)。在51個(gè)微衛(wèi)星位點(diǎn)中，重復(fù)次數(shù)最少為4次，最多為161次，有22個(gè)位點(diǎn)(43.1%)重復(fù)次數(shù)大于10次，其中有10個(gè)(19.6%)重復(fù)次數(shù)大于20次(圖2d)。

圖2 克氏原螯蝦文庫所得微衛(wèi)星基本情況a：不同類型微衛(wèi)星分布情況；b：序列所含微衛(wèi)星位點(diǎn)個(gè)數(shù)分布；c：微衛(wèi)星不同重復(fù)單元分布情況；d：微衛(wèi)星重復(fù)次數(shù)分布情況.

2.4 同源序列查找

在美國(guó)國(guó)立生物技術(shù)信息中心上將克隆所得的57條序列通過BLASTn搜索，共匹配出12條同源序列，匹配相似度為87%～100%(表1)。其中，克隆PcGT01序列與信號(hào)小龍蝦(Pacifastacusleniusculus)血小板衍生生長(zhǎng)因子(PDGF)和血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(VEGF)相關(guān)受體1(PVR1)mRNA同源；克隆PcGT12序列與曼氏血吸蟲(Schistosomamansoni)的微衛(wèi)星序列具有較高同源性；克隆PcGT08、10、36和48與克氏原螯蝦中已發(fā)表的部分微衛(wèi)星序列同源，而PcGT02、14、15、16、17和20序列則與克氏原螯蝦中的部分基因序列同源(表1)。這在今后的應(yīng)用過程中將具有重要參考價(jià)值。

表1 克氏原螯蝦克隆序列同源序列查找結(jié)果

2.5 微衛(wèi)星引物設(shè)計(jì)及多態(tài)性篩選分析

在含微衛(wèi)星位點(diǎn)的43條序列中，有22條側(cè)翼序列太短或者是GC含量過低，無法設(shè)計(jì)引物，最終，對(duì)剩余的21條序列設(shè)計(jì)了引物(表2)。將這21對(duì)引物在10尾克氏原螯蝦中進(jìn)行PCR及電泳檢測(cè)，結(jié)果表明，這21對(duì)引物中的18對(duì)可擴(kuò)增出穩(wěn)定、清晰的條帶，其中有9對(duì)表現(xiàn)出良好的多態(tài)性，多態(tài)性比例為50%(表2)。

表2 本研究所設(shè)計(jì)克氏原螯蝦微衛(wèi)星引物的基本信息及檢測(cè)結(jié)果

續(xù)表2

引物名稱GenBank號(hào)引物序列(5′→3′)產(chǎn)物大小/bp退火溫度/℃是否成功是否多態(tài)PcGT08MH998135F:GCTATTGAGATGTGCCATTGR:TGTTGATTGACAGTTGCGAG10851是否PcGT09MH998136F:AGTAGTGATACATACAACACAGCR:TAACCCCCTGACCTAACCTA14149是是PcGT10MH998137F:TCACATGAACAACCAAAGAATR:ATGACAGAACCCGATAGGC22351是是PcGT11MH998138F:GTCTGCTTGCCTGGGAGTATR:TCGTTCACACAGCTGTAACATG26654是否PcGT12MH998139F:TGATTGACAGTTGAGAGGCGR:CAAGCAAGGCTGGTTCATC42054否否PcGT13MH998140F:GCAGAATACCCCCGTTGAR:TGTGTAGTGGAAGCGTGTTG10251是否PcGT14MH998141F: TGTCCCACACTTTGCTTCCR: GCCATTCCCATCACCACTA21352是否PcGT15MH998142F: CCTATCACGAAACCTCCTGTR: CCTGCCATCCTTAAACCTAC17852是是PcGT16MH998143F: AACTGTCGGCAAGTAAGGTGR: AGGTGCTCAGAAGTGCGTAG30656否否PcGT17MH998144F: CTGTCGCCATTCCATTGTGTR: TAAACTCCCCCCTCATCTACTG22850是是PcGT18MH998145F: GGGTGGCGTCCTTGATTGATR: ATTTGGCGGGTAGGTCTCTCC17255是否PcGT19MH998146F: GACAACACCATCACGGGCTCR: CTTCCACAGTAGCAAGGTCTCG28657否否PcGT20MH998147F: TATTCTTCCCCATTTTGTCCR: TTTGCCCCATATCTAAGTCAT18952是是PcGT21MH998148F: GTTGATTGACGGTTGAGAGR: TAATCTACCTGGTCTGTTGC15752是是

