強(qiáng)筋祛濕液藥效學(xué)研究

鄭立肯 葉世蕓 殷少文 孫濟(jì)平 王維

【摘 要】目的：研究院內(nèi)制劑強(qiáng)筋祛濕液藥效與安全性，以期為保證其臨床應(yīng)用安全與闡明藥效提供科學(xué)依據(jù)。方法：最大給藥量法考察強(qiáng)筋祛濕液家兔皮膚涂抹急性毒性;建立二甲苯致小鼠急性耳腫脹、角叉菜膠致大鼠足跖腫脹模型與佐劑性關(guān)節(jié)炎大鼠模型，觀察強(qiáng)筋祛濕液對實(shí)驗(yàn)動(dòng)物炎癥反應(yīng)的抑制作用;采用熱板法觀察強(qiáng)筋祛濕液對小鼠熱板疼痛反應(yīng)的影響。結(jié)果：急性毒性試驗(yàn)結(jié)果表明強(qiáng)筋祛濕液1日內(nèi)最大給藥量給藥未見由藥物引起的毒性反應(yīng);藥效學(xué)表明強(qiáng)筋祛濕液對二甲苯所致小鼠耳腫脹、角叉菜膠致大鼠足跖腫脹與佐劑致大鼠關(guān)節(jié)炎的炎癥反應(yīng)具有顯著的抑制作用（P<0.05），顯著下調(diào)佐劑性關(guān)節(jié)炎大鼠血清中IL-6和TNF -α的水平（P<0.05），對熱板所致的非特異性疼痛具有一定抑制作用（P<0.05）。結(jié)論：強(qiáng)筋祛濕液安全性較好，具有明顯的抗炎和鎮(zhèn)痛作用，可減輕滑膜增生、脂肪組織和滑膜上皮細(xì)胞增生、減少多種炎細(xì)胞浸潤等多種病理學(xué)改變，且該作用與藥物調(diào)節(jié)血清中IL-6和TNF-α水平有關(guān)。

【關(guān)鍵詞】強(qiáng)筋祛濕液;急性毒性;抗炎;鎮(zhèn)痛;藥效學(xué)

【中圖分類號】R285.5【文獻(xiàn)標(biāo)志碼】A【文章編號】1007-8517（2019）20-0026-06

Abstract：Objective To provide a scientific basis for ensuring the safety of clinical application and elucidating the efficacy of Qiangjin Qushi liquid.Methods Study on acute toxicity of skin smear on rabbits with Qiangjin Qushi liquid by maximum dose method; The acute ear swelling in mice induced by xylene， paw swelling in rats induced by carrageenan and adjuvant arthritis in rats were established to observe the inhibitory effect of Qiangjin Qushi liquid on inflammatory reaction in experimental animals; and the effect of Qiangjin Qushi liquid on hot plate pain response in mice was observed by hot plate method.Results The acute toxicity test showed that the maximum dose of Qiangjin Qushi liquid in one day had no toxic reaction caused by drugs. Pharmacodynamics showed that Qiangjin Qushi liquid had significant inhibitory effects on xylene-induced ear swelling in mice， carrageenan-induced paw swelling in rats and adjuvant-induced arthritis in rats （P< 0.05）， and significantly decreased the serum level of adjuvant-induced arthritis in rats. The levels of IL-6 and TNF-alpha （P< 0.05） inhibited the non-specific pain induced by hot plate （P< 0.05）.Conclusion Qiangjin Qushi liquid is safe and has good anti-inflammatory and analgesic effects. It can alleviate many pathological changes such as synovial hyperplasia， adipose tissue and synovial epithelial cell proliferation， and reduce a variety of inflammatory cell infiltration. This effect is related to the drug regulation of serum levels of IL-6 and TNF-α.

