Apelin-13對(duì)3T3-L1前體脂肪細(xì)胞增殖與分化的影響

童國(guó)相 王莎 高國(guó)應(yīng) 何一偉 李瓊

長(zhǎng)沙醫(yī)學(xué)院附屬第一醫(yī)院內(nèi)分泌科 410219

Apelin 是血管緊張素受體AT1 相關(guān)受體蛋白( putative receptor protein related to the angiotensin receptor AT1，APJ) 的內(nèi)源性配體［1］。其主要存在于心臟、腎、肺的大血管內(nèi)皮細(xì)胞中，在腎上腺細(xì)胞、血管平滑肌細(xì)胞、神經(jīng)細(xì)胞、結(jié)締組織等中也有表達(dá)。Apelin也存在于脂肪組織中，是其中的一種脂肪因子［2］。Apelin的前體肽源包含77 個(gè)氨基酸殘基，羧基C 末端為合成肽序列，可被肽酶分解成多種成熟的Apelin活性肽，包括Apelin-10、11、12、13、15、17、19、28、36 等，其中Apelin-13的生物活性最強(qiáng)［3］。既往研究顯示，Apelin在控制血壓，增強(qiáng)心肌收縮力，調(diào)節(jié)體液平衡，促進(jìn)垂體激素分泌和調(diào)節(jié)免疫等生物學(xué)效應(yīng)中均發(fā)揮著不同程度的作用［4-7］。此外，Apelin在肥胖、脂肪細(xì)胞代謝中同樣具有重要調(diào)節(jié)作用。Guo 等［8］研究顯示，Apelin-13在體外可以降低肥大脂肪細(xì)胞的脂質(zhì)貯積，可能的作用機(jī)制為通過磷脂酰肌醇3 激酶信號(hào)通路上調(diào)水通道蛋白7 的表達(dá)。Sawane等［9］在高脂飲食誘導(dǎo)肥胖小鼠模型中發(fā)現(xiàn)，Apelin基因敲除小鼠的體重及皮下脂肪層厚度、脂肪細(xì)胞直徑顯著高于高脂飲食野生型小鼠。Apelin 基因轉(zhuǎn)染則可以降低高脂飲食的作用。Apelin基因敲除小鼠在肥胖發(fā)生過程中，可以出現(xiàn)腸系膜淋巴管增生與擴(kuò)張。Apelin基因轉(zhuǎn)染抑制了高脂飲食誘導(dǎo)的淋巴管數(shù)量和通透性的增加。結(jié)果表明，Apelin通過增強(qiáng)淋巴管和血管的完整性，從而抑制肥胖。本研究通過在3T3-L1 前體脂肪細(xì)胞增殖、分化過程中，予以Apelin-13干預(yù)，探討Apelin-13對(duì)脂肪細(xì)胞增殖、分化的影響，并初步探討其可能的作用機(jī)制。具體報(bào)道如下。

1 材料與方法

1．1 試劑與儀器 3T3-L1前體脂肪細(xì)胞購(gòu)自于中國(guó)科學(xué)院上海細(xì)胞庫(kù); Apelin-13購(gòu)自于上海齊一生物科技有限公司; DMEM 高糖培養(yǎng)液、胎牛血清、1-甲基-3-異丁基-黃嘌呤( IBMX) 、地塞米松、胰島素，四甲基偶氮唑鹽( MTT) 檢測(cè)試劑盒、油紅O 染液、甘油三酯檢測(cè)試劑盒購(gòu)自于北京鼎國(guó)昌盛生物科技有限公司;實(shí)時(shí)熒光定量PCR 引物由上海生工生物工程有限公司合成; Trizol試劑盒、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒和SYBR Green熒光定量試劑盒均購(gòu)自北京索萊寶科技有限公司; 過氧化物酶體增殖物活化受體( PPAR) γ 抗體、HRP 標(biāo)記的二抗，總蛋白提取試劑盒和蛋白濃度檢測(cè)試劑盒均購(gòu)自上海碧云天生物科技有限公司; CO2恒溫細(xì)胞培養(yǎng)箱購(gòu)自美國(guó)Thermo公司;離心機(jī)購(gòu)自美國(guó)Sigma公司; FlexStation 3多功能酶標(biāo)儀購(gòu)自美國(guó)Molecular Devices公司; IX51倒置顯微鏡購(gòu)自日本Olympus 公司; PE2400 型多功能PCR 儀購(gòu)自美國(guó)Perking公司; 電泳槽、電泳儀、化學(xué)發(fā)光熒光成像系統(tǒng)等購(gòu)自美國(guó)Bio-Rad公司。

