高危型人乳頭狀瘤病毒載量和Th1/Th2不均衡表達對宮頸病變進程的影響

鄒晶晶,朱小飛,余 楊

(1.焦作市第二人民醫(yī)院檢驗科，河南 焦作 454150；2.新鄉(xiāng)醫(yī)學院分子診斷與醫(yī)學檢驗技術河南省協(xié)同創(chuàng)新中心，河南 新鄉(xiāng) 453003)

宮頸癌在女性惡性腫瘤中發(fā)病率僅次于乳腺癌，其病率呈逐年升高趨勢，高危型人乳頭狀瘤病毒(high risk-human papillomavirus，HR-HPV)持續(xù)性感染是導致宮頸上皮內瘤變(cervical intraepithelial neoplasia，CIN)及宮頸癌的主要病因[1-3]。HPV感染很普遍，大多數(shù)人可以自然消退，即使感染了高危亞型，也未必發(fā)展為癌。HPV誘發(fā)的宮頸病變的轉歸與宮頸局部微環(huán)境密切相關。免疫和炎癥是宮頸微環(huán)境的基本特征。腫瘤細胞轉化由固有的基因改變決定，但腫瘤進展受腫瘤微環(huán)境、炎癥和免疫反應控制[4-6]。作為重要的免疫效應細胞，輔助性T細胞(helper T cell，Th)通過分泌特異的細胞因子而發(fā)揮免疫調控功能。在不同抗原的刺激下，Th可分化為Th1與Th2 亞群，2類細胞相互制約、交互調節(jié)，共同維持機體的免疫穩(wěn)態(tài)，一旦平衡被打破，機體處于Th1優(yōu)勢或Th2優(yōu)勢，則導致各種病理反應、病變趨向，甚至發(fā)生腫瘤。本研究通過比較宮頸病變不同階段局部微環(huán)境中Th1和Th2細胞因子的表達以及HR-HPV DNA對感染狀態(tài)的量化監(jiān)測，分析免疫、感染、局部微環(huán)境三者相互作用的多樣表現(xiàn)及其在宮頸癌和癌前病變的差異性；研究HR-HPV、Th1/Th2細胞因子的變化與宮頸病變發(fā)展趨勢的聯(lián)系；探討從炎癥到癌轉化過程中可能的免疫學機制，為建立高級別CIN和宮頸癌的分流診治提供臨床支持。

1 資料與方法

1.1 一般資料選擇焦作市第二人民醫(yī)院2012年1月至2015年9月收治的339例HR-HPV持續(xù)性感染的不同宮頸病變患者為研究對象，其中CIN I 級71例(CIN I組)、CIN Ⅱ 級66例(CIN Ⅱ組)、CIN Ⅲ 級77例(CIN Ⅲ組)，宮頸癌125例(宮頸癌組)，均經(jīng)病理學檢查確診。所有患者入院前未接受宮頸物理治療、手術治療、放射治療和化學治療；既往無其他系統(tǒng)腫瘤病史；無子宮切除手術史；無免疫系統(tǒng)缺陷疾病史；近期未使用過免疫抑制類藥物。患者本人均知情同意，隨訪資料完整。持續(xù)性HR-HPV感染的定義[7-8]：HR-HPV感染者第1年每4個月隨訪1次，以后至少6個月隨訪1次，持續(xù)2 a以上，同一患者的宮頸檢測樣本均顯示HR-HPV陽性且為同種類型。另選擇HPV陰性且細胞學檢查為正常宮頸的40例健康體檢者作為對照組。CIN I組患者年齡 34～62(46.45±7.88)歲，CIN Ⅱ組患者年齡34～61(47.56±8.83)歲，CIN Ⅲ組患者年齡35～62(47.86±9.28)歲，宮頸癌組患者年齡34～62(47.05±8.60)歲，對照組受試者年齡34～62(46.55±9.36)歲；各組受試者年齡比較差異均無統(tǒng)計學意義(χ2=0.136，P>0.05)，具有可比性。