2.6 多態(tài)性標(biāo)記特征分析

篩選所得9個(gè)微衛(wèi)星標(biāo)記共得到等位基因36個(gè)，其中PcGT15和PcGT21等位基因數(shù)最多，均為6個(gè)；PcGT03和PcGT10只獲得了較少的兩個(gè)等位基因(表3)。9個(gè)多態(tài)位點(diǎn)的平均觀測(cè)雜合度為0.5856，其中PcGT17的最高(0.6667)，其次為PcGT15(0.6000)，而PcGT10的最低(0.3522)(表3)；平均期望雜合度為0.6291，其中最高的為PcGT21(0.8390)，最低的為PcGT10(0.3704)(表3)。多態(tài)信息含量最高為PcGT21中的0.8001，最低為PcGT10中的0.2859(平均為0.5584)，其中PcGT07、PcGT15、PcGT17、PcGT20和PcGT21的多態(tài)信息含量大于0.5，表明這些位點(diǎn)具有高度多態(tài)性，其余4個(gè)標(biāo)記表現(xiàn)出中度多態(tài)性(表3)。通過Bonferroni校正后，PcGT03、PcGT07和PcGT21仍然偏離哈迪—溫伯格平衡(P<0.01)(表3)。連鎖不平衡分析結(jié)果經(jīng)Bonferroni校正后(P<0.001)未發(fā)現(xiàn)標(biāo)記間的連鎖現(xiàn)象。通過Micro-Checker軟件檢測(cè)的結(jié)果顯示，標(biāo)記PcGT07、PcGT17、PcGT20和PcGT21中可能存在零等位基因。

3 討 論

3.1 微衛(wèi)星富集效果與組成特征

在真核基因組中，微衛(wèi)星廣泛分布，其中重復(fù)類型為(CA)n或是(GT)n的含量尤為豐富，如中國(guó)明對(duì)蝦(Fenneropenaeuschinensis)[14]、日本蟳(Charybdisjaponica)[15]等。與先前的研究報(bào)道類似，本研究獲得的微衛(wèi)星重復(fù)單元以CA/AC和GT/TG為主，但同時(shí)也發(fā)現(xiàn)了GA、ACC和TAACC等其他重復(fù)類型。目前，微衛(wèi)星分子標(biāo)記技術(shù)已廣泛應(yīng)用于水產(chǎn)動(dòng)物的遺傳學(xué)和分子生物學(xué)研究中，如陳萬光等[16]用微衛(wèi)星標(biāo)記分析及檢測(cè)一個(gè)日本錦鯉(Cyprinuscarpiokoi)人工養(yǎng)殖群體的遺傳多樣性。孫成飛等[17]利用微衛(wèi)星分子標(biāo)記技術(shù)比較了中、泰兩國(guó)羅氏沼蝦(Macrobrachiumrosenbergii)養(yǎng)殖群體的遺傳結(jié)構(gòu)及遺傳多樣性。朱傳坤等[18]構(gòu)建了鳙魚(Aristichthysnobilis)的微衛(wèi)星標(biāo)記遺傳連鎖圖譜。

表3 克氏原螯蝦9個(gè)微衛(wèi)星位點(diǎn)多態(tài)性分析

注：*表示偏離哈迪—溫伯格平衡.

獲取微衛(wèi)星標(biāo)記的方法有多種，目前常用的有從公共數(shù)據(jù)庫獲取微衛(wèi)星分子標(biāo)記、從近緣物種中獲取微衛(wèi)星標(biāo)記及從基因組中自主開發(fā)新的微衛(wèi)星標(biāo)記這3種方法。從公共數(shù)據(jù)庫中獲取微衛(wèi)星標(biāo)記較為簡(jiǎn)單方便，但公共數(shù)據(jù)庫中包含的物種微衛(wèi)星標(biāo)記數(shù)據(jù)量較少，覆蓋面低，具有一定局限性；微衛(wèi)星序列包含側(cè)翼序列及核心序列，核心序列的重復(fù)次數(shù)決定了微衛(wèi)星的多態(tài)性，側(cè)翼序列則具有保守性，因此已獲得的微衛(wèi)星標(biāo)記可用于近緣物種的研究分析，如部分牛微衛(wèi)星標(biāo)記在羊的基因組中也表現(xiàn)出多態(tài)性[19]，鯉魚微衛(wèi)星標(biāo)記在鰱魚(Hypophthalmichthysmolitrix)中跨種應(yīng)用[20]等。盡管上述方法操作簡(jiǎn)便、成本低，但由于可用數(shù)據(jù)信息較為有限，無法大量篩選所需標(biāo)記。因此，最主要的方法是從目標(biāo)物種基因組中自主開發(fā)微衛(wèi)星標(biāo)記，其中磁珠富集法獲得微衛(wèi)星標(biāo)記的效率較高，已在多種水產(chǎn)動(dòng)物中成功應(yīng)用[21-22]。