1．2 研究方法

1．2．1 3T3-L1 前體脂肪細(xì)胞培養(yǎng) 3T3-L1前體脂肪細(xì)胞置于DMEM 高糖培養(yǎng)液( 含10%胎牛血清，100 U/ml的青霉素和鏈霉素) ，在37℃、5%CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。每2 天更換培養(yǎng)液。

1．2．2 MTT 法檢測(cè)3T3-L1 前體脂肪細(xì)胞增殖 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞，以5 000 個(gè)/孔接種至96 孔培養(yǎng)板，培養(yǎng)液100 μl/孔，置于37℃，5%CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，貼壁后輕輕吸棄上清液。分別予以濃度為5、10、20、40、50、100 μmol/L的Apelin-13進(jìn)行干預(yù)，每組6 個(gè)復(fù)孔，并設(shè)置空白對(duì)照孔。干預(yù)24、48、72、96 h后，分別每孔加入5 g/L MTT 20 μl，37℃溫育，棄去孔內(nèi)液體，避光振蕩10 min后，在酶標(biāo)儀上以490 nm 波長(zhǎng)測(cè)定各孔吸光度值( A 值) 。各濃度平行孔A 值均值減去空白對(duì)照孔A 值均值后，按照細(xì)胞存活率(%) =( A實(shí)驗(yàn)孔－A空白孔) /A空白孔×100%。

1．2．3 “經(jīng)典雞尾酒法”誘導(dǎo)3T3-L1前體脂肪細(xì)胞分化及干預(yù) 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞，以5 000個(gè)/孔接種至96 孔培養(yǎng)板，培養(yǎng)液100 μl/孔，繼續(xù)培養(yǎng)2 d。待3T3-L1前體脂肪細(xì)胞融合后，將培養(yǎng)液換為含0．5 mmol/L IBMX、0．25 μmol/L 地 塞 米 松 和10 mg/L胰島素的DMEM 高糖培養(yǎng)液。2 d 后再更換為含10%胎牛血清、10 mg/L胰島素的DMEM高糖培養(yǎng)液繼續(xù)孵育2 d。隨后以不含任何誘導(dǎo)劑的DMEM高糖培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)2 d 至分化完成。培養(yǎng)液每2 天更換1 次。誘導(dǎo)分化第8 天，95%以上的細(xì)胞可分化為具有脂肪細(xì)胞表型的成熟脂肪細(xì)胞。將對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞分為實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組。實(shí)驗(yàn)組分別于誘導(dǎo)分化第2、4、6、8 天更換培養(yǎng)液的同時(shí)，予以細(xì)胞存活率抑制作用最強(qiáng)的Apelin-13濃度進(jìn)行干預(yù)。對(duì)照組不做處理。

1．2．4 油紅O 染色和甘油三酯含量檢測(cè) 于誘導(dǎo)分化第8 天，分別取兩組成熟脂肪細(xì)胞，采用油紅O染色法室溫染色2 h。倒置顯微鏡下觀察脂滴形成情況并拍照。然后加入異丙醇處理染色的細(xì)胞，通過酶標(biāo)儀在510 nm波長(zhǎng)下測(cè)定吸光度( OD) 值，計(jì)算脂質(zhì)含量。嚴(yán)格按照說明書，使用甘油三酯檢測(cè)試劑盒測(cè)定甘油三酯含量。

1．2．5 RT-PCR 檢測(cè)PPARγ mRNA表達(dá)變化 于誘導(dǎo)分化第2、4、6、8 天，分別收集兩組細(xì)胞。經(jīng)胎牛血清洗滌后，Trizol法提取3T3-L1 前體脂肪細(xì)胞總RNA，紫外分光光度計(jì)測(cè)定總 RNA 濃度，A260/A280值在1．8 ～2．0。逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA，使用SYBR Green染色法進(jìn)行RT-PCR，檢測(cè)PPARγ mRNA水平。上游引物: 5'-GTGATGGAAGACCACTCGC-3';下游引物:5'-CCCACAGACTCGGCACTC-3'。PCR反應(yīng)總體積為10 μl。反應(yīng)條件為:50℃2 min;預(yù)變性95℃5 min; 循環(huán)95℃30 s，60℃30 s，PCR 儀上擴(kuò)增40 個(gè)循環(huán)。以18s RNA作為內(nèi)參。采用公式2－△△CT計(jì)算mRNA 相對(duì)表達(dá)量，分析表達(dá)量的差異。