Keywords：Qiangjin Qushi liquid;Acute toxicity; Anti-inflammatory; Analgesia;Pharmacodynamics

痹者，閉也?！端貑枴け宰C》中記載：“風(fēng)寒濕三氣雜至，合而為痹也”[1]，早在《黃帝內(nèi)經(jīng)》中就有收錄運(yùn)用“醪酒”治療痹證[2]。中醫(yī)理論下由邪氣侵犯人體肌表經(jīng)絡(luò)引起的痛痹、行痹、著（濕）痹等合稱為“痹證”，以筋骨肌肉酸脹疼痛、麻痹、沉重甚至關(guān)節(jié)腫脹變形等為主要臨床表現(xiàn)?，F(xiàn)代醫(yī)學(xué)中所認(rèn)為的慢性自身免疫性疾病，如風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎、類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎、風(fēng)濕多肌痛、風(fēng)濕熱、神經(jīng)痛等關(guān)節(jié)炎癥與疾病均屬于“痹證”范疇[3]。常規(guī)治療風(fēng)濕病癥的藥物有非甾體消炎止痛藥、糖皮質(zhì)激素、改善風(fēng)濕病情藥物（DMARDs）和α腫瘤壞死因子（TNF-α）抑制劑等新型生物制劑[4-5]，除單用常規(guī)合成藥外，亦采用csDMARD三聯(lián)療法（向甲氨蝶呤中加入羥氯喹和柳氮磺胺吡啶）、MTX-TNFi（甲氨蝶呤加入腫瘤壞死因子α抑制劑）聯(lián)合治療[6]，上述藥物除易產(chǎn)生藥物依賴性外亦可能引起心血管疾病、骨質(zhì)疏松以及高血壓等不良反應(yīng)[7-8]。中醫(yī)治療痹證常辨明風(fēng)寒濕熱，疾病新久，區(qū)分標(biāo)本虛實(shí)方進(jìn)行扶正、祛邪、通絡(luò)等治療[9]，以補(bǔ)虛藥、祛風(fēng)濕藥、解表藥、活血化瘀藥等相互配伍使用[10]，配合針灸、敷貼等外治法[11]或同生物制劑聯(lián)合使用，綜合治療達(dá)到良好的治療效果。

強(qiáng)筋祛濕液為貴州中醫(yī)藥大學(xué)孫濟(jì)平教授的經(jīng)驗(yàn)方，該方中含有防己、川牛膝、尋骨風(fēng)等三十余味藥材，以祛風(fēng)除濕、活血化瘀為主要功效，臨床上常用于治療風(fēng)濕關(guān)節(jié)痛、關(guān)節(jié)腫脹，皮下?lián)p傷瘀血，皮膚擦傷潰破等。在前期研究基礎(chǔ)上，已初步建立強(qiáng)筋祛濕液質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，現(xiàn)從強(qiáng)筋祛濕液對抗炎、消腫、鎮(zhèn)痛方面進(jìn)行主要藥效學(xué)與急性給藥毒性研究，以期為強(qiáng)筋祛濕液臨床應(yīng)用提供依據(jù)，并為后續(xù)深入研究奠定基礎(chǔ)。

1 儀器與材料

1.1 試劑與藥品 二甲苯（批號：20140908，重慶茂業(yè)化學(xué)試劑有限公司）;2，4-二硝基氯苯（批號：T20150905，西亞試劑）;完全弗氏佐劑（批號：F58810nl;USA）;強(qiáng)筋祛濕液（批號：20150501，貴州中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)中心）;消腫止痛酊（批號：20150302，廣西壯族自治區(qū)花紅藥業(yè)股份有限公司）。

1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 KM小鼠，SPF級，體重18～22 g，雌性，購于長沙天勤生物技術(shù)有限公司，許可證號：SCXK（湘）2014-0011;SD大鼠，SPF級，體重180～220g，雄性，購于長沙市天勤生物技術(shù)有限公司提供，許可證號：SCXK（湘）2014-0011;家兔，Ⅰ級實(shí)驗(yàn)動(dòng)物，體重2.1～2.5kg，雌雄各半，購于貴州醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，許可證號：SCXK（黔）2012-0001。

1.3 儀器 MNT50游標(biāo)卡尺（上海美耐特實(shí)業(yè)有限公司）;AB204-S分析天平（上海）;YLS-3E電子壓痛儀（濟(jì)南益延科技發(fā)展有限公司）;CT10R離心機(jī)（上海天美科學(xué)儀器有限公司）。

2 方法[2]

