青海省部分地區(qū)馬鈴薯Y病毒cp基因序列分析

程 亮

(1.青海省農(nóng)林科學院 植物保護研究所，青海省農(nóng)業(yè)有害生物綜合治理重點實驗室，青海 西寧 810016； 2.青海大學，省部共建三江源生態(tài)與高原農(nóng)牧業(yè)國家重點實驗室，青海 西寧 810016)

馬鈴薯在保障我國糧食安全，促進農(nóng)業(yè)增效、農(nóng)民增收、振興農(nóng)業(yè)經(jīng)濟方面具有重要意義[1]。青海省位于黃土高原和青藏高原交匯地帶，生態(tài)類型復雜，海拔較高，氣候冷涼，秋季雨多，作物生長周期長，日照充足，晝夜溫差大，土壤疏松富含鉀，無污染，有著適宜馬鈴薯生長的得天獨厚的氣候資源[2]。在馬鈴薯生長過程中，常受到多種病害的侵擾[3-4]，其中，馬鈴薯Y病毒(Potato virus Y，PVY)是目前青海省感染馬鈴薯并造成最嚴重經(jīng)濟損失的病毒之一[5]。PVY是馬鈴薯Y病毒屬(Potyvirus)的代表成員[6-7]，其寄主范圍十分廣泛，自然條件下超過9個科包括茄科在內(nèi)的14個屬[8]，能夠引起馬鈴薯花葉、黃化、矮縮等病癥，導致產(chǎn)量和品質(zhì)下降。

馬鈴薯Y病毒的基因組全長約9.7 kb，是一種正義單鏈RNA病毒[9]。作為RNA病毒，PVY具有明顯的株系分化現(xiàn)象，PVY株系原本有PVYO株系、PVYN株系和PVYC株系3種，又產(chǎn)生了PVYNTN株系[10-11]、PVYNW株系[12-13]、PVYN∶O株系[14]、PVYNA-NTN株系[15]、PVYZ株系[16]等新株系。關(guān)于對PVY新分離物株系檢測，目前研究人員一般通過個別基因(和/或其編碼產(chǎn)物)[17]或全基因組序列[18]的同源度比對結(jié)果來確定其株系類別，或通過血清型[19]、基因組重組與否[20]、馬鈴薯塊莖壞死環(huán)斑病效應[21]、過敏反應互作基因[22]這些標準來確定其株系類別。鑒于PVY株系群體的復雜性，而上述PVY株系分類方法都無法完全區(qū)分所有PVY株系類別，存在這樣或那樣的缺陷[23]。近年來，隨著測序技術(shù)的成熟，通過基因組差異區(qū)段的短序列測序來鑒定PVY株系是目前最接近基序測序分類法的思路，其中一個差異區(qū)段位于外殼蛋白產(chǎn)物中，外殼蛋白(coat protein，cp)是PVY10個重要的結(jié)構(gòu)蛋白之一[24-25]，由801個核苷酸組成，編碼267個氨基酸。通過焦磷酸測序法進行短序列測序，從馬鈴薯病株上鑒定了一些PVY株系[26-27]。因此，cp基因序列分析在一定程度上對闡明PVY分類具有一定的參考作用。目前已報道的PVY在自然條件下極易發(fā)生基因重組或突變而產(chǎn)生具有不同致病力的新株系，而青海省的PVY株系的組成是什么，是否已經(jīng)產(chǎn)生了新的株系，尚未見到系統(tǒng)的研究報道，因此，研究青海馬鈴薯Y病毒的株系類別有助于了解該病毒的變異類型和流行區(qū)域的形成。本研究以青海地區(qū)流行的馬鈴薯Y病毒的cp基因進行測序分析，研究其分子變異，有助于掌握該病毒的類型和分布，為制定PVY的綜合防控策略提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

2016年5月—8月，在馬鈴薯生長期對青海省的馬鈴薯主產(chǎn)區(qū)進行田間調(diào)查，調(diào)查方法為隨機取樣，采集帶有皺縮、重度花葉、黃化等明顯癥狀的馬鈴薯葉片，新鮮樣本置于密封袋中，保存于-80 ℃超低溫冰箱。調(diào)查縣區(qū)包括樂都、民和、互助、湟中、湟源、平安、大通和西寧(表1)。

1.2 試劑

Trizol、DEPC、TransScript First-Strand cDNA購于Sigma公司；DNA Marker、Gel Purification Kit購于天根生化科技(北京)有限公司；EcoRⅠ限制性內(nèi)切酶購于Promega公司；RNase抑制劑、T4 DNA連接酶、瓊脂糖凝膠回收試劑盒、pGM-T easy PCR產(chǎn)物克隆試劑盒、質(zhì)粒小提試劑盒購于北京天為時代科技有限公司；引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成；其他化學試劑均為分析純。

