以寨卡病毒NS3解旋酶為靶點(diǎn)的海洋天然產(chǎn)物庫的虛擬篩選與成藥性評(píng)價(jià)

曾志平

(廈門大學(xué)藥學(xué)院，福建省藥物新靶點(diǎn)研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廈門大學(xué)高通量藥物篩選平臺(tái)，福建 廈門 361102)

寨卡病毒是一種蟲媒病毒，于1947年從非洲烏干達(dá)寨卡森林中的恒河猴體內(nèi)分離；雖然其致死率較低，但是2015年在巴西爆發(fā)寨卡病毒疫情后，發(fā)現(xiàn)孕婦如果感染寨卡病毒，可能會(huì)導(dǎo)致新生兒發(fā)生小頭畸形而影響后期的發(fā)育(已超過4 000例)[1].除此之外，近期研究表明它還與成人的格利-巴利綜合征[2]、急性脊髓炎[3]、眼葡萄膜炎癥[4]及腦膜炎[5]等疾病密切相關(guān).更為嚴(yán)重的是，2017年有研究報(bào)道寨卡病毒容易發(fā)生變異，使其更具有攻擊性及毒性，從而在未來可能對(duì)人類的公共衛(wèi)生安全構(gòu)成較大的隱患[6].此外，由于人類對(duì)寨卡病毒基礎(chǔ)研究的滯后，迄今為止仍沒有相關(guān)治療寨卡病毒病的藥物上市，因此，如何開發(fā)一類治療寨卡病毒病的藥物已成為緊迫的課題[7].

寨卡病毒是由11 kb的堿基組成的一類RNA病毒，編碼3 419個(gè)氨基酸，經(jīng)過水解后可以得到以下一系列蛋白：衣殼蛋白(capsid)、包膜蛋白(envelope)、M蛋白、蛋白水解酶(NS1、NS2A、NS2B和NS3)、解旋酶(NS3)、甲基轉(zhuǎn)移酶(NS4、NS4B和NS5)及聚合酶(NS5)等[7].除M蛋白、NS2A、NS4和NS4B外，其他蛋白都有大量的晶體數(shù)據(jù)報(bào)道.隨著NS2B和NS3蛋白水解酶[8-9]、NS3 解旋酶[10]及NS5甲基轉(zhuǎn)移酶[11]等結(jié)構(gòu)的解析，基于晶體結(jié)構(gòu)的藥物虛擬篩選研究也相繼開展[12-16]，但目前還沒有得到令人興奮的結(jié)果.2017年有研究發(fā)現(xiàn)PrM蛋白上第139位絲氨酸變?yōu)樘於０房赡軙?huì)導(dǎo)致病毒攻擊性增強(qiáng)[6]，值得慶幸的是，除此之外，寨卡病毒并未發(fā)生變異，這可能與目前仍沒有藥物治療寨卡病毒病相關(guān).NS3解旋酶在寨卡病毒基因組的復(fù)制及病毒RNA的合成過程中發(fā)揮重要作用，因此成為治療寨卡病毒病的重要靶點(diǎn).

NS3解旋酶主要由3個(gè)結(jié)構(gòu)域組成.最近，Munawar等[17]利用碎片庫及核磁共振(NMR)等手段發(fā)現(xiàn)了2個(gè)可供藥物結(jié)合的新口袋(圖1和2)，引起廣泛的關(guān)注:口袋A(RNA結(jié)合位點(diǎn))是一個(gè)表面結(jié)合口袋，它對(duì)于NS3解旋酶與NS5聚合酶2個(gè)病毒蛋白的相互作用起到非常重要的調(diào)控作用，如果有化合物占據(jù)此口袋，可能使二者的相互作用消失，從而影響病毒復(fù)制復(fù)合體的形成，抑制病毒的復(fù)制;口袋B(ATP結(jié)合位點(diǎn))位于NS3解旋酶3個(gè)結(jié)構(gòu)域的交叉點(diǎn)，是一個(gè)柔性但高度保守的變構(gòu)調(diào)節(jié)口袋，使NS3解旋酶的結(jié)構(gòu)具有動(dòng)態(tài)性,而小分子在口袋B的結(jié)合會(huì)使NS3解旋酶穩(wěn)定在一個(gè)特定的構(gòu)象，從而可能破壞NS3解旋酶的正常功能.因此，口袋A和口袋B成為全新的調(diào)控NS3解旋酶生物學(xué)活性的重要口袋.