1.2 主要試劑與儀器白細胞介素(interleukin，IL)-2、干擾素-γ(interferon-γ，IFN-γ)、腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)和IL-4、IL-6、IL-10檢測試劑盒均購自上海江萊生物科技有限公司；DA7600型聚合酶鏈反應(polymerase chain reaction，PCR)擴增儀、高危型HPV核酸定量(16、18、31、33、45、52、56、58共8個型)檢測試劑盒購自中山大學達安基因公司。

1.3 宮頸分泌物中HR-HPV DNA定量檢測無菌條件下采用宮頸刷插入受試者宮頸內，旋轉數(shù)周后停留片刻取出，將宮頸刷置入無菌管。將采集的宮頸分泌物及時送檢或4 ℃保存，1周內檢測。DNA提取和PCR擴增具體操作嚴格按照說明書進行。

1.4 宮頸灌洗液中細胞因子的檢測將2 mL無菌磷酸鹽緩沖液(pH 7.4)注入宮頸管內，收集宮頸灌洗液。將采集的灌洗液3 500 r·min-1離心10 min，分離上清液，立即進行檢測或置-20 ℃冰箱保存待測。用雙抗體夾心酶聯(lián)免疫吸附試驗法檢測宮頸灌洗液中IL-2、IFN-γ、TNF-α、IL-4、IL-6、IL-10的含量，操作過程嚴格按照說明書進行。

2 結果

2.1 5組受試者宮頸分泌物中HR-HPV DNA載量及宮頸灌洗液中細胞因子水平比較結果見表1。各組受試者宮頸分泌物中HR-HPV DNA載量及宮頸灌洗液中IL-2、IL-4、IL-6、IL-10、IFN-γ、TNF-α水平總體上比較差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。CIN Ⅱ組和CIN Ⅲ患者宮頸分泌物中HR-HPV DNA載量比較差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，其余各組患者宮頸分泌物中HR-HPV DNA載量兩兩比較差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。CIN I組、CIN Ⅱ組、CIN Ⅲ組及宮頸癌組患者宮頸灌洗液中IL-2、IFN-γ、TNF-α、IL-4、IL-6、IL-10水平均高于對照組，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。CIN I組、CIN Ⅱ組、CIN Ⅲ組及宮頸癌組患者宮頸灌洗液中IL-2、IFN-γ、TNF-α水平呈逐漸降低趨勢，IL-4、IL-6、IL-10水平呈逐漸升高趨勢。其中CIN Ⅱ組和CIN Ⅲ組患者宮頸灌洗液中IFN-γ、TNF-α、IL-4、IL-6水平比較差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，其余各宮頸病變組兩兩比較差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；各宮頸病變組患者宮頸灌洗液中IL-2、IL-10水平兩兩比較差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。對照組、CIN Ⅰ組、CIN Ⅱ組TNF-α/IL-10比值比較差異均無統(tǒng)計學意義(P>0.05)；CIN Ⅲ組宮頸癌組患者TNF-α/IL-10比值顯著小于對照組、CIN I組、CIN Ⅱ組，差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；宮頸癌組患者TNF-α/IL-10比值小于CIN Ⅲ組，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。

表1 各組受試者宮頸分泌物中 HR-HPV DNA載量及宮頸灌洗液中細胞因子水平比較

組別nIL-2/(ng·L-1)IFN-γ/(ng·L-1)TNF-α/(ng·L-1)IL-4/(ng·L-1)IL-6/(ng·L-1)IL-10/(ng·L-1)HR-HPV DNAIFN-γ/TNF-α對照組4016.30±2.375.16±0.268.07±0.147.57±1.327.61±2.597.27±2.09-1.26±0.73CIN Ⅰ組7138.42±11.7a12.79±1.62a 14.77±3.65a 9.24±1.43a 20.61±6.59a 13.04±2.03a 5.35±0.981.29±0.34CIN Ⅱ組6625.77±8.06ab9.35±1.38ab14.02±1.71ab15.75±3.05ab27.55±3.86ab17.47±4.12ab5.66±0.48b1.18±0.31CIN Ⅲ組7721.87±6.22abc9.14±1.34ab10.83±1.80ab16.18±2.77ab28.58±6.45ab33.00±8.71abc5.83±0.67b0.82±0.21abc宮頸癌組12519.38±5.05abcd5.86±0.81abcd9.23±1.94abcd23.48±2.25abcd49.47±15.55abcd69.60±25.15abcd6.21±1.10abcd0.41±0.83abcdF82.640472.22090.220547.61146.031209.82115.151117.770P0.0000.0000.0000.0000.0000.0000.0000.000

