失荅剌知丸及其拆方對腦缺血再灌注大鼠海馬區(qū)JNK蛋白表達的影響

王娜琳 賈孟輝 左艷麗 馮佳婷 馬玉瑋

【摘 要】目的：探討失荅刺知丸及拆方對腦缺血再灌注模型大鼠腦組織JNK表達的影響。方法：將204只SD雄性大鼠按隨機數(shù)字表法分為正常組、假手術組、模型組及干預組（包括失荅剌知丸組，失荅剌知丸拆方Ⅰ組、拆方Ⅱ組、拆方Ⅲ組），其中模型組及各干預組按時間點不同分為1d組、3d組和7d組，并予MACO線栓法制備腦缺血再灌注大鼠模型，同時干預組于每日固定時間灌胃，同時觀察大鼠神經(jīng)功能癥狀情況，以大鼠神經(jīng)功能Garcia JH評分并記錄，治療后于相應時間取材。運用Western Blot法檢測海馬組織中p-JNK蛋白的含量，以p-JNK/GAPDH表示蛋白表達相對水平。結果：失荅剌知丸及各拆方組中的p-JNK蛋白表達量均有降低，且與灌藥時間成正比（P<0.05）;失荅剌知丸原方較各拆方組蛋白表達均低，其中拆方Ⅰ組最高，拆方Ⅱ組最低，拆方Ⅲ組次之（P<0.05）。神經(jīng)功能評分結論與p-JNK蛋白表達結果一致。結論：失荅剌知丸原方及各拆方組均具有改善腦缺血后神經(jīng)功能、抗神經(jīng)細胞凋亡作用，而這可能與本實驗所研究的JNK蛋白下調有關;其中，除原方外，又以拆方Ⅱ組作用效果最好，考慮該組可能在失荅剌知丸原方中發(fā)揮君藥、或君藥加臣藥的主要作用。

【關鍵詞】失荅剌知丸;拆方研究;JNK;神經(jīng)功能評分

【中圖分類號】R29【文獻標志碼】A【文章編號】1007-8517（2019）20-0019-04

Abstract：Objective To investigate the effects of the Shidalazhiwan and its dismantling prescriptions on the expression of JNK in the brain tissue of rats with cerebral ischemia-reperfusion.Methods 204 male Sprague-Dawley rats were randomly divided into normal group， sham operation group， model group and intervention group （including the Shidalazhiwan group， the Dismantling prescription group I， the Dismantling prescription group II， the Dismantling prescription group III）， in which the model group and the intervention group were divided into 1d group， 3d group and 7d group according to the time point， and the rat model of cerebral ischemia-reperfusion was prepared by MACO suture method， and the intervention group was fixed daily. At the same time， the neurological symptoms of the rats were observed， and the neurological function Garcia JH score will be scored and recorded. After the treatment， the materials were taken at the corresponding time.The content of p-JNK protein in hippocampus was detected by Western Blot， and the relative level of protein expression was expressed by p-JNK/GAPDH.Results The expression levels of p-JNK protein in the Shidalazhiwan and the disassembled prescription groups were all decreased， and it was proportional to the time of drug injection （P<0.05）.The original expression of Shidalazhiwan was lower than that of the disassembled prescriptions. The disassembled group I was the highest， the disassembled group II was the lowest， and the disassembled group III was the second （P<0.05）. The neurological function score was consistent with the p-JNK protein expression.Conclusion The original Shidalazhiwan and the disintegration prescriptions have the effects of improving neurological function and anti-neuronal apoptosis after cerebral ischemia， which may be related to the down-regulation of JNK protein studied in this experiment. The effect of dismantling prescription II is the best. Considering that this group may play the main role of the drug in the original prescription of the sputum， or the drug of the genus.

Keywords：Shidalazhiwan，Dismantling prescriptions research，JNK，Neurological function score

腦缺血再灌注損傷（Cerebral ischemia-reperfusion injury，CIRI）是指腦組織缺血性卒中發(fā)生時經(jīng)過機械或化學治療后，腦血管血流重建而引起的損傷[1]，其損傷的主要形式是神經(jīng)細胞的凋亡，臨床以神經(jīng)功能損傷為主要癥狀。JNK即應激活化蛋白激酶（stress activated kinase，SAPK），是MAPK家族的主要成員之一[2]。研究表明，JNK信號通路與細胞凋亡過程密切相關[3]，其可促進大鼠腦缺血再灌注海馬區(qū)神經(jīng)元的凋亡[4]。本課題組前期研究已證實，失荅剌知丸可改善CIRI大鼠神經(jīng)功能損傷癥狀，促進神經(jīng)干細胞增殖，抑制神經(jīng)細胞凋亡[5-7]。腦缺血再灌注模型是最接近人類腦梗死的理想大腦中動脈缺血（middle cerebral artery occlusion，MCAO）再灌注模型[8]。因此，本實驗通過對失荅剌知丸及其拆方對腦缺血再灌注模型大鼠JNK信號通路的影響觀察，以進一步探討失荅剌知丸原方組成及各部分不同效果。

