博來霉素和內(nèi)毒素誘導(dǎo)兩種品系小鼠肺纖維化模型的比較研究*

何文涓 吳小瑜 袁志堅 黃 寅

(無錫衛(wèi)生高等職業(yè)技術(shù)學(xué)校，無錫 214028)

特發(fā)性肺纖維化(Idiopathic pulmonary fibrosis，IPF)是一種原因不明的慢性間質(zhì)性肺疾病[1-2]。其病理特征主要為彌漫性肺泡炎、成纖維細(xì)胞病理性增長和細(xì)胞外基質(zhì)在肺間質(zhì)及肺泡腔沉積等，造成肺組織結(jié)構(gòu)的破壞，最終導(dǎo)致慢性呼吸衰竭。肺纖維化是肺受損后的一種并發(fā)癥，其預(yù)后極差，5年生存率不到50%，目前對于肺部纖維化類疾病的治療手段有限，建立穩(wěn)定而可靠的肺間質(zhì)纖維化模型是探索其發(fā)病機(jī)制和開發(fā)有效治療藥物的重要保障[3-5]。

目前肺纖維化動物模型采用的主要是嚙齒類動物，如小鼠、大鼠、倉鼠等，小鼠具有繁殖快、飼養(yǎng)管理費用低等特點，是科研工作者最常選用的動物[6]。肺纖維化誘導(dǎo)劑主要包括博萊霉素 (Bleomycin, BLM)、內(nèi)毒素、胺碘酮、百草枯、石棉、二氧化硅、放射線、高濃度氧、野百合堿、呼吸道腸道病毒等，其中以博來霉素和內(nèi)毒素最為常用[7-9]。本研究以ICR、C57BL/6兩個品系小鼠為研究對象，以博來霉素和內(nèi)毒素為肺纖維化誘導(dǎo)劑，尋找最適合復(fù)制肺纖維化模型的小鼠及誘導(dǎo)劑。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

清潔級ICR小鼠90只、清潔級C57BL/6小鼠90只，雄性，6～8周齡，體質(zhì)量18～22 g，浙江省實驗動物中心提供，合格證號：SCXK(浙)2017-0001。

1.2 試劑與儀器

博來霉素：海正輝瑞制藥有限公司；內(nèi)毒素：湛江安度斯生物有限公司；羥脯氨酸試劑盒：南京建成生物研究所。

1.3 方法

1.3.1分組:將ICR小鼠隨機(jī)分為對照組、博來霉素組、內(nèi)毒素組，每組30只；將C57BL/6小鼠隨機(jī)分為對照組、博來霉素組、內(nèi)毒素組，每組30只。

1.3.2小鼠肺纖維化模型建立

博來霉素組：腹腔注射2%戊巴比妥鈉(50 mg/kg體質(zhì)量)，小鼠麻醉后將其固定在30°傾角的鼠板上，在頸部開一個小口暴露氣管，用微量進(jìn)樣器插入氣管注博來霉素(5 mg/kg)，注射完畢后將小鼠直立左右輕微搖晃10 min，使藥液均勻分布于雙肺，完畢后縫合皮膚，在傷口處擦碘酒消毒。

內(nèi)毒素組：內(nèi)毒素以生理鹽水溶解，按40 EU/kg劑量一次性尾靜脈注射。

對照組：用與博來霉素同體積的生理鹽水氣管灌注。

分別于造模后第7、14、28天每組隨機(jī)處死8只小鼠進(jìn)行后續(xù)試驗。

1.4 肺系數(shù)測定

將各組小鼠沿腹部剪開，完整分離肺組織，用生理鹽水沖洗肺組織3遍，用濾紙吸干后稱得肺濕重，計算肺系數(shù)，肺系數(shù)=肺濕重(g)/體質(zhì)量(kg)。右肺置于4%甲醛溶液中固定，其余肺組織放于凍存管中，先浸沒于液氮1 h，后轉(zhuǎn)移至-80 ℃冰箱中保存。

1.5 小鼠肺組織病理學(xué)檢查

取右肺組織，用4%甲醛浸泡過夜固定，制備石蠟切片，做HE染色。在光學(xué)顯微鏡下觀察肺組織病理學(xué)改變。

1.6 ELISA檢查肺組織羥脯氨酸

取部分肺組織，稱重剪碎后與對應(yīng)體積的PBS(質(zhì)量體積比1 g：9mL)加入玻璃勻漿器中，在冰上充分研磨2 min，5 000×g離心10 min，取上清，用BCA法將不同組上清溶液調(diào)至相同蛋白濃度。采用ELISA法檢測各組小鼠肺組織中羥脯氨酸(HYP)含量。

1.7 統(tǒng)計方法

2 結(jié)果

2.1 兩個品系小鼠一般情況

ICR和C57BL/6小鼠中的對照組均狀態(tài)良好，飲食飲水正常，體質(zhì)量不同程度增加。相比于對照組，兩個品系的博來霉素和內(nèi)毒素組小鼠在造模后均出現(xiàn)不同程度的體質(zhì)量減輕，活躍度減少等情況。其中C57BL/6的博來霉素組和內(nèi)毒素組小鼠體質(zhì)量下降最顯著。ICR博來霉素組小鼠在第7天開始出現(xiàn)死亡，直至第28天共3例死亡；C57BL/6博來霉素組小鼠在第4天開始出現(xiàn)死亡，直至第28天共5例死亡。ICR的內(nèi)毒素組和C57BL/6的內(nèi)毒素組小鼠無死亡現(xiàn)象。

