無菌大鼠深二度燙傷感染金黃色葡萄球菌機(jī)體炎性反應(yīng)的研究*

李鴻雁 顏克松 馬東升 戰(zhàn)大偉 孫兆增

(1.軍事科學(xué)院軍事醫(yī)學(xué)研究院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，北京 100071)(2. 中國人民解放軍總醫(yī)院第四醫(yī)學(xué)中心，北京 100048)

近年來，隨著燒傷休克防治理論和臨床救治技術(shù)的提高,直接死于休克者已少見。感染已成為燒傷患者的主要致死原因,是燒傷防治研究的重要課題和難題之一[1]。金黃色葡萄球菌作為革蘭陽性菌的代表是常見的皮膚條件致病菌，存在于臨床傷口護(hù)理各個(gè)環(huán)節(jié)[2]，是引起人類化膿感染中最常見的病原菌，可直接導(dǎo)致局部化膿感染、肺炎等，甚至敗血癥、膿毒癥等全身感染。燒燙傷動(dòng)物模型作為現(xiàn)代燒傷外科領(lǐng)域基礎(chǔ)與應(yīng)用研究中的一個(gè)極為重要的實(shí)驗(yàn)方法，常選用豬、狗、羊、兔、大鼠、小鼠和豚鼠[3]。燒傷創(chuàng)面膿毒癥和創(chuàng)面用藥的研究多用大鼠和小鼠[4]。隨著近年來微生態(tài)研究的深入，采用無菌動(dòng)物定植特定的病原菌，成為研究特定病原菌對(duì)機(jī)體的作用機(jī)制的重要方法[5-9]，本試驗(yàn)通過制備無菌大鼠燙傷模型并定向感染一定濃度的金黃色葡萄球菌和SPF級(jí)燙傷大鼠并定向感染金黃色葡萄球菌，觀察4種模型動(dòng)物傷口結(jié)痂時(shí)間、脫痂時(shí)間和愈合時(shí)間，分時(shí)項(xiàng)采樣，測定血清炎性因子、檢查傷口處皮膚病理損傷情況，探討燙傷創(chuàng)面引發(fā)的損傷及金黃色葡萄球菌對(duì)燙傷愈合的影響。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1試驗(yàn)動(dòng)物： 6周齡SPF級(jí)Wistar雌性大鼠20只，由斯貝福實(shí)驗(yàn)動(dòng)物科技有限公司提供(生產(chǎn)許可證號(hào)：SCXK(京)2016-0002)。飼養(yǎng)在符合GB14925—2010的屏障環(huán)境；6周齡無菌Wistar雌性大鼠20只，由解放軍總醫(yī)院第四醫(yī)學(xué)中心動(dòng)物實(shí)驗(yàn)室提供，飼養(yǎng)在隔離器內(nèi)。

1.1.2主要試劑與儀器：金黃色葡萄球菌[CMCC(B)26003]標(biāo)準(zhǔn)菌株購自南京一基生化科技有限公司；腫瘤壞死因子-α(TNF-α)、白細(xì)胞介素-1α(IL-1α)、表皮生長因子受體(EGFR)ELISA試劑盒及血平皿均購自北京欣儀生物科技有限公司。大鼠隔離器購自蘇杭科技器材有限公司，恒溫恒壓燙傷儀購自山東省醫(yī)學(xué)科學(xué)院；恒溫培養(yǎng)箱購自上海微川精密儀器有限公司；酶標(biāo)儀購自賽默飛世爾(上海)有限公司。

1.2 方法

1.2.1金黃色葡萄球菌菌液制備：將標(biāo)準(zhǔn)金黃色葡萄球菌復(fù)蘇后，采用標(biāo)準(zhǔn)劃線法將細(xì)菌接種在血平皿中，倒置在37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h，即可得到大量金黃色葡萄球菌菌落。用無菌接種環(huán)從培養(yǎng)皿中挑取2～3個(gè)菌落，放入裝有少量無菌生理鹽水的麥?zhǔn)媳葷峁苤校B續(xù)反復(fù)稀釋混勻，直至比濁儀顯示為1.0麥?zhǔn)媳葷岫?。此時(shí)，麥?zhǔn)媳葷峁苤薪瘘S色葡萄球菌菌液的濃度為3×108CFU/mL，所得菌液用生理鹽水1∶3稀釋到1×108CFU/mL。