2.1 強(qiáng)筋祛濕液皮膚給藥急性毒性試驗(yàn) 取健康家兔18只，雌雄各半，隨機(jī)分為3組，即空白組、溶媒組、強(qiáng)筋祛濕液組，每組6只。以背脊為中線脫除背部脊柱兩側(cè)毛，約160cm2（10cm×16cm），溫水擦洗，24h后檢查脫毛區(qū)域皮膚無損傷。各組受試家兔均按1.34g·kg-1皮膚涂抹給藥，24h后溫水洗去受試物，局部觀察家兔毒副反應(yīng)情況。如試驗(yàn)中出現(xiàn)死亡的家兔需進(jìn)行解剖，記錄組織的顏色和體積改變等。

2.2 對二甲苯致急性耳腫脹小鼠模型消腫作用 健康小鼠隨機(jī)分為6組，每組12只：空白組、溶媒組、消腫止痛酊組、強(qiáng)筋祛濕液組（強(qiáng)筋祛濕液低、中、高劑量組給藥劑量按人體等效給藥量的5、10、20倍計(jì)算）?？瞻捉M給予生理鹽水10mL/kg、溶媒組給予同體積的溶劑，給藥組分別給予消腫止痛酊0.65g/kg、強(qiáng)筋祛濕液高、中、低劑量1.86，0.93，0.47g/kg涂于小鼠右耳廓0.2mL，每次間隔12h，連續(xù)給藥14d，于末次給藥后30min，每鼠右耳廓涂二甲苯0.1mL;1h后頸椎脫臼處死小鼠，打孔器取下左耳和右耳同一部位的圓片，稱重，計(jì)算耳廓腫脹度。公式如下：

腫脹度（mg）= 右耳片重-左耳片重

2.3 對角叉菜膠致足跖腫脹大鼠模型消腫作用 取SD大鼠60只，雄性，按體重隨機(jī)分為6組，即空白組、溶媒組、消腫止痛酊組、強(qiáng)筋祛濕液組（強(qiáng)筋祛濕液低、中、高劑量組給藥劑量按人體等效給藥量的3.5、7、14倍計(jì)算），每組10只?？瞻捉M給予同體積生理鹽水，給藥組分別給予消腫止痛酊0.46g/kg、強(qiáng)筋祛濕液高、中、低劑量1.30，0.65，0.33g/kg涂于右后足跖，每次給藥間隔12h，連續(xù)給藥14d。末次給藥后0.5h分別于大鼠右后足跖皮內(nèi)注射1%角叉菜膠混懸液0.1mL/只致炎;末次給藥前和給藥后2、3、4、5、6、8h分別用游標(biāo)卡尺測右后足跖厚度，計(jì)算足跖腫脹率。

2.4 對佐劑性關(guān)節(jié)炎大鼠模型消炎作用 取SD大鼠70只，雄性，180～220g，按體重隨機(jī)分為7組：空白組、模型組、溶媒組、消腫止痛酊組、強(qiáng)筋祛濕液低、中、高劑量組，游標(biāo)卡尺測定右后足跖厚度?？瞻捉M右后足跖皮內(nèi)注射生理鹽水10mL/kg，其余6組右后足跖皮內(nèi)注射完全弗氏佐劑0.1mL致炎。次日，空白組和模型組于生理鹽水涂抹于足跖，溶媒組涂抹同體積的高粱酒，其余4組分別給消腫止痛酊0.46g/kg、強(qiáng)筋祛濕液高、中、低劑量1.3，0.65，0.33g/kg，藥液涂于右側(cè)足跖。每天間隔12h，連續(xù)給藥13d。

觀察指標(biāo)：測量致炎第1天、第7天和第13天右后足跖腫脹度和壓痛值。給藥第14天，取股動(dòng)脈取血5mL，3000r/min離心15min，離心后取血清-20℃冷藏，采用IL-6和TNF-α定量酶聯(lián)檢測放射免疫試劑盒檢測血清中白介素-6（IL-6）和腫瘤壞死因子（TNF -α）炎癥因子;取關(guān)節(jié)滑膜HE染色病理檢測。