近年來，海洋天然產(chǎn)物由于其化學(xué)結(jié)構(gòu)的多樣性，越來越受到藥物化學(xué)家們的青睞[18-20].本研究擬對(duì)寨卡病毒的NS3解旋酶蛋白的上述2個(gè)口袋開展海洋天然產(chǎn)物的藥物虛擬篩選分析，并對(duì)結(jié)合較好的海洋天然產(chǎn)物進(jìn)行初步的成藥性分析，以期為尋找治療寨卡病毒病的化合物提供新思路.

(a)口袋A的表面結(jié)合部分及重要氨基酸；(b)口袋A的位置示意圖.圖1 NS3解旋酶的結(jié)構(gòu)生物學(xué)模型與口袋A的位置Fig.1 Structure biological model of NS3 helicase and the position of site A

(a)口袋B的結(jié)合部位及重要氨基酸；(b)口袋B的位置示意圖.圖2 NS3解旋酶的結(jié)構(gòu)生物學(xué)模型與口袋B的位置Fig.2 Structure biological model of NS3 helicase and the position of site B

1 研究方法

1.1 蛋白準(zhǔn)備與結(jié)合口袋分析

雖然文獻(xiàn)[17]中已報(bào)道了NS3解旋酶的2個(gè)新穎的結(jié)合口袋，但是它們與碎片分子結(jié)合的核磁結(jié)構(gòu)尚未上傳到蛋白質(zhì)晶體數(shù)據(jù)庫(PDB)以供下載，因此本研究采用文獻(xiàn)[17]中口袋A(圖1)和口袋B(圖2)附近的關(guān)鍵氨基酸來定義分子對(duì)接所需的格點(diǎn)盒子(grid box)位置，并用本課題組自行構(gòu)建的海洋天然產(chǎn)物庫的分子結(jié)構(gòu)在此口袋進(jìn)行打分評(píng)估.根據(jù)PDB ID：5Y4Z下載到NS3解旋酶的晶體結(jié)構(gòu)[21]，并用薛定諤軟件中的蛋白準(zhǔn)備模塊(protein preparation wizard)進(jìn)行蛋白的預(yù)處理，如除去晶體水分子、加上氫原子，在pH 7.0下用PROPKA程序計(jì)算每個(gè)氨基酸側(cè)鏈的質(zhì)子化狀態(tài)；然后用薛定諤軟件自帶的OPLS3e力場(chǎng)及impref腳本進(jìn)行蛋白復(fù)合體的結(jié)構(gòu)優(yōu)化，除去不合理的碰撞接觸等.

1.2 配體準(zhǔn)備

5 969個(gè)海洋天然產(chǎn)物的初步數(shù)據(jù)來源為海藻代謝物數(shù)據(jù)庫(Seaweed Metabolite Database，http:∥www.swmd.co.in/)、UNPD(Universal Natural Products Database，http:∥pkuxxj. pku. edu. cn/UNPD)天然產(chǎn)物數(shù)據(jù)庫中的海洋來源小分子及《中華海洋本草：海洋天然產(chǎn)物》[22].將前兩個(gè)數(shù)據(jù)庫的分子直接導(dǎo)入薛定諤軟件套裝并進(jìn)行三維結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)換；而對(duì)于《中華海洋本草：海洋天然產(chǎn)物》中的化合物，先用ChemDraw構(gòu)建二維結(jié)構(gòu)分子，再用Chem3D把二維結(jié)構(gòu)分子轉(zhuǎn)換為三維結(jié)構(gòu)分子，優(yōu)化的力場(chǎng)參數(shù)為MM2.搜集到的分子最后用配體準(zhǔn)備模塊(LigPrep)優(yōu)化計(jì)算后重新進(jìn)行化合物編碼，依次命名為MNPD000001～MNPD005969.