注：與對照組比較aP<0.05；與CINⅠ組比較bP<0.05；與CINⅡ組比較cP<0.05；與CIN Ⅲ組比較dP<0.05；“-”無數(shù)據(jù)。

2.2 HR-HPV DNA載量與6種細胞因子的關系結果見表2。多元線性回歸分析顯示，IL-2、IL-4與HR-HPV DNA載量無線性關系(P>0.05)，未進入回歸方程；IL-6、IL-10、IFN-γ、TNF-α與HR-HPV DNA載量存在線性關系(P<0.05)，HR-HPV DNA=6.852-0.010IL-6+0.008IL-10-0.036 TNF-α-0.066 IFN-γ，與HR-HPV載量的密切程度依次為IL-10>IL-6>IFN-γ>TNF-α。

表2 HR-HPV DNA裁量與6種細胞因子的關系分析

Tab.2 Multivariate linear regression analysis of the relationship between the HR-HPV load and six cytokines

非標準回歸系數(shù)B 標準誤差 標準回歸系數(shù)tP常量6.8520.44314.9760.000IL-100.0080.0020.299 3.9980.000IL-6-0.0100.004-0.251-1.7430.000IFN-γ-0.0660.032-0.211-1.6010.011TNF-α-0.036 0.019-0.167-1.8640.048

3 討論

從HPV感染到CIN再到宮頸癌是感染至慢性炎癥再到癌變的過程，因此，宮頸癌是一種與炎性反應密切相關的腫瘤。免疫應答和免疫逃逸在炎癥向癌轉化過程中發(fā)揮重要作用。Th1細胞分泌的IL-2、IFN-γ、TNF-α具有免疫保護作用，在病毒清除和癌性炎癥反應中發(fā)揮重要作用；Th2細胞分泌的IL-4、IL-6、IL-10可破壞機體的免疫系統(tǒng)，促進腫瘤浸潤和轉移，嚴重干擾機體的抗腫瘤免疫[9]。Th1和Th2細胞因子可以相互下調對方的生長、分化，刺激自身增殖。Th1/Th2平衡是促炎和抗炎因子之間的平衡，也是促瘤和抗瘤作用因子的平衡。隨著微環(huán)境的變化，Th1與Th2數(shù)量發(fā)生改變，二者比例失衡，由此產(chǎn)生不同的功能效應。

本研究結果顯示，CINⅠ階段即有細胞因子的異常表達，Th1和Th2型細胞因子均高于對照組，以Th1型細胞因子中的IL-2、IFN-γ為著，TNF-α/IL-10比值無明顯變化，提示Th1/Th2相對平衡；CIN Ⅱ階段較CINⅠ階段明顯變化的細胞因子是IL-2、IFN-γ、IL-4、IL-6，有Th1優(yōu)勢表達的趨勢，TNF-α/IL-10比值略下降，Th1/Th2基本平衡；CIN Ⅲ階段TNF-α/IL-10比值急劇下降，Th1/Th2明顯失衡，呈現(xiàn)Th2優(yōu)勢表達模式，直至宮頸癌變階段。這些變化提示HR-HPV感染干擾了Th1/Th2的平衡表達，由 CIN Ⅰ→CIN Ⅱ→CIN Ⅲ→宮頸癌，Th1向Th2的總體偏移趨勢參與影響宿主對病毒正確的免疫識別，從而促進宮頸病變的持續(xù)發(fā)展。