1．2．6 Western 印跡檢測(cè)PPARγ 蛋白表達(dá)變化于誘導(dǎo)分化第2、4、6、8 天，分別提取兩組3T3-L1前體脂肪細(xì)胞總蛋白，經(jīng)蛋白定量后，每泳道上樣40 μg蛋白，電泳后轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜，5%脫脂奶粉封閉3 h，加入PPARγ抗體，室溫?fù)u床孵育2 h，加入HRP 標(biāo)記二抗孵育30 min，以β-actin作為內(nèi)參。檢測(cè)條帶用化學(xué)發(fā)光熒光成像系統(tǒng)掃描灰度值。

1．3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 應(yīng)用SPSS 22．0 軟件處理，正態(tài)分布的計(jì)量資料采用x ±s 表示。計(jì)量資料兩兩比較采用t 檢驗(yàn)分析。P ＜0．05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2．1 Apelin-13 對(duì)3T3-L1前體脂肪細(xì)胞增殖的影響Apelin-13濃度越高，干預(yù)時(shí)間越長(zhǎng)，3T3-L1前體脂肪細(xì)胞的存活率越低。以100 μmol/L Apelin-13 干預(yù)96 h 后，3T3-L1前體脂肪細(xì)胞的存活率最低( 圖1) 。

圖1 不同濃度Apelin鄄13 對(duì)3T3鄄L1 前體脂肪細(xì)胞增殖的影響

2．2 Apelin-13 對(duì)3T3-L1前體脂肪細(xì)胞分化的影響油紅O 染色結(jié)果顯示，誘導(dǎo)分化第8 天，兩組細(xì)胞核周可見大量紅色“戒環(huán)”樣脂滴，見圖2( 封3) 。經(jīng)Apelin-13干預(yù)的3T3-L1前體脂肪細(xì)胞脂滴、脂質(zhì)和甘油三酯含量均明顯少于對(duì)照組( t=4．526、5．353、4．827，P 均＜0．05)，見圖3。

圖2 Apelin鄄13 對(duì)3T3鄄L1 前體脂肪細(xì)胞分化的影響（油紅O 染色，200×）

圖3 Apelin鄄13 對(duì)3T3鄄L1 前體脂肪細(xì)胞分化的影響

2．3 Apelin-13 對(duì)PPARγ mRNA表達(dá)的影響 如圖4，與對(duì)照組相比，誘導(dǎo)分化第6、8 天，經(jīng)Apelin-13干預(yù)的3T3-L1前體脂肪細(xì)胞PPARγ mRNA表達(dá)量顯著下降( t=4．962、5．416，P 均＜0．05) 。

2．4 Apelin-13 對(duì)PPARγ 蛋白表達(dá)的影響 如圖5，與對(duì)照組相比，誘導(dǎo)分化第6、8 天，經(jīng)Apelin-13干預(yù)的3T3-L1前體脂肪細(xì)胞PPARγ蛋白表達(dá)量顯著下降( t=4．734、5．627，P 均＜0．05) 。

圖4 實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組PPARγ mRNA 表達(dá)的比較

圖5 實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組PPARγ 蛋白表達(dá)的比較

3 討論

肥胖以體內(nèi)白色脂肪組織過度積聚為重要特征，與2 型糖尿病、心腦血管疾病、腫瘤等多種疾病的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)。肥胖不僅影響生活質(zhì)量，減少預(yù)期壽命，同時(shí)也給患者的家庭和社會(huì)帶來沉重的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)［10］。因此，肥胖一直是臨床研究的熱點(diǎn)與難點(diǎn)。

Apelin 是APJ 的內(nèi)源性配體，在多種細(xì)胞中均有表達(dá)。白色脂肪組織是重要的內(nèi)分泌組織，可分泌瘦素、脂聯(lián)素、網(wǎng)膜素等多種脂肪因子。Apelin也是白色脂肪組織分泌的眾多脂肪因子中的一種［11］。近年來多項(xiàng)研究表明，Apelin在多種疾病的發(fā)生、發(fā)展中具有重要的調(diào)節(jié)作用。Boal等［12］研究顯示，在高脂飲食喂養(yǎng)的心臟缺血/再灌注小鼠中，靜脈注射Apelin-13顯著減少了心肌梗死面積、細(xì)胞凋亡和線粒體損傷。在H9C2心肌細(xì)胞系和原代心肌細(xì)胞中，Apelin-13可以誘導(dǎo)叉頭框蛋白O1( FOXO1) 磷酸化和核排斥，通過siRNA沉默F(xiàn)OXO1，可消除Apelin-13對(duì)缺氧誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡和線粒體活性氧簇生成的保護(hù)作用。小鼠Apelin缺陷導(dǎo)致心肌FOXO1表達(dá)減少，F(xiàn)OXO1分布受損。Yang 等［13］體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，肺腺癌細(xì)胞過表達(dá)APJ，Apelin-13能顯著增加細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶1/2 的磷酸化以及細(xì)胞周期蛋白D1、微管相關(guān)蛋白1 輕鏈3A/B( LC3A/B) 和自噬相關(guān)基因Beclin1的表達(dá)，并誘導(dǎo)肺腺癌細(xì)胞的增殖和自噬。Bülbül等［14］研究證實(shí)，在大鼠體內(nèi)，Apelin-13可以通過迷走神經(jīng)膽堿能通路抑制胃腸道運(yùn)動(dòng)。