1 材料與方法

1.1 動物與分組 本實驗動物由寧夏醫(yī)科大學動物實驗中心提供，實驗動物合格證號：SCXK（寧）2015-0001。用SPF級體重為（230±20）g的SD雄性大鼠102只。大鼠適應飼養(yǎng)7 d后，按隨機數(shù)字表法分為假手術組（A組，6只），正常組（B組，6只），模型組（D組，18只），干預組：包括失荅剌知丸組（E組，18只）、拆方Ⅰ組（C組，18只）、拆方Ⅱ組（F組，18只）、拆方Ⅲ組（G組，18只）。模型及各干預組按時間點不同又分別分為1 d、3 d、7 d組。

1.2 藥物 失荅剌知丸：柴胡31g，黑訶子31g，撒額冰（阿魏）9g，蘆薈62g，白芥子9g，失荅剌知（血根草）6g，沙哈木罕荅里（藥西瓜）9g，胡椒3g，安息香9g，巴豆霜9g，菖蒲6g，番鹽6g，阿里公（松蕈）9g，干姜9g，蓽撥9g，蕓香9g（《回回藥方》原配方比例折算成公制克，藥物劑量換算依據(jù)：一兩約等于16.5克）。

拆方Ⅰ組：巴豆霜9g;拆方Ⅱ組：巴豆霜9g，柴胡31g，黑訶子31g，蘆薈62g;拆方Ⅲ組：巴豆霜9g，撒額冰（阿魏）9g，白芥子9g，失荅剌知（血根草）6g，沙哈木罕荅里（藥西瓜）9g，胡椒3g，安息香9g，菖蒲6g，番鹽6g，阿里公（松蕈）9g，干姜9g，蓽撥9g，蕓香9g。

藥物由寧夏醫(yī)科大學第二附屬醫(yī)院藥劑科提供，上各方按傳統(tǒng)煎煮法煎煮并濃縮，濃縮藥物濃度為4.5g/mL。

1.3 造模 模型組及各干預組采用改良的Longa造模法[9]，即線栓法制備大鼠左側中動脈供血不足的腦缺血再灌注（MACO）模型。造模方法：術前禁食12h，予水合氯醛腹腔注射麻醉，大鼠取仰臥位，固定四肢及頭部，備皮暴露頸部皮膚并消毒，沿頸中線開一約2cm開口，鈍性分離大鼠左側頸總動脈、頸外動脈及頸內動脈，將消毒好的線栓插入5mL注射器針頭，線栓鈍圓頭漏于注射器針尖外部，沿頸外動脈靠近三者分叉處向頸總方向插入約5mm，借助注射器針頭繼續(xù)將線栓插入頸總后拔出注射器針頭，將線栓輕輕緩慢退出至分叉處后插入頸內動脈，插入深度約16～18mm，用縫合線將線栓固定，縫皮，2h后打開縫合線，拔線栓至有阻力時停止，剪去線栓，縫合黏膜及皮膚，消毒。期間均使大鼠位于干凈溫暖的籠盒中，待大鼠清醒后單獨飼養(yǎng)觀察。

1.4 干預治療 各干預組藥物根據(jù)大鼠體表面積劑量換算公式[10]計算給藥量為4.5g/mL，給藥劑量為1mL/100g、2次/d。剩余各對照組（正常組、假手術組、模型組）均以生理鹽水灌胃，灌胃劑量同藥物劑量即1mL/100g、2次/d。

1.5 取材方法 各干預組及模型組取材時間依據(jù)各不同時間點進行，正常組及假手術組于灌胃7 d后取材。以水合氯醛腹腔麻醉法進行大鼠麻醉后斷頭處死，快速取出腦組織，并于冰上迅速剝離海馬保存于-80℃冰箱中。

1.6 指標檢測方法

1.6.1 神經(jīng)功能評分 取材前進行大鼠神經(jīng)功能評分并記錄，評分采用Garcia JH評分[11]，通過評估各組大鼠自主運動情況、體態(tài)的對稱性、前肢伸展運動、網(wǎng)屏實驗、兩側身體觸覺反射及兩側胡須觸覺反射情況，評分統(tǒng)計，評分區(qū)間為0-18分。

