丙泊酚激活線粒體凋亡通路誘導(dǎo)乳頭狀甲狀腺癌TPC-1細(xì)胞凋亡和生長阻滯*

張子曦 王永順 向洪聰 肖志波 夏學(xué)鑫 蔡志強(qiáng)

(1.湖北江漢油田總醫(yī)院麻醉科，湖北 潛江 433124；2.潛江市中心醫(yī)院麻醉科，湖北 潛江 433100；3.武漢科技大學(xué)附屬醫(yī)學(xué)院麻醉科，湖北 武漢 430064)

甲狀腺癌是最普遍的內(nèi)分泌惡性腫瘤，其發(fā)病率在全世界范圍內(nèi)每年以3%的速度不斷增長[1]。乳頭狀甲狀腺癌是最常見的甲狀腺癌類型，占整個(gè)甲狀腺癌病例約90%[2]。當(dāng)前甲狀腺癌的治療選擇通常是手術(shù)切除或放射碘治療，在大多數(shù)情況下，乳頭狀甲狀腺癌在手術(shù)切除后預(yù)后良好，少數(shù)患者會(huì)復(fù)發(fā)或者發(fā)生遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移[3]。因此，迫切需要開發(fā)旨在阻斷乳頭狀甲狀腺癌進(jìn)展的新治療策略。丙泊酚作為常用的靜脈麻醉藥，近年研究發(fā)現(xiàn)，丙泊酚(propofol,PPF)還可能具有抗腫瘤作用，如在腎癌、胃癌和膠質(zhì)瘤等腫瘤治療過程中還表現(xiàn)出較好的抑瘤作用[4-6]。目前仍尚不清楚丙泊酚對(duì)乳頭狀甲狀腺癌的影響機(jī)制。因此，本研究擬在離體條件下探究丙泊酚通過線粒體凋亡通路對(duì)乳頭狀甲狀腺癌TPC-1細(xì)胞凋亡和生長的影響。

1 材料和方法

1.1 試驗(yàn)藥物和主要試劑 丙泊酚(100806-201803)購自中國食品藥品檢定研究院，化學(xué)式：C12H18O，分子量：178.27，純度≥99.9%，Dulbecco's modified Eagle's medium培養(yǎng)基(12100-046)、胎牛血清(10082-147)、胰蛋白酶(25200-056)、青-鏈霉素(15140-122)購自美國Gibco公司，BRDU細(xì)胞增殖檢測(cè)試劑盒(C0071S)、BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒(P0012S)、Annexin V-FITC細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒(C1062S)、線粒體膜電位檢測(cè)試劑盒JC-1(C2006)購自上海碧云天生物技術(shù)研究所，總超氧化物歧化酶測(cè)定試劑盒(A001-3-2)、丙二醛測(cè)定試劑盒(A003-1)、谷胱甘肽過氧化物酶(A005-1-2)購自南京建成生物工程研究所，Anti Ki67(ab15580)、PCNA(ab18197)、Bcl-2(ab196495)、Bax(ab53154)、Caspase-3(ab13847)、cleaved Caspase-3(ab2302)、Caspase-9(ab52298)、cleaved Caspase-9(ab2324)、c-Myc(ab39688)購自美國Abcam公司。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng) 人乳頭瘤狀甲狀腺癌細(xì)胞TPC-1來源于中國科學(xué)院典型培養(yǎng)物保藏委員會(huì)細(xì)胞庫，細(xì)胞培養(yǎng)于10%胎牛血清和1%青-鏈霉素的高糖DMEM培養(yǎng)基中，并放置在37 ℃，5% CO2恒溫培養(yǎng)箱中。培養(yǎng)基每2～3天更換一次，當(dāng)需要收集細(xì)胞時(shí)，用0.25%胰蛋白酶消化。試驗(yàn)用細(xì)胞為對(duì)數(shù)生長期細(xì)胞。

1.3 細(xì)胞處理和分組 采用0、12.5、25、50 μM劑量[7]丙泊酚處理TPC-1細(xì)胞，將細(xì)胞隨機(jī)分為PPF 0 μM組、PPF 12.5 μM組、PPF 25 μM組和PPF 50 μM組4組。