2.5 對小鼠熱板疼痛反應(yīng)的影響 每次取1只18～22g雌性小鼠放在已預(yù)熱10min（55±0.5 ℃）的熱板上，自放在熱板上至出現(xiàn)舔后足所需時(shí)間（秒）作該鼠的痛閾值。選擇痛閾值范圍為5～30s的小鼠。將合格小鼠隨機(jī)分為6組，每組12只分為：空白組、溶媒組、消腫止痛酊組、強(qiáng)筋祛濕液低、中、高劑量組（強(qiáng)筋祛濕液低、中、高劑量組給藥劑量按人體等效給藥量的5倍、10倍、20倍計(jì)算），分別給生理鹽水10mL/kg、高粱酒10mL/kg、消腫止痛酊0.65g/kg、強(qiáng)筋祛濕液高、中、低劑量1.86、0.93、0.47g/kg藥液涂于雙后足跖，每次給藥間隔12h，連續(xù)給藥14d。末次給藥后2h 用熱板法測痛閾值，計(jì)算痛閾變化率;在測試中如60s仍無反應(yīng)，將小鼠取出，以免燙傷，其痛閾值以60s計(jì)算。

2.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 使用SPSS軟件22.0版本進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計(jì)量資料以（x±s）表示，組間均數(shù)比較用t檢驗(yàn)，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。

3 結(jié)果

3.1 強(qiáng)筋祛濕液皮膚給藥急性毒性試驗(yàn) 由表1、2可知，給藥后觀察14d，期間動(dòng)物未出現(xiàn)中毒及死亡，用溫水洗去皮膚上的受試物，未觀察到皮膚紅斑、水腫等反應(yīng)。給藥期間動(dòng)物體重均有增長，給藥組、溶媒組與空白組統(tǒng)計(jì)無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P<0.05）。

3.2 對二甲苯至急性耳腫脹小鼠模型消腫作用 致炎后，各組小鼠右耳高度紅腫。與空白組比較，消腫止痛酊組與強(qiáng)筋祛濕液低、中、高劑量組給藥后腫脹度顯著低于空白組，而溶媒組無明顯差異。表明強(qiáng)筋祛濕液對二甲苯致小鼠耳廓腫脹具有抑制作用，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。見表3。

3.3 對角叉菜膠致足跖腫脹大鼠模型消腫作用 由表4可知，同空白組比較，注射角叉菜膠后測量所有組別大鼠足趾腫脹率減弱，同時(shí)消腫止痛酊組、強(qiáng)筋祛濕液各劑量組大鼠足趾腫與空白組比較有明顯差異。表明強(qiáng)筋祛濕液對角叉菜膠致大鼠的足趾腫脹具有抑制作用。

3.4 對佐劑性關(guān)節(jié)炎大鼠模型消炎作用 由表5可知，在連續(xù)給藥7d至13d后，消腫止痛酊組與強(qiáng)筋祛濕液藥酒的高、中、低劑量組在致炎后大鼠的足趾腫脹度減弱，與模型組比較有明顯差異。繼續(xù)給藥至第13天后，陽性對照藥物消腫止痛酊與強(qiáng)筋祛濕液的低、中、高劑量組在致炎后大鼠的足趾壓痛值提高，并存在統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P<0.05），而溶媒組仍無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P>0.05），說明強(qiáng)筋祛濕液可有效減輕炎癥同時(shí)消腫止痛。由圖1可知，造模14 d佐劑性關(guān)節(jié)炎模型組大鼠血清中TNF -α、IL-6的濃度顯著性增加，消腫止痛酊組和強(qiáng)筋祛濕液組可顯著性降低TNF -α、IL-6的濃度。

由圖2可知，處死實(shí)驗(yàn)大鼠，取右后肢關(guān)節(jié)滑膜固定于10%的甲醛溶液中，脫鈣后常規(guī)石蠟包埋，切片并HE染色后，空白組滑膜上皮細(xì)胞形態(tài)正常，呈單層排列，滑膜細(xì)胞無水腫;模型組滑膜上皮細(xì)胞嚴(yán)重增生，滑膜細(xì)胞水腫明顯，大量炎性細(xì)胞浸潤;消腫止痛酊組滑膜上皮細(xì)胞輕微增生，滑膜細(xì)胞水腫不明顯;強(qiáng)筋祛濕液組滑膜上皮細(xì)胞少量增生，滑膜下見少量炎性細(xì)胞浸潤，滑膜細(xì)胞輕度水腫。表明強(qiáng)筋祛濕液對佐劑致大鼠關(guān)節(jié)炎病變有明顯改善作用。