1.3 口袋A和口袋B結(jié)合位點(diǎn)的成藥性分析

用薛定諤軟件套裝的Sitemap 2.3模塊對(duì)口袋A和口袋B的結(jié)合位點(diǎn)進(jìn)行成藥性分析.以siteA-1和siteB-3兩個(gè)NMR測(cè)定的小分子位點(diǎn)作為結(jié)合口袋區(qū)域,配置參數(shù)如下：Site Point個(gè)數(shù)設(shè)置為最少15個(gè)；對(duì)疏水相互作用采用更加嚴(yán)格的條件算法，同時(shí)用經(jīng)典的格點(diǎn)文件進(jìn)行計(jì)算.

1.4 分子對(duì)接分析

基于口袋A的分子對(duì)接分析：以口袋A覆蓋的10個(gè)重要氨基酸(ARG439、VAL440、ILE441、ASN568、ILE571、MET572、MET595、ALA597、CYS600和SER601)為關(guān)鍵氨基酸(圖1(a))，首先定義這些氨基酸的坐標(biāo)中心為分子對(duì)接口袋的中心；同時(shí)，定義格點(diǎn)盒子形狀為立方體，邊長(zhǎng)為2 nm，用受體格點(diǎn)文件程序(receptor grid generation)產(chǎn)生格點(diǎn)文件.為了提高虛擬篩選的效率，采用薛定諤軟件中的HTVS、SP及XP模塊進(jìn)行逐級(jí)篩選.HTVS與SP的打分函數(shù)(Glidescore)相同，但HTVS算法通過降低尋找配體的構(gòu)象數(shù)來加速對(duì)接的過程;而XP算法的打分函數(shù)比HTVS與SP的更精細(xì)(主要增加了配體與受體的去溶劑化懲罰項(xiàng)等，從而降低了虛擬篩選過程中的假陽性率)，并充分考慮了配體與受體口袋的性狀補(bǔ)償?shù)?，因此將耗費(fèi)較長(zhǎng)的計(jì)算時(shí)間.本研究中用HTVS算法對(duì)5 969個(gè)海洋天然產(chǎn)物的小分子庫進(jìn)行初步篩選；對(duì)于得到的排名前200個(gè)化合物，進(jìn)一步用SP算法進(jìn)行中等精度的篩選;最后對(duì)于排名前50個(gè)化合物，利用高等精度的XP算法篩選并分析結(jié)果.所有篩選方法如無提及均采用默認(rèn)參數(shù).以文獻(xiàn)[17]中的碎片分子9H-嘌呤-2,6-二胺化合物作為參照物進(jìn)行XP分子對(duì)接.

基于口袋B的分子對(duì)接分析：以口袋B覆蓋的14個(gè)重要氨基酸(VAL191、ALA287、HID288、ARG298、PHE314、THR316、GLU413、THR449、ALA451、SER452、GLN455、TRP487、TYR508和GLU511)為關(guān)鍵氨基酸(圖2(a))；格點(diǎn)盒子的產(chǎn)生及參數(shù)設(shè)置、分子對(duì)接的過程及方法與口袋A的完全一致.以文獻(xiàn)[17]中的碎片分子N-(4-氯乙基)肼甲酰胺作為參照物進(jìn)行XP分子對(duì)接.