1.4 BrdU染色 將細(xì)胞傳代接種于6孔板內(nèi)，待細(xì)胞融合率達(dá)80%時(shí)，用含0.4 %FBS的培養(yǎng)液同步化孵育72 h。加入終濃度為0.03 μg/mL的BrdU繼續(xù)孵育40 min。PBS洗滌細(xì)胞3次，用多聚甲醛固定10 min，嚴(yán)格按照說明書進(jìn)行細(xì)胞增殖檢測(cè)。鏡下觀察并計(jì)數(shù)BrdU陽性細(xì)胞數(shù)。

1.5 克隆形成法 在培養(yǎng)皿中培養(yǎng)細(xì)胞至大約30%匯合度，繼續(xù)培養(yǎng)4 d，吹散為單個(gè)細(xì)胞，用6孔板培養(yǎng)，約500個(gè)細(xì)胞每孔，培養(yǎng)14天，棄掉培養(yǎng)基，用乙醇固定30 min，接著用0.5%結(jié)晶紫染色，用去離子水漂洗晾干，進(jìn)行拍照觀察。

1.6 流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡 收集懸浮細(xì)胞至10 mL的離心管中，每樣本細(xì)胞數(shù)為3×106/mL，500～1000 r/min離心5 min，棄去培養(yǎng)液，用孵育緩沖液洗滌1次，500～1000 r/min離心5 min，用100 μL的標(biāo)記溶液重懸細(xì)胞，室溫下避光孵育10～15 min，500～1000 r/min離心5 min沉淀細(xì)胞孵育緩沖液洗1次，加入熒光(SA-FLOUS)溶液4 ℃下孵育20 min，避光并不時(shí)振動(dòng)，流式細(xì)胞儀分析：流式細(xì)胞儀激發(fā)光波長用488 nm，用一波長為515 nm的通帶濾器檢測(cè)FITC熒光，另一波長大于560 nm的濾器檢測(cè)PI。

1.7 線粒體膜電位 將各組細(xì)胞接種于6孔板后PBS清洗三次，孵育24 h，加入JC-1(5 μg/mL)室溫避光反應(yīng)30 min。用流式分選儀檢測(cè)，記錄紅色和綠色熒光強(qiáng)度。

1.8 Western blot檢測(cè)蛋白表達(dá)水平 將各組待測(cè)細(xì)胞用PBS清洗三次，再加入含蛋白酶抑制劑的細(xì)胞裂解液進(jìn)行總蛋白提取，BCA試劑盒測(cè)定蛋白質(zhì)含量；提取等量的蛋白質(zhì)樣品(20 mg)，100 ℃變性5 min。然后進(jìn)行SDS-PAGE凝膠電泳分離并轉(zhuǎn)移至PVDF膜，5%的BSA室溫封閉1～2 h后加入相應(yīng)的一抗，4 ℃過夜孵育，次日，清洗后再加入辣根過氧化物酶標(biāo)記的二抗，室溫孵育1 h，清洗。最后加入發(fā)光液后，于凝膠成像儀進(jìn)行曝光拍照，并用ImageJ軟件統(tǒng)計(jì)灰度值計(jì)算相對(duì)表達(dá)量。GAPDH作為上樣量參照，至少重復(fù)三個(gè)獨(dú)立的實(shí)驗(yàn)。

1.9 SOD、MDA、GSH含量測(cè)定 按照試劑盒說明書，采用酶標(biāo)儀測(cè)定總超氧化物歧化酶(SOD)含量，采用可見分光光度計(jì)測(cè)定丙二醛(MDA)、谷胱甘肽過氧化物酶(GSH)含量。SOD在450 nm處測(cè)OD值，MDA在532 nm處測(cè)OD值，GSH在412 nm處測(cè)OD值。

2 結(jié)果

2.1 丙泊酚抑制TPC-1細(xì)胞增殖 BrdU染色檢測(cè)各組細(xì)胞增殖情況結(jié)果顯示，與PPF 0μM組相比較，PPF 25 μM和PPF 50 μM組BrdU陽性細(xì)胞數(shù)顯著降低(P<0.05)，見圖1。

