外源抗壞血酸對鼠尾藻鎘脅迫的緩解效應

呂 芳，辛美麗，丁 剛，吳海一,3

( 1.山東省海洋生物研究院，山東省大型海藻資源保護與應用工程技術(shù)研究中心，山東 青島 266104; 2.青島市大型海藻工程技術(shù)研究中心, 山東 青島 266104; 3.山東省海水養(yǎng)殖病害防治重點實驗室，山東 青島 266104 )

隨著重金屬在農(nóng)業(yè)、工業(yè)以及化學上的廣泛應用，重金屬污染日益加劇，產(chǎn)生了嚴重的環(huán)境問題。鎘是重金屬中毒性較強的元素之一，是植物非必需元素，具有蓄積性，難以去除，且能沿著食物鏈轉(zhuǎn)移富集，對生物造成毒害[1]。大型海藻作為海洋生態(tài)系統(tǒng)的初級生產(chǎn)者, 對海水中的重金屬具有高效的富集能力[2-5]，在近海污染修復方面顯示出廣闊的應用前景，具有顯著而獨特的環(huán)境生態(tài)效益。

抗壞血酸是植物體內(nèi)廣泛存在的一種小分子物質(zhì)，在植物抗氧化清除自由基、光合作用、細胞生長和分裂等植物生長發(fā)育過程中有著非常重要的生物功能[6-8]。研究表明，一定量的抗壞血酸對逆境脅迫下植物的生長發(fā)育、生理代謝、抗氧化系統(tǒng)、超微結(jié)構(gòu)等有明顯的改善作用[9-10]，從而增強其對環(huán)境脅迫的耐受性。有關(guān)植物受重金屬鎘毒害及植物體內(nèi)緩解鎘脅迫的機理已有一些相關(guān)報道[11-12]，結(jié)果顯示，抗壞血酸能有效緩解鎘對植物的毒害，但關(guān)于抗壞血酸緩解大型海藻重金屬脅迫的研究則較少。

鼠尾藻(Sargassumthunbergii)，屬褐藻門、馬尾藻科，是我國沿海常見的經(jīng)濟海藻，不僅可以作為海參、鮑魚等水產(chǎn)動物的優(yōu)質(zhì)餌料，還可以作為工業(yè)原料用于提取褐藻膠及其他生物活性物質(zhì)。前期研究表明，鼠尾藻對重金屬鎘具有較強的富集能力，是海洋生態(tài)環(huán)境修復的理想生物材料[2]，但鎘含量較高時會對鼠尾藻的生長和生理產(chǎn)生明顯的抑制效應，大大降低其修復鎘污染的效率[13]。筆者在前期研究的基礎(chǔ)上，探討外源抗壞血酸對鎘脅迫下鼠尾藻的生長和抗氧化指標的影響，旨在為進一步探明大型海藻對重金屬耐受的生理機制和在重金屬脅迫下外源抗壞血酸對海藻的解毒機理提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

鼠尾藻于2017年4月6日采自山東省青島市太平灣潮間帶(N 36°05′, E 120°35′)。用低溫箱運回實驗室，經(jīng)海水反復清洗去除泥沙及雜質(zhì)后，置于溫度15 ℃、光照度2000 lx、光周期12L∶12D的循環(huán)水箱中充氣暫養(yǎng)，5 d后用于試驗。選取生長健壯、形態(tài)和規(guī)格較一致[長度(5.0±0.5) cm、質(zhì)量(1.0±0.1) g]的個體作為試驗材料。

1.2 試驗方法

試驗在容積為1000 mL的三角瓶中進行，每個三角瓶放置3株藻體及800 mL培養(yǎng)液，培養(yǎng)液為過濾海水，添加5.0 mg/L CdCl2·2.5H2O (鎘質(zhì)量濃度由預備試驗得到)和不同質(zhì)量濃度的抗壞血酸進行處理。參照文獻[13]及預試驗的結(jié)果，試驗分組如下：