1.5 海洋天然產(chǎn)物的吸收、分布、代謝、排泄及毒性預(yù)測(cè)分析

在薛定諤軟件中的QikProp v5.7模塊下，采用正常模式對(duì)化合物進(jìn)行了基于配體的ADMET預(yù)測(cè)(ligand-based ADME/Tox prediction).QikProp v5.7主要根據(jù)95%已經(jīng)上市的藥物進(jìn)行模型訓(xùn)練，同時(shí)也對(duì)30個(gè)可能導(dǎo)致假陽性的反應(yīng)官能團(tuán)進(jìn)行了注釋，基本滿足本研究對(duì)成藥性的評(píng)價(jià)要求.對(duì)篩選得到的海洋天然產(chǎn)物進(jìn)行成藥性評(píng)估，計(jì)算的描述符及參數(shù)包括：經(jīng)典的成藥五規(guī)則評(píng)價(jià)(# stars、# rotor、donorHB、acceptHB、SASA、PSA、QPlogP油水分配系數(shù)o/w、QPlogS及違反五規(guī)則數(shù)目rule of five)、藥物代謝能力評(píng)價(jià)#metab、藥物與血漿蛋白結(jié)合能力評(píng)價(jià)QPlogKhsa、藥物人體口服吸收能力評(píng)價(jià)human oral absorption、藥物透皮吸收能力評(píng)價(jià)QPPCaco以及藥物心臟毒性評(píng)價(jià)QPlogHERG等.

2 結(jié)果與分析

2.1 基于口袋A的虛擬篩選結(jié)果分析

口袋A位于NS3和NS5蛋白的交界處，是蛋白間相互作用的重要區(qū)域，該配體結(jié)合位點(diǎn)淺，根據(jù)Sitemap 2.3模塊的計(jì)算結(jié)果表明：其成藥性計(jì)算參數(shù)如Sitescore、Dscore及Size均不如口袋B，這可能與口袋A傾向于表面結(jié)合同時(shí)缺少一個(gè)穩(wěn)固的疏水口袋相關(guān).盡管如此，此位點(diǎn)卻在病毒復(fù)制復(fù)合體的形成過程中具有非常重要的作用，其中ASN569若突變?yōu)锳LA，則病毒復(fù)制復(fù)合體無法形成，從而阻止病毒RNA的復(fù)制與傳染；而此位點(diǎn)在寨卡病毒、登革熱病毒等黃病毒屬病毒中高度保守.類似地，高度保守的堿性強(qiáng)極性氨基酸ARG439可以通過降低溶劑可極化表面極性來介導(dǎo)NS3解旋酶與其他蛋白的相互作用.此外，形成口袋A邊界的非極性氨基酸如ILE571、ILE441和ALA597也在黃病毒屬病毒中高度保守[17，23].上述關(guān)鍵氨基酸能與篩選所得的化合物產(chǎn)生重要的相互作用.首先把9H-嘌呤-2,6-二胺化合物進(jìn)行XP對(duì)接(圖3(a))，對(duì)接的結(jié)合能為-19.640 kJ/mol，且發(fā)現(xiàn)它能很好地重復(fù)文獻(xiàn)[17]中的結(jié)果，即主要氨基酸的氫鍵長(zhǎng)度均與NMR數(shù)據(jù)一致，證明了本研究中對(duì)接參數(shù)設(shè)置的準(zhǔn)確性；但其分子較小，因此無法與關(guān)鍵氨基酸ARG439、ASN568發(fā)生明顯的相互作用.最終進(jìn)入XP對(duì)接的化合物結(jié)合能范圍為-6.280～-41.307 kJ/mol，因此本研究取優(yōu)于9H-嘌呤-2,6-二胺化合物(即結(jié)合能低于-19.640 kJ/mol)且與口袋的關(guān)鍵氨基酸有重要相互作用的分子進(jìn)行分析；由于篇幅有限，本文中僅展示最具有結(jié)構(gòu)代表性的5個(gè)化合物的對(duì)接分析結(jié)果(圖3(b)～(f)，附錄(http:∥jxmu.xmu.edu.cn/upload/html/20190605.html)表S1).