1.2.2染菌： 超凈工作臺(tái)用75%酒精擦拭后，紫外燈消毒30 min。將無菌大鼠從隔離器中用密閉消毒飼養(yǎng)盒取出，置于超凈工作臺(tái)內(nèi)，按照50 mg/kg體質(zhì)量腹腔注射戊巴比妥鈉麻醉，用刮胡刀片將大鼠背部刮至皮膚完全暴露。用恒溫恒壓燙傷儀94 ℃作用8 s，壓力500 g在大鼠背部造成兩個(gè)直徑為2.5 cm的深二度燙傷傷口。隨后大鼠隨機(jī)分為兩組，一組燙傷后直接傳入大鼠隔離器內(nèi)飼養(yǎng)觀察，一組燙傷后傷口接種1×108CFU/mL金黃色葡萄球菌菌液后傳入另一隔離器內(nèi)單獨(dú)飼養(yǎng)。SPF級(jí)大鼠采用相同方法燙傷后隨機(jī)分為兩組，一組燙傷后傷口接種1×108CFU/mL金黃色葡萄球菌菌液0.5 mL，一組不做處理，飼養(yǎng)在IVC內(nèi)。

1.2.3測定指標(biāo)與方法： 肉眼觀察4組大鼠傷口結(jié)痂、脫痂及愈合時(shí)間并記錄。在燙傷后24 h、48 h、3 d、5 d、7 d、10 d、14 d時(shí)，眼眶取血，室溫放置20 min，3 000 r/min離心10 min，收集上清，ELISA試劑盒檢測TNF-α、IL-1α和EGFR水平；燙傷后24 h、3 d、7 d、10 d，每組選取1只大鼠取傷口處皮膚，4%甲醛溶液固定，用于病理制片，HE染色觀察傷口處皮膚病理變化。

1.3 統(tǒng)計(jì)方法

2 結(jié)果

2.1 4組大鼠傷口結(jié)痂、脫痂和愈合時(shí)間

由表1可知，感染金黃色葡萄球菌的兩組燙傷大鼠結(jié)痂時(shí)間顯著長于未感染金黃色葡萄球菌的兩組大鼠(P<0.05)；感染金黃色葡萄球菌SPF大鼠脫痂及愈合時(shí)間顯著長于感染金黃色葡萄球菌無菌大鼠(P<0.05)。

表1 4組大鼠結(jié)痂、脫痂和愈合時(shí)間Table 1 The scab escharosis,decrustation and healing time of four groups of rats

2.2 燙傷大鼠傷口皮膚病理觀察

圖1-B、1-C分別為感染金黃色葡萄球菌SPF大鼠燙傷24 h時(shí)皮膚和皮下組織，皮膚細(xì)胞間質(zhì)水腫，肌層呈化膿性炎細(xì)胞浸潤；圖1-D為感染金黃色葡萄球菌SPF大鼠燙傷7 d時(shí)皮膚及皮下組織，可見新生血管；圖1-E為無菌大鼠燙傷72 h時(shí)皮膚及皮下組織，可見新生血管；圖1-F為無菌大鼠燙傷10 d時(shí)皮膚及皮下組織，有肉芽組織生成；圖1-G為感染金黃色葡萄球菌無菌大鼠燙傷72 h時(shí)皮膚及皮下組織，有大量新生小血管和新生肉芽組織形成。