1.3 引物設(shè)計與合成

PVY的cp基因在不同的PVY株系中具有高度保守性，因此根據(jù)GenBank已公布的PVY常見株系cp基因的序列保守區(qū)，用DNAMAN軟件進行引物設(shè)計，上游引物YCP1:5′-AACATAGGCTTGAGGCGA-3′；下游引物YCP2:5′-ATGACGAAATCACCCTGC-3′。引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。

1.4 馬鈴薯總RNA的提取

按照Trizol(Invitrogen)試劑盒提取樣品總RNA。提取試驗的所有離心操作均在4 ℃下完成，用微量核酸測定儀(NanoDrop One)測定RNA濃度及純度，用電泳法檢測RNA完整性，然后-70 ℃超低溫冰箱保存。

1.5 RT-PCR擴增PVY cp基因

1.5.1 cDNA第一鏈的合成

以感染PVY的馬鈴薯葉片總RNA為模板，逆轉(zhuǎn)錄反應體系為20 μL，取植物總RNA提取液3 μL(0.4 μg·樣品-1)，72 ℃變性后立即置于冰上，加入下述反應混合液：M-MLV RT-Buffer 4 μL，10 mmol·L-1dNTPs 4 μL，40 U·μL-1RNasin 1 μL，10 pmol·μL-1PVY下游引物1 μL，200 U·μL-1M-MLV反轉(zhuǎn)錄酶0.5 μL，DEPC處理水6.5 μL，混合后42 ℃保存1 h，95 ℃處理5 min。

表1 樣品來源

Table1Sources of samples

樣品Sample采集地點Location采集樣品數(shù)Number of samples 鑒定到的病毒數(shù)Number of viruses 寄主Host采集時間TimeY-3青海省樂都縣中嶺鄉(xiāng)馬家洼Majiawa, Zhongling, Ledu County, Qinghai61馬鈴薯Potato2016Y-5青海省樂都縣洪水鄉(xiāng)大寨子村Dazhaizi,Hongshui, Ledu County, Qinghai51馬鈴薯Potato2016Y-7青海省平安縣石灰窯鄉(xiāng)下灘村Xiatan, Shihuiyao, Pingan County, Qinghai71馬鈴薯Potato2016Y-8青海省平安縣三合鎮(zhèn)冰嶺山村Binglingshan, Sanhe, Pingan County, Qinghai41馬鈴薯Potato2016Y-9青海省互助縣臺子鄉(xiāng)新合村Xinhe, Taizi, Huzhu County, Qinghai91馬鈴薯Potato2016Y-11青海省互助縣蔡家堡嚴下村Yanxia, Caijiabao, Huzhu County, Qinghai61馬鈴薯Potato2016Y-13青海省大通縣朔北鄉(xiāng)麻家莊Majia, Shuobei, Datong County, Qinghai41馬鈴薯Potato2016Y-16青海省大通縣東峽鎮(zhèn)田家溝Tianjiagou, Dongxia, Datong County, Qinghai71馬鈴薯Potato2016Y-19青海省湟中縣李家山鎮(zhèn)王家堡Wangjiabao, Lijiashan, Huangzhong County, Qinghai61馬鈴薯Potato2016Y-25青海省湟中縣李家山柳樹莊Liushu, Lijiashan, Huangzhong County, Qinghai71馬鈴薯Potato2016Y-26青海省湟源縣巴燕鄉(xiāng)下寺村Xiasi, Bayan, Huangyuan County, Qinghai91馬鈴薯Potato2016Y-35青海省湟源縣申中鄉(xiāng)申中村Shenzhong, Shenzhong, Huangyuan County, Qinghai51馬鈴薯Potato2016Y-36青海省民和縣北山鄉(xiāng)先鋒村Xianfeng, Beishan, Minhe County, Qinghai71馬鈴薯Potato2016Y-41青海省民和縣滿平鎮(zhèn)浪塘村Langtang, Manping, Minhe County, Qinghai41馬鈴薯Potato2016Y-45青海省西寧市城北區(qū)二十里鋪鎮(zhèn)小寨村Xiaozhai, Ershilipu, Xining City, Qinghai51馬鈴薯Potato2016Y-54青海省西寧市農(nóng)科院試驗田Experimental plot, Xining City, Qinghai71馬鈴薯Potato2016