本研究采用生物素標(biāo)記的(GT)13探針與擴(kuò)增片段雜交，通過磁珠富集法來構(gòu)建微衛(wèi)星富集文庫，構(gòu)建出的文庫中有57個(gè)克隆測(cè)序成功，陽性克隆率為95.1%，高于多種已報(bào)道水產(chǎn)動(dòng)物中的陽性率[15,21,24]。影響陽性克隆率的因素有很多，如不同研究者操作程序、物種、基因組質(zhì)量、連接產(chǎn)物回收純化效果等差異均會(huì)影響磁珠富集效率。在測(cè)序成功的57個(gè)克隆中有微衛(wèi)星序列43條，因而微衛(wèi)星富集效率達(dá)到了75.4%，其中完美型序列占比最大，達(dá)到了58.1%，非完美型占18.6%，復(fù)合型序列占16.2%，這與烏蘇里擬鲿(Pseudobagrasussuriensis)[22]、草魚(Ctenopharyngodonidellus)[23]、合浦珠母貝(Pinctadafucata)[24]、中國(guó)鱟(Tachypleustridentatus)[25]等的微衛(wèi)星數(shù)據(jù)類似。

3.2 微衛(wèi)星多態(tài)性

一般微衛(wèi)星重復(fù)次數(shù)越多，反映出該位點(diǎn)的多態(tài)性也就越高[4]，在本研究獲得的51個(gè)微衛(wèi)星位點(diǎn)中，有22個(gè)(43.1%)位點(diǎn)重復(fù)10次以上，其中有10個(gè)(19.6%)重復(fù)次數(shù)高于20次，表明克氏原螯蝦基因組中存在較多潛在的多態(tài)性微衛(wèi)星位點(diǎn)。最終18對(duì)能夠擴(kuò)增出穩(wěn)定條帶的引物中，多態(tài)性比例達(dá)到了50%，比先前報(bào)道的多種水產(chǎn)動(dòng)物的多態(tài)性比例都高[21-22]。多態(tài)信息含量能夠反映出一個(gè)遺傳標(biāo)記的多態(tài)性信息量，當(dāng)多態(tài)信息含量>0.5時(shí)，為高度多態(tài)性；多態(tài)信息含量為0.25～0.5時(shí)，為中度多態(tài)性[26]。本研究所得9個(gè)多態(tài)位點(diǎn)中有5個(gè)位點(diǎn)表現(xiàn)為高度多態(tài)性，其余4個(gè)為中度多態(tài)性，這也預(yù)示著這些多態(tài)性標(biāo)記將成為今后克氏原螯蝦遺傳學(xué)分析的有力工具。

零等位基因一般是由微衛(wèi)星引物結(jié)合位點(diǎn)突變或缺失阻礙了微衛(wèi)星的擴(kuò)增造成的[27]，其對(duì)相關(guān)研究結(jié)果的影響尚不清楚，大部分研究將其直接用于結(jié)果的分析[28]。一般情況下，零等位基因可通過哈迪—溫伯格平衡檢驗(yàn)法或零等位基因檢測(cè)軟件如Micro-Checker等檢測(cè)出來。本研究所得9個(gè)多態(tài)標(biāo)記中，PcGT03、PcGT07和PcGT21顯著偏離哈迪—溫伯格平衡，而PcGT07、PcGT17、PcGT20和PcGT21中可能存在零等位基因，因此，PcGT07和PcGT21偏離哈迪—溫伯格平衡可能是零等位基因所致。然而，另外一個(gè)偏離哈迪—溫伯格平衡的標(biāo)記PcGT03中未檢測(cè)出零等位基因，而符合哈迪—溫伯格平衡的兩個(gè)標(biāo)記PcGT17和PcGT20中反而檢測(cè)出零等位基因，這說明零等位基因的產(chǎn)生機(jī)制較復(fù)雜，有待更加深入的研究來解釋。

此外，本研究所得57條克隆序列中共檢索出12條匹配程度較高的同源基因，這些同源分析結(jié)果將為豐富克氏原螯蝦的基因組序列信息及進(jìn)一步的遺傳分析提供參考。

4 結(jié) 論

本研究得到以下結(jié)論：(1)采用磁珠富集法構(gòu)建克氏原螯蝦微衛(wèi)星文庫切實(shí)可行；(2)從克氏原螯蝦富集文庫中開發(fā)的微衛(wèi)星標(biāo)記多態(tài)性比例較高，而且均表現(xiàn)為中度及高度多態(tài)性。