空白對照組；鎘脅迫組：5.0 mg/L CdCl2·2.5H2O；20 mg/L抗壞血酸緩解組：5.0 mg/L CdCl2·2.5H2O+20 mg/L抗壞血酸；40 mg/L抗壞血酸緩解組：5.0 mg/L CdCl2·2.5H2O+40 mg/L抗壞血酸；60 mg/L抗壞血酸緩解組：5.0 mg/L CdCl2·2.5H2O+60 mg/L抗壞血酸；80 mg/L抗壞血酸緩解組：5.0 mg/L CdCl2·2.5H2O+80 mg/L抗壞血酸；100 mg/L抗壞血酸緩解組：5.0 mg/L CdCl2·2.5H2O+100 mg/L抗壞血酸。

每個處理3個平行，培養(yǎng)條件同暫養(yǎng)條件，每日更換培養(yǎng)液，培養(yǎng)5 d后進行如下指標測定。

1.3 生物量的測定

生物量的測定以比生長速率[14]表示，取出各處理組的藻體，用濾紙吸干藻體表面的水分，稱得鮮質(zhì)量，計算公式如下：

比生長速率/%·d-1=[(mt/m0)1/t-1]×100%

式中，mt為試驗結(jié)束時藻體鮮質(zhì)量(g)，m0為試驗開始時藻體鮮質(zhì)量(g)，t為培養(yǎng)時間(d)。

1.4 鎘含量的測定

鼠尾藻用雙蒸水充分清洗后，用濾紙吸干藻體表面的水分，取2 g研磨成勻漿狀，采用微波消解后，用原子吸收光譜儀(Thermo Scientific iCE 3500)測定。

1.5 光合色素(葉綠素a和類胡蘿卜素)、可溶性糖和可溶性蛋白的測定

光合色素參照文獻[15]的方法測定，取0.1 g新鮮藻體研磨成勻漿狀，加入8 mL 80%丙酮置于4 ℃黑暗處抽提24 h。4000 r/min、4 ℃離心10 min棄沉淀，上清液用80%丙酮定容至10 mL。以80%丙酮作為空白對照，測定665、652、510、480 nm波長處的吸光值(OD)。重復3次以上，計算平均值。按下式計算葉綠素a含量及類胡蘿卜素含量：

葉綠素a含量/mg·g-1=(16.29OD665-8.54OD652)×V/m/1000

類胡蘿卜素含量/mg·g-1=7.6×(OD480-1.49×OD510)×V/m/1000

式中，V為浸提丙酮的體積(mL)，m為藻體質(zhì)量(g)。

可溶性糖采用南京建成植物可溶性糖檢測試劑盒蒽酮比色法測定，取0.2 g新鮮藻體在液氮中研磨成勻漿狀，加8 mL蒸餾水后于80 ℃水浴30 min，冷卻后離心定容至10 mL，作為待測溶液。

可溶性蛋白采用南京建成蛋白檢測試劑盒考馬斯亮藍法測定，取1 g藻體在液氮中研磨成勻漿狀，加蒸餾水后離心定容到10 mL，作為待測溶液。

1.6 抗氧化系統(tǒng)的測定

超氧化物歧化酶、過氧化氫酶的活性和丙二醛含量的測定均用南京建成生物工程研究所試劑盒測定。取1 g新鮮藻體用液氮研磨成勻漿狀，加入4 mL提取液(50 mmol/L磷酸緩沖液，pH 7.0；0.1% Triton X-100；1% PVP)[16], 離心取上清液作為待測溶液。