圖1 丙泊酚對(duì)TPC-1細(xì)胞增殖的影響

2.2 丙泊酚抑制TPC-1細(xì)胞生長 克隆形成實(shí)驗(yàn)檢測(cè)各組細(xì)胞生長情況結(jié)果顯示，與PPF 0 μM組相比較，PPF 25 μM和PPF 50 μM組克隆形成率顯著降低(P<0.05)，見圖2。

圖2 丙泊酚對(duì)TPC-1細(xì)胞生長的影響

2.3 丙泊酚下調(diào)TPC-1細(xì)胞Ki67、PCNA蛋白表達(dá)水平 Western blot檢測(cè)各組細(xì)胞Ki67、PCNA蛋白表達(dá)水平結(jié)果顯示，與PPF 0μM組相比較，PPF 25 μM和PPF 50 μM組Ki67、PCNA蛋白水平顯著降低(P<0.05)，見圖3。

圖3 丙泊酚對(duì)TPC-1細(xì)胞Ki67、PCNA蛋白表達(dá)水平的影響

2.4 丙泊酚促進(jìn)TPC-1細(xì)胞凋亡 流式細(xì)胞儀檢測(cè)各組細(xì)胞凋亡情況結(jié)果顯示，與PPF 0μM組相比較，PPF 25、50μM組細(xì)胞凋亡率顯著升高(P<0.05)，見圖4。

圖4 丙泊酚對(duì)TPC-1細(xì)胞凋亡的影響

2.5 丙泊酚降低TPC-1細(xì)胞線粒體膜電位 JC-10檢測(cè)各組細(xì)胞線粒體膜電位結(jié)果顯示，PPF 25和PPF 50 μM組細(xì)胞線粒體膜電位較PPF 0 μM組明顯降低，見圖5。

圖5 丙泊酚對(duì)TPC-1細(xì)胞線粒體膜電位的影響

2.6 丙泊酚升高TPC-1細(xì)胞Bax/Bcl-2、cleaved caspase-3/Caspase-3、cleaved caspase-9/Caspase-9比值，下調(diào)c-Myc蛋白表達(dá)水平 Western blot檢測(cè)各組細(xì)胞Bcl-2、Bax、Caspase-3、Caspase-9、c-Myc蛋白表達(dá)水平結(jié)果顯示，與PPF 0 μM組相比較，PPF 25 μM和PPF 50 μM組Bax/Bcl-2、cleaved caspase-3/Caspase-3、cleaved caspase-9/Caspase-9比值顯著升高(P<0.05)，c-Myc蛋白水平顯著降低(P<0.05)，見圖6。

圖6 丙泊酚對(duì)TPC-1細(xì)胞Bcl-2、Bax、Caspase-3、Caspase-9、c-Myc蛋白表達(dá)水平的影響

2.7 丙泊酚升高TPC-1細(xì)胞MDA、GSH含量，降低SOD含量 試劑盒檢測(cè)各組細(xì)胞SOD、MDA、GSH含量結(jié)果顯示。與PPF 0 μM組相比較，PPF 12.5 μM組SOD含量顯著降低(P<0.05)，MDA、GSH含量顯著升高(P<0.05)。PPF 50 μM組SOD含量顯著高于PPF 12.5 μM組(P<0.05)，PPF 12.5 μM組MDA、GSH含量顯著高于PPF 50μM組(P<0.05)，見表1。

表1 丙泊酚對(duì)TPC-1細(xì)胞SOD、MDA、GSH含量的影響

3 討論

丙泊酚是臨床上常用的靜脈麻醉藥, 在各種手術(shù)的麻醉誘導(dǎo)中廣泛使用, 其特有的結(jié)構(gòu)能抑制炎癥細(xì)胞聚集、增殖、活化及減少釋放炎癥因子, 從而達(dá)到抗炎作用。丙泊酚可通過直接或間接作用抑制腫瘤細(xì)胞的增殖、侵襲、遷移和生存能力, 并促進(jìn)細(xì)胞凋亡, 從而達(dá)到有效的抗腫瘤作用[8]。手術(shù)治療是乳頭狀甲狀腺癌的首選方法，臨床上多選用丙泊酚對(duì)乳頭狀甲狀腺癌進(jìn)行麻醉[9]。