圖1 燙傷大鼠皮膚HE染色(×100)注：A：正常皮膚；B、C：感染金黃色葡萄球菌SPF大鼠皮膚燙傷24 h；D：感染金黃色葡萄球菌SPF大鼠皮膚燙傷7 d；E：無菌大鼠燙傷72 h；F：無菌大鼠燙傷10 d；G：感染金黃色葡萄球菌無菌大鼠燙傷72 hFig.1 The HE staining skin of burned ratsNote：A：Normal skin；B and C：The skin of SPF rat in Staphylococcus aureus infection group at 24 h after burned；D：The skin SPF rat in Staphylococcus aureus infection group at 72 h after burned；E：The skin of germ-free rat at 7 d after burned；F：The skin of germ-free rat group at10 d after burned；G：The skin of germ-free rat in Staphylococcus aureus infection group at 72 h after burned

2.3 炎性因子檢測結(jié)果

由圖2可知，4組大鼠燙傷后血清TNF-α水平均顯著升高(P<0.05)，無菌大鼠及感染金黃色葡萄球菌無菌大鼠在燙傷24 h時(shí)，血清TNF-α水平顯著高于SPF大鼠組和感染金黃色葡萄球菌SPF大鼠組(P<0.05)；燙傷72 h時(shí)，感染金黃色葡萄球菌SPF大鼠組顯著高于其他3組(P<0.05)；燙傷7 d時(shí)，無菌大鼠和感染金黃色葡萄球菌無菌大鼠組顯著低于兩組SPF大鼠(P<0.05)。

圖2 4組大鼠血清TNF-α水平Fig.2 The TNF-α level serum of rats in four groups(ng/L)

由圖3可知，4組大鼠燙傷后血清IL-1α水平均顯著升高(P<0.05)，無菌大鼠及感染金黃色葡萄球菌無菌大鼠在燙傷24 h時(shí)，血清IL-1α水平顯著高于SPF大鼠組和感染金黃色葡萄球菌SPF大鼠組(P<0.05)；燙傷48 h時(shí)，無菌大鼠和感染金黃色葡萄球菌無菌大鼠組顯著低于SPF大鼠組和感染金黃色葡萄球菌SPF大鼠組(P<0.05)，燙傷72 h時(shí)，感染金黃色葡萄球菌SPF大鼠顯著高于其他3組。

圖3 4組大鼠血清IL-1α水平Fig.3 The IL-1α level serum of rats in four groups(ng/L)

由圖4可知，4組大鼠燙傷后血清EGFR水平均顯著升高(P<0.05)，無菌大鼠及感染金黃色葡萄球菌無菌大鼠在燙傷24 h、48 h和72 h時(shí)血清EGFR水平顯著高于SPF大鼠組和感染金黃色葡萄球菌SPF大鼠組(P<0.05)，感染金黃色葡萄球菌無菌大鼠顯著高于無菌大鼠(P<0.05)。

圖4 4組大鼠血清EGFR水平Fig.4 The EGFR level serum of rats in four groups(ng/L)

3 討論

以往對(duì)燒傷并引發(fā)全身炎癥反應(yīng)綜合征，甚至發(fā)展為多器官功能障礙綜合征的動(dòng)物模型的制備與研究，加深了我們對(duì)燒傷損傷機(jī)制的認(rèn)識(shí)，但是存在一定的不足，不能分解分析燒傷后發(fā)生的兩個(gè)過程：由燒傷創(chuàng)面引發(fā)的多種細(xì)胞因子及炎癥遞質(zhì)的過度釋放，從而引發(fā)的炎癥反應(yīng)；由腸道菌群移位引發(fā)的全身性感染。由于無菌動(dòng)物腸道沒有菌群的存活，制作的無菌動(dòng)物燒傷模型，能夠準(zhǔn)確分析燒傷創(chuàng)面引發(fā)的損傷以及機(jī)體的反應(yīng)。