化合物分子中綠色表示碳原子，藍(lán)色表示氮原子，灰色表示口袋的氨基酸，紅色表示氧原子，黃色表示硫原子(下同).圖3 海洋天然產(chǎn)物與寨卡病毒NS3解旋酶口袋A的分子對(duì)接分析Fig.3 Molecular docking analyses of marine natural products towards the binding site A of NS3 helicase of Zika virus

1) divanchrobactin(MNPD001378)：該化合物為棕黃色油狀物，由Sandy等[24]于2010年報(bào)道，從海洋弧菌Vibriosp.DS40M4中分離得到，目前尚無生物學(xué)活性的相關(guān)報(bào)道.通過XP算法計(jì)算，divanchrobactin的結(jié)合能為-41.307 kJ/mol，遠(yuǎn)低于碎片分子9H-嘌呤-2,6-二胺化合物的結(jié)合能，原因可能是該分子類似于四肽分子，分子質(zhì)量和體積較大，官能團(tuán)豐富，與口袋A表面結(jié)合位點(diǎn)的氨基酸存在較多的相互作用(圖3(b))，如：2個(gè)精氨酸側(cè)鏈和絲氨酸側(cè)鏈能與口袋A的CYS600、ASN568、ASN569、THR570、ILE571和MET572等主鏈酰胺鍵存在不同程度的相互作用，這與9H-嘌呤-2,6-二胺化合物的相互作用類似但更豐富;此外，其首尾的苯二酚結(jié)構(gòu)能與SER365的側(cè)鏈羥基形成鍵長(zhǎng)0.293 nm的強(qiáng)氫鍵，與ALA443的酰胺鍵形成鍵長(zhǎng)0.271 nm的強(qiáng)氫鍵，同時(shí)苯環(huán)區(qū)域還能與口袋A中保守的關(guān)鍵疏水氨基酸ILE441等形成疏水相互作用.上述這些使divanchrobactin獲得了額外的結(jié)合能.

2) bromophenol(MNPD005219)：該化合物為白色針狀物，屬于含溴多酚類化合物，由Fan等[25]于2003年從紅藻(Rhodomelaconfervoides)中提取分離得到;它含有5個(gè)溴原子，是海洋天然產(chǎn)物的一個(gè)典型特征，有降糖及抗肥胖作用[26].該化合物與NS3解旋酶的結(jié)合能為-27.888 kJ/mol，其中主要的相互作用為5個(gè)酚羥基均與氨基酸主鏈形成較強(qiáng)的氫鍵，而5個(gè)溴原子對(duì)結(jié)合能的作用不明顯;與divanchrobactin不同的是，其中一個(gè)溴原子能與口袋A中關(guān)鍵氨基酸ARG439的胍基有較好的接觸，這可能類似于同主族的氟原子有類氫鍵的相互作用;與此同時(shí)，該化合物還與保守氨基酸ALA597和ILE571具有較強(qiáng)的疏水相互作用(圖3(c)).

3) 2-hydroxy-1′-methylzeatin(MNPD000865)：該化合物為細(xì)胞分裂素(cytokinin),來源于綠藻[27-28]，其結(jié)構(gòu)較小，與碎片分子9H-嘌呤-2,6-二胺化合物具有相同的母核，因此結(jié)合方式也與之非常類似.由于cytokinin的五六元環(huán)上缺少氨基，所以它的羥基代替氨基可與CYS600、MET572的羰基形成較強(qiáng)的氫鍵(鍵長(zhǎng)分別為0.386和0.279 nm),而五六元環(huán)上的2個(gè)氫鍵與9H-嘌呤-2,6-二胺化合物的幾乎一致;不同的是，cytokinin的烯丙位的羥基與LEU442的羰基形成額外的氫鍵(鍵長(zhǎng)0.266 nm)，這也是cytokinin稍優(yōu)于9H-嘌呤-2,6-二胺化合物的原因;此外，該化合物還與關(guān)鍵氨基酸ALA597和ILE571形成較強(qiáng)的疏水相互作用(圖3(d)).