1.7 數(shù)據(jù)分析

所得數(shù)值以平均值±標準差表示。顯著性差異用單因素方差分析，分析軟件為SPSS 13.0，當P<0.05時為顯著性差異。

2 結(jié)果與分析

2.1 外源抗壞血酸對鎘脅迫下鼠尾藻生長的影響

不同質(zhì)量濃度抗壞血酸處理對鎘脅迫下鼠尾藻生長的影響見圖1。5.0 mg/L鎘處理嚴重影響了鼠尾藻的生長，與空白對照組相比，比生長速率下降了58.01%；加入不同濃度的抗壞血酸后，藻體的比生長速率均有了顯著提高，并且比生長速率隨著抗壞血酸質(zhì)量濃度的增加呈現(xiàn)先增后略降的趨勢，以80 mg/L抗壞血酸處理下的比生長速率最高。

圖1 外源抗壞血酸對鎘脅迫下鼠尾藻生長的影響 圖中線上不同字母表示有顯著性差異(P<0.05).下同.

2.2 外源抗壞血酸對鎘脅迫下鼠尾藻鎘含量的影響

5.0 mg/L 鎘處理5 d 后，鼠尾藻體內(nèi)的鎘含量達到了68 μg/g，而加入20 mg/L抗壞血酸后，鼠尾藻體內(nèi)鎘含量降至52 μg/g，且隨著加入抗壞血酸質(zhì)量濃度的增大，鼠尾藻體內(nèi)鎘含量逐漸降低，當加入80 mg/L 抗壞血酸時，降至最低值37 μg/g，比單一鎘處理降低了45.59% (P<0.05)，而加入100 mg/L抗壞血酸時，藻體內(nèi)鎘含量又略有升高，為43 μg/g(圖2)。

圖2 外源抗壞血酸對鎘脅迫下鼠尾藻鎘含量的影響

2.3 外源抗壞血酸對鎘脅迫下鼠尾藻葉綠素a、類胡蘿卜素、可溶性糖和可溶性蛋白含量的影響

5.0 mg/L鎘脅迫下，鼠尾藻藻體顏色變淺，經(jīng)測定葉綠素a和類胡蘿卜素的含量與對照相比分別降低24.90%和23.43%，抗壞血酸加入后，除抗壞血酸質(zhì)量濃度為20 mg/L的試驗組類胡蘿卜素的含量略有下降外，其余均顯著升高，而且隨著加入抗壞血酸質(zhì)量濃度的增加，均呈先增后略降的趨勢，抗壞血酸質(zhì)量濃度為80 mg/L時達到峰值，葉綠素a和類胡蘿卜素的含量較單一鎘處理分別增加24.46%和15.89%(圖3a, 3b)。

可溶性糖的含量在5.0 mg/L鎘脅迫5 d時顯著升高，20 mg/L抗壞血酸加入后，變化不明顯(P>0.05)；40、60 mg/L抗壞血酸加入后，藻體可溶性糖含量顯著下降，但兩組之間差異不顯著(P>0.05)；抗壞血酸質(zhì)量濃度80、100 mg/L處理組可溶性糖的含量進一步下降，兩組之間差異不顯著(P>0.05) (圖3c)。

可溶性蛋白含量在5.0 mg/L鎘脅迫下顯著下降，僅為對照組的40.65%，而外源抗壞血酸處理顯著緩解了這種下降趨勢，可溶性蛋白的含量均顯著升高，抗壞血酸質(zhì)量濃度為20～60 mg/L的試驗組間差異不顯著(P>0.05)，抗壞血酸質(zhì)量濃度為80 mg/L的試驗組緩解作用最顯著(圖3d)。

2.4 外源抗壞血酸對鎘脅迫下鼠尾藻超氧化物歧化酶、過氧化氫酶活性和丙二醛含量的影響

鎘脅迫導致鼠尾藻超氧化物歧化酶、過氧化氫酶的活性和丙二醛含量顯著增加，外加抗壞血酸后，超氧化物歧化酶活性在抗壞血酸質(zhì)量濃度≥60 mg/L時開始顯著下降，且80 mg/L時最低(圖4a)；過氧化氫酶活性在低質(zhì)量濃度抗壞血酸(≤40 mg/L)試驗組中顯著升高，≥60 mg/L時又逐漸下降(P<0.05) (圖4b)；丙二醛含量在抗壞血酸質(zhì)量濃度為20～60 mg/L的組間沒有顯著變化，≥80 mg/L的試驗組中才顯著下降(P<0.05) (圖4c)。