1.6.2 Western Blot檢測蛋白表達水平 實驗按照WB檢測方法進行操作，用ImagaJ軟件分析灰度值，以目的蛋白/內參即p-JNK/GADPH灰度值的比值表示蛋白表達水平。

1.7 統(tǒng)計學方法 采用SPSS21.0進行數(shù)據(jù)整理分析，各組數(shù)據(jù)先進行正態(tài)分布檢驗及方差齊性的檢驗，其中，符合正太分布及方差齊的，組間比較采用單因素方差分析，不符合的進行數(shù)據(jù)轉換后分析;多組間比較則采用LSD法進行量量比較。P<0.05為差異具有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 各組大鼠神經(jīng)功能Garcia JH評分 如表1所示，正常組與假手術組同期比較差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05）。與正常組及假手術組比較，模型組及各干預組評分均低于空白組及假手術組（P<0.05）。與灌胃1d組比較，模型組及各干預組灌胃3d、7d組評分均明顯增加（P<0.05）。與灌胃3d組比較，模型組及各干預組灌胃7d時評分均明顯增加（P<0.05）。與模型組同期比較，各干預組評分均高于模型組（P<0.05）。與失荅剌知丸組同期比較各拆方組評分均低于失荅剌知丸組（P<0.05）。與拆方Ⅰ組同期比較，拆方Ⅱ、Ⅲ組評分均高于拆方Ⅰ組（P<0.05）。與拆方Ⅱ組同期比較，拆方Ⅲ組評分低于拆方Ⅱ組（P<0.05）。

2.2 Western Blot檢測結果 如圖1、圖2所示，各組方差齊性概率均>0.05，認為方差齊。其表達結果顯示如下：假手術組與正常組表達比較差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05）。與假手術組及正常組同期比較，模型及各干預組蛋白表達均高于假手術組及正常組（P<0.05）。與灌胃1d組比較，模型組及各干預組3、7d時p-JNK蛋白表達均有降低（P<0.05）。與灌胃3d組比較，模型組及各干預組灌胃7d時p-JNK蛋白表達均有明顯降低（P<0.05）。與模型組同期比較，各干預組p-JNK蛋白表達均低于模型組（P<0.05）。與失荅剌知丸組同期比較，各拆方組蛋白表達均高于失荅剌知丸組（P<0.05）。與拆方Ⅰ組比較，拆方Ⅱ、Ⅲ組p-JNK蛋白表達均低于拆方Ⅰ組（P<0.05）。與拆方Ⅱ組比較，拆方Ⅲp-JNK蛋白表達高于拆方Ⅱ組（P<0.05）。

3 討論

缺血性卒中的病理基礎以腦血流動力學的改變?yōu)橹?，隨著年齡的增長以及各種老年病和血管疾病的發(fā)生，顱內外動脈變構[12]，血栓形成和栓子脫落的風險增加，從而導致了本病的發(fā)生。本病致殘率極高，以神經(jīng)功能缺損為主要表現(xiàn)[13]。本病治療的關鍵是腦缺血后腦血流的恢復，但再灌注往往可加重腦缺血組織的損傷[14]，神經(jīng)細胞缺血再灌注損傷導致JNK激活[15]，JNK通路對凋亡的調節(jié)至關重要[16]。JNK蛋白激酶有3個基因10種亞型，抑制其活化可降低腦組織的損傷[17]。失荅剌知丸出自《回回藥方》殘卷十二“眾風門”篇，原方載“能開纏腸肚風病，最通經(jīng)絡”[18]，可知其以治療腦中風經(jīng)絡不通所致口眼喎斜、半身不遂等癥。且前期課題組研究已知該方高劑量組用于治療缺血性中風時效果優(yōu)于尼莫地平[5-7]，對其進一步的研究應用更值得探索。觀察原方組成知其以化痰通絡、芳香利濕為主，但因其藥方中有多味不常用藥，且其中巴豆、蘆薈等用量較大，臨床應用多有顧忌，故研究其組方特點進行本實驗。

本實驗研究結果表明，失荅剌知丸可明顯降低大鼠腦損傷癥狀，改善大鼠神經(jīng)功能，下調JNK蛋白表達，減低凋亡發(fā)生。其各拆方組中，以拆方Ⅱ組（即巴豆霜、柴胡、黑訶子、蘆薈）表達結果最具優(yōu)勢，考慮該組藥物可能為失荅剌知丸發(fā)揮治療作用的主要藥物組成，以君臣佐使配伍理論探討該方組成，考慮該四味藥物可能是該方的君藥或君臣藥。后期可對失荅剌知丸進一步探索，以探討其治療機制及組方原則。

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（收稿日期：2019-08-28 編輯：劉斌）