4) garveatin E(MNPD002933)：該化合物于2006年從東北太平洋海洋水螅體Garveiaannulata中分離得到[29]，并被證明是吲哚胺2,3-雙加氧酶的抑制劑.該化合物是三環(huán)結(jié)構(gòu)，且沒有氮原子的存在，這大大削弱了類似于9H-嘌呤-2,6-二胺化合物的氫鍵相互作用，因此其結(jié)合能不低(-21.817 kJ/mol)；其作用方式主要是利用母核上的羰基與羥基分別與ARG439的胍基、MET572和ASN569的酰胺鍵形成強(qiáng)氫鍵；與此同時(shí)，三環(huán)結(jié)構(gòu)能與CYS600、ALA597、MET595、ILE571和ILE441發(fā)生疏水相互作用從而促進(jìn)garveatin E與口袋A的結(jié)合(圖3(e)).

5) 2-hydroxy-6-methylaminopurine(MNPD000958)：該化合物早期從綠藻和藍(lán)珊瑚中分離得到，屬于細(xì)胞分裂素的一種[30]，與cytokinon及9H-嘌呤-2,6-二胺化合物的結(jié)構(gòu)很類似.目前它已被開發(fā)為單磷酸腺苷依賴型蛋白激酶(AMPK)的激動(dòng)劑[31]，用于治療代謝性疾病.其結(jié)合能為-19.720 kJ/mol,與9H-嘌呤-2,6-二胺化合物的相當(dāng)，且結(jié)合方式分析表明兩者的氫鍵相互作用幾乎一致，但此化合物的2位羥基由于氫鍵的飽和性，只能與MET572形成單氫鍵，而難以與CYS600的酰胺基再形成氫鍵;還有一處不同的是，此化合物6位氨基的甲基化可能與保守且重要的ALA597存在疏水相互作用而會(huì)稍微改善結(jié)合能，這是由于它附近無氫鍵受體能與之相互作用，而雜芳香環(huán)可與保守的ILE571發(fā)生疏水相互作用從而增強(qiáng)其結(jié)合能力(圖3(f)).

綜上，共剖析了5個(gè)海洋天然產(chǎn)物在口袋A的相互作用:由于口袋A的可開放性，它能容納分子質(zhì)量較大的小分子；該口袋主要通過氫鍵網(wǎng)絡(luò)來維持配體的相互作用，且這些相互作用在5個(gè)海洋天然產(chǎn)物中較保守，與文獻(xiàn)[17]的結(jié)果類似.因此，上述證據(jù)暗示這5個(gè)化合物可能是寨卡病毒NS3解旋酶的配體.

2.2 基于口袋B的虛擬篩選結(jié)果分析

與口袋A完全不同，口袋B的結(jié)合位點(diǎn)深埋在蛋白內(nèi)部且空間狹長(zhǎng)，位于NS3解旋酶3個(gè)結(jié)構(gòu)域的交界處(圖2)，但與RNA結(jié)合位點(diǎn)又有所差別.該結(jié)合位點(diǎn)的氨基酸呈疏水區(qū)(THR316、VAL191、ALA287、PHE314、TYR508和TRP487)和親水區(qū)(HID288、GLU413、SER452、THR449和GLN455)兩極分布，且在人類所有的黃病毒屬病毒(如登革熱病毒、昆津病毒、谷腦炎病毒等)中高度保守，暗示口袋B可能是非常重要的影響NS3解旋酶結(jié)構(gòu)與功能的結(jié)合口袋.這也與文獻(xiàn)[17]中N-(4-氯乙基)肼甲酰胺的分子結(jié)構(gòu)形狀相互匹配.基于Sitemap 2.3模塊的口袋成藥性分析表明：對(duì)于優(yōu)化后的NS3解旋酶，口袋B具有比口袋A更好的成藥性.Sitescore作為判斷藥物結(jié)合與否的重要依據(jù)，默認(rèn)計(jì)算值大于0.8的即可作為藥物結(jié)合口袋,而口袋B的計(jì)算值為1.14，暗示該處是一個(gè)強(qiáng)的藥物結(jié)合口袋.而作為區(qū)分成藥性與非成藥性的Dscore參數(shù)，口袋B的計(jì)算值也達(dá)到0.96，滿足口袋成藥性的要求.對(duì)該化合物進(jìn)行重新對(duì)接分析(圖4(a))，其結(jié)合能為-21.227 kJ/mol，稍優(yōu)于9H-嘌呤-2,6-二胺化合物在口袋A的結(jié)合能.其結(jié)合方式主要依靠疏水的苯環(huán)區(qū)域及極性末端與極性氨基酸的相互作用；而進(jìn)入XP算法對(duì)接的化合物結(jié)合能范圍為-6.816～-35.173 kJ/mol，因此本研究取優(yōu)于N-(4-氯乙基)肼甲酰胺化合物(即結(jié)合能低于-21.227 kJ/mol)且與口袋的關(guān)鍵氨基酸有重要相互作用的結(jié)果進(jìn)行分析；由于篇幅有限，本文中也僅展示最具有結(jié)構(gòu)代表性的5個(gè)化合物的對(duì)接分析結(jié)果(圖4(b)～(f)與附錄表S2).