在病變的不同階段，免疫系統(tǒng)的作用和表現(xiàn)是不同的，呈現(xiàn)階段依賴性的變化模式：CIN低度病變時，即有各種細胞因子異常表達； CIN中度病變時，各種細胞因子的調控作用此消彼長，雖有單個細胞因子如IL-2、IL-4、IL-6表達的突出變化，但整個Th1/Th2細胞因子網(wǎng)絡仍能維持基本平衡。Th2細胞因子模式的轉變在CIN Ⅲ級病變中較為明顯，CIN Ⅲ級至宮頸癌發(fā)生發(fā)展過程中，Th2細胞因子的負向免疫抑制作用明顯高于Th1細胞因子的正向免疫保護作用。這一方面體現(xiàn)了機體免疫調控的精細化，機體可通過自我調節(jié)限制應答的強度，維護過度激活、異常表達和有效免疫效應之間的平衡，維護促癌/抗癌、促炎/抗炎微環(huán)境之間的平衡。另一方面反映了機體免疫調控的復雜性，免疫細胞之間，外來抗原HPV和免疫細胞之間，HPV、免疫細胞與局部微環(huán)境之間均存在相互制約、相互調節(jié)的交互作用和交聯(lián)影響。因此，在監(jiān)測和評價免疫系統(tǒng)在HPV宮頸病變進程中的作用時，不僅要考慮Th細胞因子數(shù)量的變化，更要注重Th1與Th2的比例關系，免疫反應活躍即有細胞因子數(shù)量的變化，但Th1/Th2細胞因子比例失衡，Th2優(yōu)勢表達的免疫功能失調，可使宮頸微環(huán)境免疫抑制加重，進一步干擾機體對HPV復制的免疫控制，使得病毒大量復制，導致慢性持續(xù)性感染日漸嚴重，從而打破了機體微環(huán)境抗癌/促癌的內在平衡，進一步加劇了從CIN到宮頸癌的順向發(fā)展。由此可見，免疫抑制在HPV宮頸病變由量變到質變整個鏈條中的重要作用，這與文獻報道宮頸癌的免疫狀態(tài)為免疫耐受或免疫逃逸一致[10]。

有研究報道，血清細胞因子水平與HPV感染的清除或持續(xù)無關[11]，這與本研究結果不同但并不矛盾，主要原因為腫瘤在演進的過程中，各階段的HPV載量和細胞因子均與其周圍環(huán)境交互作用，由此形成的免疫微環(huán)境是有別于人體正常內環(huán)境的復雜系統(tǒng)，HPV感染局限于皮膚黏膜表皮細胞層，不形成病毒血癥，局部黏膜免疫系統(tǒng)具有獨特的區(qū)域免疫特性。CD4+T細胞既能在沒有CD8+T細胞的情況下，獨立將腫瘤細胞清除，還能輔助CD8+T細胞激活，并通過表達趨化因子重塑腫瘤微環(huán)境[12]，在適應性免疫應答中處于中心地位，在宮頸病變HPV感染以外的部位T細胞不直接接觸抗原，無法啟動免疫識別機制，無相應的免疫應答產(chǎn)生。

目前，關于HR-HPV病毒載量與宮頸病變程度的關系尚存在一定的爭議，有研究認為，HR-HPV載量與宮頸病變程度相關[13]，也有相反的報道[14]。本研究結果顯示，在CIN Ⅱ組和CIN Ⅲ組患者HR-HPV DNA載量比較差異無統(tǒng)計學意義，該2組患者HR-HPV DNA載量高于CIN Ⅰ組，低于宮頸癌組，這些均證實了HR-HPV持續(xù)性感染是宮頸癌發(fā)生的必要而非充分條件，需要免疫體系協(xié)同作用。但有證據(jù)表明，慢性炎癥可通過誘導促炎介質和免疫抑制細胞的積聚或激活而誘導或加重免疫抑制[15]，因此，對HR-HPV持續(xù)感染者仍應堅持隨訪，并動態(tài)監(jiān)測HR-HPV DNA載量。