1.5.2 RNA質(zhì)量和馬鈴薯PVY病毒的RT-PCR檢測

PCR反應擴增總體系為50 μL∶cDNA模板3 μL，10×PCR Buffer(Mg2+free)5 μL，10 mmol·L-1dNTPs 3 μL，25 mmol·μL-1MgCl22 μL，10 pmol·μL-1上下游引物各1 μL，Taq DNA聚合酶0.5 μL，ddH2O 34.5 μL。反應條件：94 ℃ 2 min；94 ℃ 30 s，55 ℃ 1 min，72 ℃ 2 min，35個循環(huán)；72 ℃ 5 min，4 ℃存放。

PCR產(chǎn)物用1%瓊脂糖凝膠電泳進行檢測。PCR產(chǎn)物純化后克隆至pGM-T載體上，并轉(zhuǎn)化至DH5α感受態(tài)細胞中。經(jīng)菌落PCR鑒定獲得陽性重組質(zhì)粒，隨機選擇陽性克隆委托生工生物工程(上海)股份有限公司測序，并通過測序峰圖及序列比對分析排除由PCR擴增引起的突變。

1.6 序列分析與同源性比對

獲得的序列利用SDT及DNAMAN 8.0軟件進行序列比對，獲得序列一致率。從GenBank中選取已知株系的PVYcp基因序列作為參考，利用MEGA 6.0軟件中的最大似然法(maximum likelihood，ML)對分離獲得的分離物構(gòu)建系統(tǒng)進化樹，并分組。同時，利用重組分析軟件RDP4.0進行重組分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 cp基因的擴增與克隆

將表現(xiàn)花葉、皺縮、黃化等癥狀的葉片進行病毒總RNA的提取、擴增，1%的瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果顯示，樣品得到了特異PCR條帶，陰性對照無擴增片段(圖1)。測序結(jié)果表明，該條帶大小為1 157 bp，與PVY的cp全序列預期結(jié)果一致，表明克隆的條帶為馬鈴薯Y病毒(PVY)基因。該基因序列包括NIb部分核苷酸序列(1～281 bp)、cp基因核苷酸序列(282～1 082 bp)和3′-UTR苷酸(1 083～1 157 bp)。該目的基因的開放閱讀框有801個核苷酸，編碼一個由267個氨基酸組成的PVY外殼蛋白。

2.2 cp基因序列一致率分析

PVY病毒cp基因的PCR擴增產(chǎn)物經(jīng)測序后，使用SDT和DANMAN軟件將獲得的16個PVY的cp基因序列和推導的氨基酸序列進行兩兩比對。結(jié)果表明，16個分離物的核苷酸一致率為98.0%～100%，氨基酸一致率為94.8%～100%。其中，Y5和Y36，以及Y8、Y19、Y25之間核苷酸和氨基酸一致率最高，均為100%。Y13與Y3、Y9、Y45、Y54核苷酸和氨基酸一致率最低，分別為98.0%和94.8%(圖2)。16個分離物的核苷酸一致性很高，801個核苷酸中共有19個突變位點，其中Y-7、Y-11、Y-13、Y-16和Y-41分離物中，在第173處，堿基C變成了A，表示為g.173 C>A，依次類推，g.577 A>G、g.792 T>C。Y-25、Y-45、Y-54和Y-19分離物中g(shù).105 T>C。從采集樣品的區(qū)域來看，發(fā)生堿基突變的Y-7、Y-11、Y-13 、Y-16和Y-41的采集地分別是平安縣石灰窯鄉(xiāng)下灘村、互助縣蔡家堡嚴下村、大通縣朔北鄉(xiāng)麻家莊、大通縣東峽鎮(zhèn)田家溝和民和縣滿平鎮(zhèn)浪塘村。這說明青海省的PVY的分布有遺傳因素的影響，來自于地域的自然環(huán)境的影響很小，沒有規(guī)律可循。

M，2 000 bp DNA marker；1，陰性對照；2～4，馬鈴薯分離物。M， 2 000 bp DNA marker; 1， Negative control; 2-4， Samples from potato.圖1 PVY馬鈴薯分離物cp基因RT-PCR檢測結(jié)果Fig.1 RT-PCR products of PVY cp gene amplified from potato leaf total RNA

圖2 十六個分離物核苷酸一致率分析Fig.2 Nucleotide sequence identity matrix generated from coat protein gene of 16 isolates

16個分離物的氨基酸相對比較保守，267個氨基酸共有9個突變位點，分別為第70位的酪氨酸Y突變?yōu)楣劝彼酔，表示為Y70E，依次類推，S83N、R88K、T130K、G176E、V200I、N210D、S343Y和A357V，所有的核苷酸變異都是替換，不存在堿基插入/缺失現(xiàn)象。