圖3 外源抗壞血酸對鎘脅迫下鼠尾藻葉綠素a、類胡蘿卜素、可溶性糖、可溶性蛋白含量的影響

圖4 外源抗壞血酸對鎘脅迫下鼠尾藻抗氧化系統(tǒng)的影響

3 討 論

3.1 外源抗壞血酸對鎘脅迫下鼠尾藻生長的影響

利用生物監(jiān)測水體的重金屬污染，可用于評估海洋環(huán)境中重金屬對該地域或生物的污染狀況[17]。吳海一等[2]研究發(fā)現(xiàn)，鼠尾藻對重金屬鎘具有較強的富集能力，而且藻體積累金屬離子的量與外界環(huán)境的金屬離子質(zhì)量濃度正相關(guān)，因此可以作為一種指示生物，用于監(jiān)測海洋環(huán)境重金屬污染狀況。鎘是植物非營養(yǎng)元素，高含量下嚴重阻礙大型海藻的生長，給藻體帶來了一系列生理效應[17-20]。本試驗結(jié)果也顯示，5.0 mg/L 鎘處理下，鼠尾藻體內(nèi)鎘的含量顯著升高，藻體生長受到顯著抑制，其生物量、可溶性蛋白的含量顯著低于對照組，可溶性糖含量顯著升高，誘導組織產(chǎn)生大量的活性氧，藻體的抗氧化酶(超氧化物歧化酶和過氧化氫酶)活性升高，膜脂過氧化產(chǎn)物丙二醛大量生成。

3.2 外源抗壞血酸對鎘脅迫下鼠尾藻藻體生化特性的影響

光合生理特征的變化是衡量大型海藻生長狀況的首要指標，對光合作用的抑制也是鎘對藻體產(chǎn)生的主要毒害作用之一[18,21]。本研究發(fā)現(xiàn)，鼠尾藻在鎘脅迫下，葉綠素a和類胡蘿卜素的含量均顯著下降，這可能是色素合成系統(tǒng)對重金屬毒害的一種應激反應，也可能是色素體被破壞降解。葉綠素a是大型海藻最重要的光合色素, 因此光合作用的強弱與藻體中葉綠素a的含量息息相關(guān)，因此葉綠素a含量的降低將直接導致光合速率的下降。而類胡蘿卜素不僅作為輔助色素參與吸收傳遞光能的過程，而且是植物體內(nèi)非酶促抗氧化系統(tǒng)，能夠有效地清除活性氧，防止膜脂的過氧化，維持膜結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性，進而起到保護作用[22]。因此，推測類胡蘿卜素含量的減少不僅是合成受到了抑制，而且與其參與抗氧化反應有關(guān)。加入適當質(zhì)量濃度的抗壞血酸后，葉綠素a和類胡蘿卜素的含量均顯著增加，表明抗壞血酸可以緩解鎘對葉綠體的破壞作用，有助于提高葉綠體結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性，對光合色素具有保護效應，從而維持藻體的光合能力。

可溶性蛋白和可溶性糖是植物體內(nèi)重要的基礎(chǔ)物質(zhì)，在植物體的各種生理活動和功能中起著重要作用，其含量的變化是衡量植物代謝水平的重要指標[23]。本研究中，鎘脅迫下，鼠尾藻可溶性蛋白的含量較對照顯著減少，而可溶性糖大量累積，說明鼠尾藻對鎘有一定的耐受性，在一定范圍內(nèi)可以通過主動積累可溶性糖來降低鎘的毒害，但該質(zhì)量濃度下卻影響了蛋白質(zhì)的合成，或者重金屬與巰基結(jié)合而導致蛋白質(zhì)變性失活。而加入適當質(zhì)量濃度的抗壞血酸后，可溶性蛋白的含量有所回升，可溶性糖含量上升的幅度有所減弱，這也從另一個角度說明適宜質(zhì)量濃度的外源抗壞血酸在一定程度上減輕了鎘對鼠尾藻藻體的脅迫強度。