2.2 小鼠肺系數(shù)

肺系數(shù)可以反映單位質(zhì)量下肺濕重的變化，是反映肺纖維化程度的一個重要指標(biāo)。兩個品系的博來霉素組和內(nèi)毒素組小鼠的肺系數(shù)在第7、14、28天均高于對照組(P<0.05)。其中對于同一種肺纖維化誘導(dǎo)劑，C57BL/6品系的小鼠肺系數(shù)在第14、28天與ICR品系小鼠相比，肺系數(shù)升高(P<0.05)。對于同一品系小鼠，博來霉素組肺系數(shù)與內(nèi)毒素組相比，無顯著性差異(P>0.05)。結(jié)果見表1。

表1 兩個品系小鼠肺系數(shù)的比較Table 1 Comparison of lung coefficient between two strains of

2.3 肺病理形態(tài)改變

ICR和C57BL/6的對照組小鼠細(xì)支氣管和肺泡結(jié)構(gòu)完整，襯附正常纖毛柱狀上皮及肺泡上皮，間質(zhì)僅見少量炎性細(xì)胞浸潤，毛細(xì)血管正常；兩個品系的博來霉素組和內(nèi)毒素組小鼠均出現(xiàn)不同程度的肺纖維化，肺組織支氣管和肺泡結(jié)構(gòu)紊亂，間質(zhì)見較多慢性炎細(xì)胞浸潤，并可見纖維組織增生。相比于ICR博來霉素組和內(nèi)毒素組的小鼠，C57BL/6博來霉素組和內(nèi)毒素組小鼠肺纖維化程度更高，肺組織內(nèi)炎性細(xì)胞浸潤、肺泡壁斷裂及肺泡腔融合不同程度增加。結(jié)果見圖1。

2.4 小鼠肺組織中羥脯氨酸含量的比較

ICR和C57BL/6的博來霉素組和內(nèi)毒素組小鼠肺組織中羥脯氨酸含量在第14、28天均高于對照組(P<0.05)。其中對于同一種肺纖維化誘導(dǎo)劑，C57BL/6品系的小鼠肺組織中羥脯氨酸含量在第7、14、28天與ICR品系小鼠相比，含量升高(P<0.05)。對于同一品系小鼠，博來霉素組小鼠的肺組織中羥脯氨酸含量與內(nèi)毒素組小鼠相比，無顯著性差異(P>0.05)。結(jié)果見圖2。

圖2 兩個品系小鼠肺組織HYP含量注：兩個品系分別于對應(yīng)的對照組小鼠比較，*P<0.05；與另一品系對應(yīng)的相同組別小鼠比較，#P<0.05Fig.2 HYP content in lung tissue of two strains of Note：The two strains were compared in the corresponding control mice, *P<0.05; compared with the same group of mice corresponding to another strain,#P<0.05

3 討論

博來霉素是從輪狀鏈霉菌(Streptomycesverticillatus)中分離出來的，可有效對抗鱗狀細(xì)胞癌和皮膚腫瘤，然而其抗腫瘤作用具有引起肺纖維化的副作用[10]。博來霉素誘導(dǎo)的動物肺纖維化模型與人類肺纖維化過程相似度較高，是國內(nèi)外常用的肺纖維化誘導(dǎo)劑，常用的方法是通過氣管給藥[11]。

內(nèi)毒素是革蘭陰性菌細(xì)胞壁成分，其化學(xué)性質(zhì)為脂多糖(LPS)，耐熱而穩(wěn)定，不易被破壞，在動物體內(nèi)可引起發(fā)熱反應(yīng)、白細(xì)胞反應(yīng)甚至內(nèi)毒素性休克，是臨床上引起急性肺損傷的重要因素[12-13]。國內(nèi)外已有一些學(xué)者采用內(nèi)毒素制備急性肺損傷肺纖維化模型，可通過氣道、腹腔及靜脈等多種途徑給藥[8,14]。

C57BL/6是一種常用的近交品系實驗鼠，群體反應(yīng)性比較均一。C57BL/6 小鼠肺組織的組織學(xué)結(jié)構(gòu)接近于人類，其作為肺纖維化的模型能夠模擬人的肺纖維化的發(fā)病機(jī)制和過程[15-16]。ICR小鼠是一類繁殖力、抗病力和適應(yīng)力均很強(qiáng)的遠(yuǎn)交群小鼠，被廣泛應(yīng)用于藥理學(xué)、毒理學(xué)等多種領(lǐng)域的研究[17]。

本研究顯示在造模后的第14、28天，C57BL/6的博來霉素組和內(nèi)毒素組均出現(xiàn)不同程度的肺纖維化，其中對于同一種肺纖維化誘導(dǎo)劑，C57BL/6品系小鼠的肺纖維化程度與ICR品系小鼠相比，有顯著差異。對于同一品系小鼠，博來霉素組的肺纖維化程度與內(nèi)毒素組相比，無顯著差異。實驗結(jié)果表明，C57BL/6小鼠較ICR小鼠更適合復(fù)制博來霉素和內(nèi)毒素誘導(dǎo)的肺纖維化動物模型，但這兩種肺纖維化動物模型形成機(jī)制的差異性及適用條件需要進(jìn)一步研究。