圖4 海洋天然產(chǎn)物與寨卡病毒NS3解旋酶口袋B的分子對(duì)接分析Fig.4 Molecular docking analyses of marine natural products towards the binding site B of NS3 helicase of Zika virus

1) aromatic polyketides(MNPD001827)：該化合物為黃色針狀物，屬于芳香聚酮類化合物，由Du等[32]于2008年從海洋真菌白曲霉(Aspergillusglaucus)中分離得到.該類化合物有一個(gè)芳香性的疏水雙環(huán)，同時(shí)以多羥基糖環(huán)作為極性基團(tuán)結(jié)尾，這樣的結(jié)構(gòu)與N-(4-氯乙基)肼甲酰胺化合物很類似，這也是它用Glide計(jì)算所得結(jié)合能最低(-35.173 kJ/mol)的原因.相互作用分析表明：芳香環(huán)能與口袋B的關(guān)鍵氨基酸如PRO320和HID288等存在疏水相互作用；與此同時(shí)，芳香環(huán)的羥基能與THR318主鏈的羰基形成鍵長(zhǎng)0.337 nm的中等強(qiáng)度氫鍵；而五元糖環(huán)能與THR449和SER452等關(guān)鍵氨基酸形成至少4個(gè)氫鍵(圖4(b)).正是如此多的相互作用才使該化合物在口袋B上對(duì)NS3解旋酶具有很強(qiáng)的結(jié)合能力.

2) dimeric terrestrols(MNPD001354)：該化合物由Chen等[33]于2008年從海洋真菌青霉菌(Penicilliumterrestre)中分離得到，其分子結(jié)構(gòu)特征也與N-(4-氯乙基)肼甲酰胺化合物類似，但結(jié)合能較低(-28.558 kJ/mol).其苯環(huán)上的4個(gè)羥基均能與口袋B的關(guān)鍵極性氨基酸(如GLU413和SER452等)形成強(qiáng)氫鍵(鍵長(zhǎng)0.276～0.313 nm)，這與aromatic polyketides類似(圖4(c));但由于疏水作用對(duì)象由萘環(huán)變?yōu)楸江h(huán)，該部分的貢獻(xiàn)值降低，這也是該化合物的結(jié)合能高于aromatic polyketides的根本原因.

3) 6-(methylamino)-3,7-dihydro-2H-purin-2-one(MNPD005912)：該化合物可以看作2-hydroxy-6-methylaminopurine的互變異構(gòu)體.該化合物在口袋B上的結(jié)合能卻比在口袋A上的要低6.808 kJ/mol，說明該化合物可以選擇性地結(jié)合到口袋B而非口袋A.雖然此類化合物的分子質(zhì)量較小，但是相互作用分析表明：它與口袋B的關(guān)鍵且保守極性氨基酸(如THR449和HID288等)可形成5個(gè)強(qiáng)氫鍵(圖4(d))，遠(yuǎn)超過與口袋A的3個(gè)氫鍵;此外，口袋B的芳香性氨基酸TRP487能與其五六元環(huán)存在π-π堆積作用，這也是它具有結(jié)合位點(diǎn)偏好性的根本原因.