2.3 cp基因的重組分析

圖3 青海分離物cp基因潛在的重組事件Fig.3 Potential recombination events in cp gene of Qinghai isolate of PVY

通過RDP4.0軟件的重組分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，本研究獲得的16個分離物中沒有發(fā)現(xiàn)重組位點。但來自波蘭的分離物AJ890343檢測到2個重組位點，分別位于cp基因的594和792處(圖3)，該重組體親本一個來源于本實驗分離的Y13(作為主要親本)，另一個來源于GenBank中的加拿大Mb112(AY745491)分離物(作為次親本)。RDP4軟件中RDP、GENECONV、BootScan、MaxChi、Chimaera、SiScan這6種算法的平均P值分別為1.048×10-5、3.164×10-4、2.820×10-4、1.247×10-3、8.556×10-5和4.796×10-5。

2.4 cp基因的系統(tǒng)發(fā)育分析

將比對后的序列，使用ML法建立的系統(tǒng)發(fā)育樹(圖4)，將GenBank中已知PVY分離物cp序列27個(表2)與本次實驗中測定的PVY青海分離物16個cp序列一同構(gòu)建進化樹。分析結(jié)果表明，在系統(tǒng)進化樹中，所有的序列可分為4個大的株系群，分別為PVYN-Wi株系群、PVYO株系群、PVYC株系群和PVYN株系群，其中，PVYN-Wi株系群中包含了來自于我省所測定樣品的11個樣品，分別是Y-19、Y-25、Y-8、Y-54、Y-45、Y-36、Y-35、Y-26、Y-9、Y-5和Y-3，占所測樣品的68.7%。這11個PVY馬鈴薯分離物的cp與來自歐洲波蘭的08-rol菌株(登錄號：JF804783)和斯洛伐克的SL16菌株(登錄號：KX713170 )PVYN-Wi株系遺傳較近(表2)。另外的Y-7、Y-11、Y-16、Y-41和Y-13共5個分離物的cp屬于PVYO株系群，其中前4個分離物與GQ20083相對較近，而Y-13與U05509相對較近，5個分離物占所測樣品的31.3%，Y-7、Y-11、Y-16、Y-41這4個分離物雖然具有PVYO株系的分子特征，但在系統(tǒng)進化樹中，它們與來自美洲的4個PVYO株系分離物也具有一定的距離，說明來自中國的PVYO株系具有明顯的地域分子特征。而PVYC株系和PVYN株系群的樣品則沒有發(fā)現(xiàn)。青海省內(nèi)不同縣域的分離物地域間差異微小，同源性很高，說明PVY的種群基因較穩(wěn)定。

圖4 試驗樣品與各地樣品的cp序列構(gòu)建進化樹Fig.4 Phylogenetic tree of cp sequences from the test samples and others

表2 各地的不同來源PVYcp基因序列

Table2PVYcpgene sequences from different sources around world

登錄號GenBank ID寄主Host來源Source年份YearJF804783煙草Tobacco波蘭Poland2008KX713170西紅柿Tomato斯洛伐克Slovakia2015JQ924286馬鈴薯Potato巴西Brazil2009JQ924288馬鈴薯Potato巴西Brazil2007HQ912871馬鈴薯Potato美國USA2007DQ157179馬鈴薯Potato美國USA2005AY745492馬鈴薯Potato加拿大Canada2004AY745491馬鈴薯Potato加拿大Canada2004EF026076煙草Tobacco美國USA2006HQ912870馬鈴薯Potato美國USA2004GQ200836馬鈴薯Potato中國USA2007HQ912897馬鈴薯Potato美國USA2006EF026074馬鈴薯Potato美國USA2006HQ912864馬鈴薯Potato美國USA2007AJ585195馬鈴薯Potato英國UK2003U095097煙草Tobacco加拿大Canada1997EU719650馬鈴薯Potato中國China2008X14136——1989AF012026——1997AF012028——1998AJ439544辣椒Pepper法國France2002AJ439545西紅柿Tomato西班牙Spain2002KP063211煙草Tobacco伊朗Iran2006AJ890343煙草Tobacco波蘭Poland2006AJ585197馬鈴薯Potato英國UK2004D12570——1991X97895馬鈴薯Potato瑞士Switzerland1997

3 討論

目前，馬鈴薯Y病毒是造成馬鈴薯減產(chǎn)和品質(zhì)下降的主要病害之一，各地發(fā)生普遍且不同的地區(qū)生產(chǎn)條件和自然環(huán)境不同，導致植物的癥狀也有差別，從而對生產(chǎn)造成了嚴重的危害[3，28]。國內(nèi)外學者利用植物病毒的保守區(qū)域?qū)χ参锊《具M行株系鑒定等大量的研究，生產(chǎn)上采用血清學方法和單克隆抗體對馬鈴薯Y病毒株系進行檢測的方法容易造成漏檢，無法對株系進行準確鑒定[29-30]，會對下一步工作造成影響。

