納他霉素對(duì)采后柑桔病菌抑菌效果的研究

黃文彬

（江蘇聯(lián)合職業(yè)技術(shù)學(xué)院鹽城生物工程分院，江蘇鹽城 224001）

柑桔青霉病和綠霉病是造成柑桔果實(shí)采后貯藏腐爛的主要病害，是由意大利青霉菌和指狀青霉菌侵染柑桔而引起的。每年由于感染以上2 種病菌而損失的柑桔果實(shí)達(dá)到30%～50%[1]。目前生產(chǎn)上廣泛使用咪鮮胺、甲基托布津、多菌靈等化學(xué)殺菌劑進(jìn)行防治，由于化學(xué)保鮮劑的長(zhǎng)期大量使用，造成藥物殘留，對(duì)人體健康以及柑桔果實(shí)的品質(zhì)造成嚴(yán)重的影響。納他霉素是一種高效、廣譜的真菌抑制劑，主要應(yīng)用于肉類(lèi)、飲料、乳制品等食品中，能較好地抑制霉菌、酵母菌生長(zhǎng)。目前將納他霉素應(yīng)用在水果保鮮上的報(bào)道還很少，在柑桔[2]、草莓[3]、葡萄[4]、蘋(píng)果[5]上面有些初步研究。本試驗(yàn)以引起柑桔采后青綠霉病的意大利青霉和指狀青霉為材料，研究不同濃度納他霉素對(duì)2 種青霉菌的抑制作用及毒力方程，確定最低抑菌濃度，旨在為研究納他霉素在果蔬保鮮中的應(yīng)用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

供試菌種為意大利青霉（Penicillium italicum）、指狀青霉（P.digitatum），均購(gòu)于中國(guó)農(nóng)業(yè)微生物菌種保藏中心（ACCC），納他霉素（Natamycin）購(gòu)于蘭州偉日生物工程有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

生化培養(yǎng)箱，高壓滅菌鍋，超凈工作臺(tái)，電子天平，移液槍?zhuān)?～1000μL）。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 不同濃度納他霉素對(duì)青霉菌的抑制效果評(píng)價(jià)。將納他霉素配制成100、150、200、300、400、500、600、700μg/mL 的濃度梯度。用接種環(huán)分別挑取少量培養(yǎng)3d 的意大利青霉和指狀青霉菌于裝玻璃珠的無(wú)菌生理鹽水三角瓶?jī)?nèi)，振蕩10min 左右，制成均勻的菌懸浮液。血球計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)，使其含孢子為106～107CFU/mL左右，用移液槍向凝固的PDA 平板上加0.1mL 菌懸液，無(wú)菌三角玻璃刮鏟涂布均勻。鑷子夾無(wú)菌牛津杯，放置于菌液平板表面，輕輕加壓，使其與培養(yǎng)基接觸無(wú)空隙。用移液槍向牛津杯加0.2mL 不同濃度的納他霉素，勿使外溢。至26℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，觀(guān)察抑菌效果，測(cè)量抑菌圈直徑。

1.3.2 納他霉素對(duì)青霉菌的最低抑制濃度（MIC）。將納他霉素用2%冰醋酸配制成濃度分別為2μg/mL、4μg/mL、6μg/mL、8μg/mL、10μg/mL。于含不同濃度藥液的試管中，各加入測(cè)試菌0.2mL，充分混勻，將上述試管置于28℃的恒溫箱中培養(yǎng)24h。取出試管，充分振蕩，并對(duì)各試管進(jìn)行逐個(gè)檢查，用肉眼觀(guān)察其渾濁度。

1.3.3 菌懸液及菌餅的制備[6]。將供試菌于28℃馬鈴薯瓊脂培養(yǎng)基上活化3d，用無(wú)菌水配制成106～107CFU/mL 的霉菌孢子懸浮液。取菌懸液0.2mL 接入已凝固的PDA 培養(yǎng)基上，涂布均勻。放入26℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3d，用打孔器在菌落邊緣打出6mm 直徑的菌餅，待用。

1.3.4 納他霉素對(duì)青霉菌菌絲的生長(zhǎng)抑制作用。采用室內(nèi)生長(zhǎng)速率法[7]，測(cè)定納他霉素對(duì)指狀青霉菌和意大利青霉菌的毒力大小。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同濃度納他霉素對(duì)青霉菌抑制效果評(píng)價(jià)

由表1 可知，不同濃度納他霉素對(duì)柑桔青霉均有良好的抑制效果，隨著濃度的不斷提高，抑菌圈直徑也隨之增大，500μg/mL 以后隨著濃度的增加，抑制效果差異不顯著，而且經(jīng)過(guò)試驗(yàn)，濃度600μg/mL 和700μg/mL 浸泡臍橙時(shí)，表面會(huì)殘留有白色的藥斑，影響果實(shí)外觀(guān)，綜合考慮成本和抑制效果，推薦生產(chǎn)實(shí)踐的濃度為500μg/mL 為佳。

表1 納他霉素對(duì)意大利青霉和指狀青霉的抑制效果（96h）

2.2 納他霉素對(duì)青霉的最低抑制濃度（MIC）

表2 可知，納他霉素對(duì)意大利青霉和指狀青霉都有極強(qiáng)的抑制作用，隨著濃度的增加，其抑菌作用越明顯，兩者的最低抑制濃度相同，為6μg/mL。

2.3 納他霉素對(duì)柑桔青霉菌菌絲生長(zhǎng)的抑制作用

表2 納他霉素對(duì)意大利青霉和指狀青霉的最低抑制濃度（72h）

采用室內(nèi)毒力測(cè)定法，在PDA 培養(yǎng)基上測(cè)定納他霉素對(duì)柑桔青霉菌菌絲的抑制作用，獲得不同濃度藥劑處理對(duì)菌落生長(zhǎng)抑制作用數(shù)據(jù)，得出以各藥劑濃度對(duì)數(shù)值為X，抑菌率幾率值為Y 的毒力回歸方程和EC50，其結(jié)果見(jiàn)表3，納他霉素對(duì)意大利青霉菌的毒力作用較強(qiáng)，EC50 為0.6287μg/mL，對(duì)指狀青霉的毒力作用稍弱，EC50 為3.5319μg/mL。

表3 納他霉素對(duì)意大利青霉菌和指狀青霉菌的毒力回歸方程（72h）

3 討論

納他霉素作為一種高效、安全的生物保鮮劑，主要應(yīng)用在食品工業(yè)上，在水果保鮮上的應(yīng)用較少。本試驗(yàn)研究表明，納他霉素對(duì)引起柑桔常見(jiàn)采后病害的青霉菌也具有較強(qiáng)抑制效果，明確了對(duì)意大利青霉和指狀青霉的最低抑制濃度。為今后在生產(chǎn)上的應(yīng)用提供了理論依據(jù)。