白色脂肪組織的主要成分為前體脂肪細(xì)胞和脂肪細(xì)胞，還包括滲透入白色脂肪組織的內(nèi)皮細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、血管神經(jīng)等非脂肪細(xì)胞和組織［15］。肥胖發(fā)生的生物學(xué)基礎(chǔ)是白色脂肪組織內(nèi)前體脂肪細(xì)胞增殖、分化，導(dǎo)致脂肪細(xì)胞體積和數(shù)量的增加。體積變化與前體脂肪細(xì)胞增殖和脂解的平衡相關(guān)，而數(shù)量變化則與前體脂肪細(xì)胞分化和凋亡密切相關(guān)［16］。Than等［17］研究顯示，Apelin-APJ信號(hào)通路通過磷脂酰肌醇3 激酶/蛋白激酶B 和AMP 活化蛋白激酶信號(hào)通路，增加棕色脂肪形成和熱原性轉(zhuǎn)錄因子的表達(dá)，從而促進(jìn)棕色脂肪細(xì)胞分化。Apelin可以減輕腫瘤壞死因子-α對(duì)棕色脂肪生成的抑制作用，促進(jìn)棕色脂肪細(xì)胞PPARγ協(xié)同刺激因子1α 和解耦聯(lián)蛋白1 的表達(dá)增加。此外，Apelin還能夠增加白色脂肪細(xì)胞的棕色化，從而發(fā)揮抗肥胖的作用。本研究首次在3T3-L1前體脂肪細(xì)胞誘導(dǎo)分化過程中，予以Apelin-13干預(yù)，結(jié)果表明，Apelin-13能抑制3T3-L1前體脂肪細(xì)胞的增殖，且呈濃度和時(shí)間依賴性。油紅O 染色檢測(cè)脂質(zhì)含量和甘油三酯含量的結(jié)果表明，Apelin-13能抑制3T3-L1前體脂肪細(xì)胞分化過程中脂滴的形成，減少脂質(zhì)聚集和甘油三酯含量。

在前體脂肪細(xì)胞分化過程中，PPAR、CCAAT增強(qiáng)子結(jié)合蛋白α、脂肪細(xì)胞蛋白2 等轉(zhuǎn)錄因子發(fā)揮重要的調(diào)控作用［18-19］。其中，PPAR是核激素受體家族中的配體激活受體，根據(jù)結(jié)構(gòu)的不同，PPAR可分為α、β 和γ 3 種類型。其中PPARγ主要表達(dá)于脂肪組織和免疫系統(tǒng)，具有脂肪組織特異性，是體內(nèi)脂肪形成所必需的轉(zhuǎn)錄因子，能被脂肪酸及外源性過氧化物酶體增殖物激活，調(diào)控脂代謝酶的表達(dá)，從而導(dǎo)致前體脂肪細(xì)胞最終的分化，脂滴形成，脂質(zhì)聚集［20］。因此，PPARγ在前體脂肪細(xì)胞分化中起著重要的調(diào)節(jié)作用。本研究首次通過檢測(cè)Apelin-13干預(yù)的3T3-L1 前體脂肪細(xì)胞誘導(dǎo)分化過程中PPARγ mRNA和蛋白的表達(dá)變化，發(fā)現(xiàn)Apelin-13 能下調(diào)3T3-L1前體脂肪細(xì)胞PPARγ mRNA和蛋白的表達(dá)。此可能為Apelin-13抑制3T3-L1前體脂肪細(xì)胞分化的作用機(jī)制。

綜上，Apelin-13 呈濃度和時(shí)間依賴性抑制3T3-L1前體脂肪細(xì)胞的增殖，并抑制3T3-L1前體脂肪細(xì)胞分化過程中脂滴的形成，減少脂質(zhì)聚集和甘油三酯含量。其可能的作用機(jī)制為通過抑制3T3-L1前體脂肪細(xì)胞分化相關(guān)調(diào)控因子PPARγ 的表達(dá)。