以PCR為主要手段的分子檢測能從核苷酸水平準確檢測其基因型，這對快速掌握和防控PVY流行趨勢具有一定的指導意義[26]。本研究設(shè)計的引物為擴增PVYcp基因全長序列，其能提供更多的分型位點，在一定程度上彌補血清學檢測的不足。本試驗對青海各地區(qū)的受PVY侵染的cp基因序列樣品進行了RT-PCR擴增和測序。試驗目的是檢測青海省的馬鈴薯Y病毒是否存在有cp基因序列測序出現(xiàn)重組或突變的個體及群體，并通過與世界其他地區(qū)PVY的cp基因進行比對分析，進而對青海PVY種群的現(xiàn)狀進行分子生物學評價。結(jié)果表明，本次擴增的樣品的cp基因全長801 bp。利用SDT和DNAMAN軟件對16個分離物的cp基因序列進行分析，發(fā)現(xiàn)cp核苷酸和氨基酸序列一致率較高，分別達到98%和94.8%以上，基因保守性高，這與大多數(shù)研究的結(jié)果相同[27]。

通過MAGA6.0對實驗樣品cp序列與GenBank中已知來自于國內(nèi)外26個PVYcp基因序列進行進化分析發(fā)現(xiàn)，16個分離物中的基因區(qū)段有11個與PVYN-Wi株系較近，說明該基因在病毒的生存和繁殖中起著十分重要的作用。前人研究表明，在PVY全基因組上，PVYN∶O、PVYN-Wi株系和PVYO株系序列高度相似，只是在P1和HC-Pro重組了PVYN株系的序列[30]，因此，圖4中PVYN∶O和PVYN-Wi二者優(yōu)先相聚成簇。雖然PVYcp基因高度保守，但不同地區(qū)分離物也存在一定的分子變異，16個 PVY 分離物共發(fā)現(xiàn)有26個堿基多態(tài)性位點發(fā)生突變。這些突變體都是通過核苷酸堿基置換形成的，沒有出現(xiàn)序列插入或缺失現(xiàn)象，說明點突變在PVY進化中起著重要的作用。目前青海省的馬鈴薯田間PVY已經(jīng)發(fā)生基因變異現(xiàn)象。

青海地區(qū)11個PVY馬鈴薯分離物與PVYN-Wi株系的親緣關(guān)系最近，故而推斷這11個分離物可能歸屬于PVYN-Wi株系，說明青海省的PVY群體可能以PVYN-Wi株系為主，高芳鑾等[30]通過對福建省17個PVY分離物的檢測鑒定，表明PVY在馬鈴薯主要種植區(qū)普遍發(fā)生的多為重組株系。這和筆者的觀點相似。但由于PVY株系分化嚴重，重組頻繁，單獨使用cp基因序列為分子標記進行系統(tǒng)發(fā)育分析，可能無法對PVY全部株系種類進行準確鑒定，應該開展多基因聯(lián)合方法鑒定。筆者聯(lián)合P1和cp基因，以及多重PCR等多種方法進一步驗證后，得到了與本文基本一致的系統(tǒng)發(fā)育分析結(jié)果(未發(fā)表數(shù)據(jù))。16個樣品PVY分離物多為PVYN-Wi株系，重組株系被認為可能比非重組株系具有更強的致病力[31]，并已在世界各馬鈴薯種植區(qū)越來越流行，因此，生產(chǎn)上需要密切關(guān)注這些重組株系的發(fā)展動態(tài)。5個來自青海的PVY的cp與來自中國GQ200836(O)同屬于有發(fā)生重組的PVYO株系。雖然青海省大部分PVY有可能是隨著國外品種資源的引進進入，同時PVY也隨著國內(nèi)不同區(qū)域間的資源交流和種薯調(diào)運發(fā)生了重組，但仍然有約30%的株系沒有發(fā)生重組變異，這些沒有變異的株系以PVYO株系為主。在本實驗中未發(fā)現(xiàn)PVYC株系、PVYN株系、PVYE株系和PVYNTN株系。但由于可供分析的分離物樣品數(shù)量有限，不排除有PVY的其他株系的存在?；蛘咄ㄟ^種薯的區(qū)域間的相互調(diào)運，不排除未來其他重組株系的發(fā)生。因此，青海馬鈴薯PVY重組株系的發(fā)展趨勢值得關(guān)注。