3.3 外源抗壞血酸對鎘脅迫下鼠尾藻抗氧化系統(tǒng)的影響

植物在逆境下，細胞內(nèi)會產(chǎn)生大量的活性氧，進而通過提高相關(guān)抗氧化酶的活性來清除過多的活性氧，從而使植物細胞免受毒害[24]。超氧化物歧化酶是植物抗氧化的第一道防線，對于清除活性氧具有重要的作用[25]。而過氧化氫酶的主要功能是清除細胞質(zhì)中產(chǎn)生的過氧化氫,從而有效防止過氧化氫在植物體內(nèi)的積累。超氧化物歧化酶和過氧化氫酶協(xié)同作用, 可排除這些氧化產(chǎn)物對植物細胞膜結(jié)構(gòu)的潛在傷害。5.0 mg/L 鎘脅迫下，藻體超氧化物歧化酶和過氧化氫酶活性顯著升高，以抵抗藻細胞內(nèi)產(chǎn)生的過多氧自由基，進而適應逆境。而加入一定質(zhì)量濃度抗壞血酸(≤40 mg/L)后，藻體超氧化物歧化酶和過氧化氫酶的活性仍維持在較高的水平，加入抗壞血酸的質(zhì)量濃度≥60 mg/L時，超氧化物歧化酶和過氧化氫酶的活性有所下降，原因可能是適宜含量的抗壞血酸緩解了藻體的脅迫，使藻細胞內(nèi)產(chǎn)生的氧自由基減少，進而誘導產(chǎn)生的超氧化物歧化酶和過氧化氫酶減少。另一方面，抗壞血酸也是一種抗氧化劑，可直接同活性氧反應, 將其還原或者作為酶的底物在活性氧清除中發(fā)揮重要作用[26]。

Singh等[27]研究指出，植物細胞膜是重金屬毒害作用的主要位點，即發(fā)生膜脂過氧化。丙二醛是發(fā)生膜脂過氧化的產(chǎn)物之一，其含量的高低可用于衡量植物細胞膜脂過氧化程度和對逆境條件耐受的強弱[28-29]。本試驗中，鼠尾藻在鎘脅迫下，由于藻體內(nèi)的自由基累積量增加, 直接導致了膜脂過氧化, 從而使膜脂過氧化產(chǎn)物丙二醛含量也隨之增加，說明此質(zhì)量濃度鎘對鼠尾藻造成明顯的氧化損傷。隨著適當質(zhì)量濃度抗壞血酸的加入，鼠尾藻對鎘的吸收顯著降低，同時藻體內(nèi)抗氧化酶的活性升高(圖4)，因此抑制了脂質(zhì)過氧化和膜系統(tǒng)傷害程度, 從而降低了丙二醛的含量，這與在一些高等植物上的研究結(jié)果是一致的[30-31]。

4 結(jié) 論

綜上所述，加入適當質(zhì)量濃度的抗壞血酸使5.0 mg/L 鎘脅迫下鼠尾藻的比生長速率增加，體內(nèi)富集鎘的含量顯著降低，提高了葉綠素a、類胡蘿卜素及可溶性蛋白的含量和抗氧化酶(超氧化物歧化酶和過氧化氫酶)活性，同時降低細胞內(nèi)可溶性糖大量累積和膜脂過氧化產(chǎn)物丙二醛的含量，能在一定程度上緩解重金屬鎘脅迫對藻體的毒害，從而增強了鼠尾藻對重金屬鎘脅迫的耐受性，且以80 mg/L 抗壞血酸的緩解效果最好。