由于燒燙傷使皮膚的防御功能遭到破壞，并且使創(chuàng)面產(chǎn)生豐富壞死組織和細(xì)胞，形成了天然的培養(yǎng)基，細(xì)菌更容易發(fā)生定植[10-11]。目前燙傷后感染模型的制備方法有2種：一種是動(dòng)物燙傷后傷口擦刮標(biāo)準(zhǔn)菌株；另一種是燙傷后傷口皮下注射標(biāo)準(zhǔn)菌株[12-16]。沈娟等[17]研究表明深Ⅱ度創(chuàng)面擦刮法接種1×108CFU/mL金黃色葡萄球菌菌液可以制備感染創(chuàng)面防治研究的動(dòng)物模型。所以本實(shí)驗(yàn)采用了濃度為1×108CFU/mL的金黃色葡萄球菌感染無菌大鼠及SPF級(jí)大鼠，均成功制備了大鼠燙傷感染模型。

金黃色葡萄球菌廣泛存在，甚至健康個(gè)體也會(huì)攜帶。美國疾病控制中心報(bào)告，由金黃色葡萄球菌引起的感染占第二位，僅次于大腸桿菌，是人類化膿感染中最常見的病原菌之一。金黃色葡萄球菌擦刮法感染的SPF級(jí)燙傷大鼠，使其出現(xiàn)化膿性感染，傷口愈合緩慢。燒傷后機(jī)體處于應(yīng)激狀態(tài)，炎性因子大量釋放[18]，其中IL-1α是單核細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞、成纖維細(xì)胞等在應(yīng)答感染時(shí)產(chǎn)生的細(xì)胞因子所產(chǎn)生，是一種參與免疫調(diào)節(jié)的促炎因子，是炎癥反應(yīng)中主要中間介質(zhì)，可誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞活化，刺激中性粒細(xì)胞釋放炎癥蛋白和炎癥介質(zhì)，從而放大炎癥反應(yīng)[19]；TNF-α主要由單核吞噬細(xì)胞產(chǎn)生，是體內(nèi)最重要的多功能促炎細(xì)胞因子[20]，通過增強(qiáng)中性粒細(xì)胞的功能，使釋放的炎癥介質(zhì)增加，從而加重機(jī)體的損傷。實(shí)驗(yàn)中，4組大鼠燙傷24 h時(shí)，感染金黃色葡萄球菌無菌大鼠組血清IL-1α和TNF-α水平顯著高于其他3組，與Balish等[21]的實(shí)驗(yàn)結(jié)果金黃色葡萄球菌在刺激無菌大鼠血清蛋白生成中起到顯著作用相一致。EGFR廣泛分布于哺乳動(dòng)物上皮細(xì)胞、成纖維細(xì)胞、膠質(zhì)細(xì)胞、角質(zhì)細(xì)胞等細(xì)胞表面，EGFR信號(hào)通路對(duì)細(xì)胞的生長、增殖和分化等生理過程發(fā)揮重要的作用，在創(chuàng)面愈合過程中具有重要作用[22-23]。適度的細(xì)菌感染炎性刺激能夠調(diào)動(dòng)機(jī)體全身免疫機(jī)制，有利于吞噬細(xì)胞和生長因子大量產(chǎn)生，有利于傷口愈合[24]。燙傷24 h、48 h和72 h時(shí)，感染金黃色葡萄球菌無菌大鼠組血清EGFR水平顯著高于其他3組，與感染金黃色葡萄球菌無菌大鼠愈合速度顯著短于其他3組的結(jié)果相一致。Bauer等[25]和Levenson等[26]研究表明動(dòng)物在出生后不久，其免疫系統(tǒng)被大量細(xì)菌刺激而激活，而無菌大鼠由于未受到菌群刺激，因而其細(xì)胞免疫和體液免疫不完善。

SPF大鼠燙傷后感染金黃色葡萄球菌，由于金黃色葡萄球菌產(chǎn)生的多種蛋白酶破壞細(xì)胞外基質(zhì)和細(xì)胞間聯(lián)系[27]，導(dǎo)致傷口化膿性感染，延緩了傷口愈合；無菌大鼠由于受到燙傷和金黃色葡萄菌分泌的超抗原的共同作用，調(diào)動(dòng)處于休眠狀態(tài)的全身免疫系統(tǒng)[28-29]，促進(jìn)生長因子產(chǎn)生，從而縮短了傷口愈合時(shí)間。