4) 4,5-dibromopyrrole-2-carbonamide(MNPD000526)：該化合物早期從海綿Agelasdendromorpha中獲得[34]，雖具有芳香性基團(tuán)，但由于溴原子參與形成氫鍵的能力較弱(圖4(e))，其結(jié)合能(-25.900 kJ/mol)略高于6-(methylamino)-3,7-dihydro-2H-purin-2-one.

5)R-allantoin(MNPD001587)：該化合物從沿海植物紫草(Mertensiamaritima)中分離得到[35]，雖然有氫鍵給體與受體能力，但是分子沒有芳香性且分子體積較小，無法達(dá)到與極性氨基酸相互作用的程度(圖4(f))，這也是它結(jié)合能較高的根本原因.

綜上，口袋B的虛擬篩選結(jié)果表明：此口袋偏好芳香性官能團(tuán)及氫鍵給體與受體官能團(tuán);同時(shí)口袋B屬于隧道形結(jié)構(gòu)，因此無法容納分子體積較大的分子，這也是它與具有表面結(jié)合性質(zhì)的口袋A不同的地方.

2.3 篩選化合物的ADMET預(yù)測(cè)與分析

對(duì)上述10個(gè)海洋天然產(chǎn)物進(jìn)行藥物ADMET(即吸收、分配、代謝、排泄和毒性)預(yù)測(cè)分析，結(jié)果表明(表1)：大部分化合物滿足成藥性的各項(xiàng)指標(biāo)要求，但divanchrobactin (MNPD001378)的成藥性偏差，有3條違反成藥五原則.其屬于擬四肽，氫鍵給體與受體偏多，且在代謝過程中極有可能發(fā)生代謝反應(yīng)，口服吸收利用率低，雖然它能很好地與口袋A結(jié)合，但是從成藥性來看反而不是最佳的化合物.而與口袋B結(jié)合最好的化合物aromatic polyketides(MNPD001827)有人類果蠅相關(guān)基因(hERG)編碼的K+通道阻斷的風(fēng)險(xiǎn)，可能具有一定的心臟毒性.R-allantoin(MNPD001587)的QPPCaco值低于25，暗示該化合物經(jīng)過腸道吸收不好.而另外2個(gè)化合物4,5-dibromopyrrole-2-carbonamide(MNPD000526)與MNPD004936的腸道吸收指標(biāo)都很好(QPPCaco值大于500)，這也與它們對(duì)應(yīng)有較高的人體口服吸收度(80.260%和89.293%)一致.

3 結(jié) 論

本研究針對(duì)寨卡病毒NS3 解旋酶的2個(gè)新穎結(jié)合位點(diǎn)，運(yùn)用分子對(duì)接技術(shù)對(duì)包含5 969個(gè)海洋天然產(chǎn)物的自建庫開展虛擬篩選，并根據(jù)打分函數(shù)及結(jié)構(gòu)多樣性的原則，挑選了10個(gè)化合物進(jìn)行對(duì)接口袋的詳細(xì)分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)這些化合物的結(jié)合方式與報(bào)道的碎片分子一致，但結(jié)合能力卻有大幅度提升，暗示它們可以更好地靶向NS3解旋酶，從而成為潛在治療寨卡病毒病的海洋天然產(chǎn)物；且初步的成藥性評(píng)估表明除divanchrobactin(MNPD001378)外，本文中所述的海洋天然產(chǎn)物都滿足成藥性要求，為后期這些化合物進(jìn)行實(shí)驗(yàn)測(cè)試提供了理論支撐.

致謝：薛定諤公司提供了薛定諤軟件套裝，海洋天然產(chǎn)物庫由劉詩婷、楊燦原、鞠芮及王鑫構(gòu)建提供，在此一并感謝.