3.5 對小鼠熱板疼痛反應(yīng)的影響 由圖3可知，在不同時(shí)間內(nèi)的痛域值有顯著性差異，各個(gè)藥物組之間的痛域值差異有顯著性意義。與空白對照組相比較，消腫止痛酊組、強(qiáng)筋祛濕液低、中、高劑量組的痛域值呈現(xiàn)上升趨勢，在第14天時(shí)，痛域值具有顯著性差異，表明強(qiáng)筋祛濕液對熱板所致的非特異性疼痛具有一定抑制作用。

4 討論

強(qiáng)筋祛濕液由防己、川牛膝、杜仲、紅花等35味中藥制備而成，主藥防己稱為“祛風(fēng)濕要藥”，有效成分粉防己堿用于治療水腫、風(fēng)濕性疾病和炎性疾病[13]，研究表明粉防己堿可通過抑制NF-κB/ COX-2通路有效降低RA大鼠血清中TNF-α，IL-1β和IL-6的濃度[14-15]，通過依賴芳烴受體（AhR）相互調(diào)節(jié)STAT3和STAT5活性[16]以恢復(fù)Th17/ Treg平衡發(fā)揮其抗關(guān)節(jié)炎功效[17]。川牛膝甾酮類化合物、杜仲提取物等亦可減少促炎細(xì)胞因子與環(huán)氧合酶-2的分泌，改善軟骨代謝保護(hù)關(guān)節(jié)軟骨[18-20]。因此，實(shí)驗(yàn)以足跖腫脹度、TNF -α、IL-6以及痛閾值為指標(biāo)，對強(qiáng)筋祛濕液鎮(zhèn)痛抗炎活性進(jìn)行評價(jià)，為其臨床用藥的有效性提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

本實(shí)驗(yàn)急性毒性試驗(yàn)顯示，家兔給予強(qiáng)筋祛濕液后未出現(xiàn)皮膚紅斑、水腫等反應(yīng)，提示強(qiáng)筋祛濕液安全性良好;從抗炎、鎮(zhèn)痛以及對大鼠佐劑關(guān)節(jié)炎模型等方面評價(jià)了強(qiáng)筋祛濕液的藥理作用，結(jié)果表明其可有效抑制炎癥并增加受試動(dòng)物痛閾值。強(qiáng)筋祛濕液對二甲苯致小鼠耳廓腫脹、對角叉菜膠致大鼠足跖腫脹具有不同程度的抑制作用，給藥后3 h高劑量組大鼠足趾腫脹率減弱，同空白組比較出現(xiàn)明顯差異，表明強(qiáng)筋祛濕液具有抗炎作用。給藥組在不同時(shí)間內(nèi)痛域值呈現(xiàn)上升趨勢，表明強(qiáng)筋祛濕液對熱板所致的非特異性疼痛具有一定抑制作用。同時(shí)，強(qiáng)筋祛濕液可顯著性降低佐劑性關(guān)節(jié)炎模型組大鼠血清中IL-6和TNF–α的濃度與水平，提示強(qiáng)筋祛濕液抗類風(fēng)濕的機(jī)理或與調(diào)節(jié)炎性細(xì)胞因子有關(guān)。各組大鼠關(guān)節(jié)滑膜經(jīng)HE染色后結(jié)果表明強(qiáng)筋祛濕液對佐劑致大鼠關(guān)節(jié)炎病變有明顯改善作用。

綜上所述，強(qiáng)筋祛濕液對完全佐劑、對角叉菜膠所導(dǎo)致足趾腫脹度與二甲苯致小鼠耳廓腫脹具有極顯著的抑制作用，急性毒性試驗(yàn)結(jié)果顯示安全性較好，且對皮膚無明顯皮膚過敏反應(yīng)，可顯著下調(diào)佐劑關(guān)節(jié)炎模型血清中炎性細(xì)胞因子水平，顯著提高痛閾值。故強(qiáng)筋祛濕液對于痹證有良好的作用效果，作為院內(nèi)制劑具有良好的開發(fā)價(jià)值和應(yīng)用前景。

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（收稿日期：2019-07-20 編輯：陶希睿）