當(dāng)細(xì)胞增殖失控時(shí)會(huì)引起腫瘤的發(fā)生，因此調(diào)控腫瘤細(xì)胞的增殖是治療腫瘤的必要手段[10]。Ki67是一種與細(xì)胞增殖相關(guān)的核蛋白，參與多種惡性腫瘤細(xì)胞的增殖與侵襲,其蛋白表達(dá)在甲狀腺癌中明顯增高[11]。增殖細(xì)胞核抗原(Proliferating cell nuclear antigen,PCNA) 是一種與細(xì)胞增殖狀態(tài)有關(guān)的核蛋白，其隨著臨床分期增加和淋巴節(jié)轉(zhuǎn)移, 表達(dá)水平逐漸增高，表明癌細(xì)胞增生活躍，與甲狀腺癌的臨床病理學(xué)特點(diǎn)和生物學(xué)行為有關(guān)，提示預(yù)后不良[12]。趙華宇等[13]研究發(fā)現(xiàn)丙泊酚通過降低Ki67表達(dá)抑制膠質(zhì)瘤U251細(xì)胞增殖。王鵬等[14]研究發(fā)現(xiàn)丙泊酚通過下調(diào)PCNA表達(dá)抑制大鼠肺動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞的增殖。本文研究發(fā)現(xiàn)，丙泊酚具有下調(diào)TPC-1細(xì)胞Ki67、PCNA蛋白表達(dá)水平，提示丙泊酚通過抑制Ki67、PCNA表達(dá)抑制TPC-1細(xì)胞增殖。

凋亡是細(xì)胞程序性死亡，治療癌癥的化學(xué)預(yù)防策略之一就是誘導(dǎo)凋亡細(xì)胞死亡[15]；其分為外源性凋亡途徑、內(nèi)源性凋亡途徑(線粒體凋亡途徑)和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激途徑[16]。Caspase家族是細(xì)胞凋亡過程中的關(guān)鍵元件, 可以通過與眾多蛋白因子的相互作用調(diào)控細(xì)胞凋亡，其中Caspase-9、Caspase-3在凋亡級(jí)聯(lián)中過度活化能夠促進(jìn)細(xì)胞凋亡[17]?？辜?xì)胞凋亡成員Bcl2，可防止細(xì)胞凋亡，而促凋亡成員Bax位于線粒體外膜或細(xì)胞質(zhì)，并在應(yīng)激下寡聚化，促進(jìn)線粒體釋放因子，從而引發(fā)細(xì)胞凋亡[18]。c-Myc是一種常見的原癌基因,可促進(jìn)細(xì)胞增殖或誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，在甲狀腺乳頭狀癌中高表達(dá)[19]。本文研究發(fā)現(xiàn)，丙泊酚具有降低升高TPC-1細(xì)胞Bax/Bcl-2、cleaved caspase-3/ Caspase-3、cleaved caspase-9/Caspase-9比值，下調(diào)c-Myc蛋白表達(dá)水平的作用，提示丙泊酚通過線粒體凋亡途徑誘導(dǎo)TPC-1細(xì)胞凋亡。

線粒體是一種存在于大多數(shù)細(xì)胞中有兩層膜包被的細(xì)胞器，是細(xì)胞中制造能量的結(jié)構(gòu)。線粒體通透性孔的轉(zhuǎn)換對(duì)細(xì)胞的凋亡有著至關(guān)重要的作用, 一旦線粒體通透性孔打開, 小分子和離子就會(huì)流進(jìn)線粒體, 導(dǎo)致線粒體膜電位的改變[20]。線粒體膜內(nèi)外的電勢(shì)差降低，引起細(xì)胞凋亡的級(jí)聯(lián)反應(yīng)，將導(dǎo)致細(xì)胞凋亡。本文研究發(fā)現(xiàn)，丙泊酚具有降低TPC-1細(xì)胞線粒體膜電位的作用，提示丙泊酚通過降低線粒體膜電位調(diào)控TPC-1細(xì)胞凋亡。

氧化應(yīng)激是一種復(fù)雜的動(dòng)態(tài)過程，其特點(diǎn)是保持活性氧生成與抗氧化劑的活性及有效性之間的平衡。線粒體作為真核生物進(jìn)行能量代謝的主要場(chǎng)所，在自由基產(chǎn)生、細(xì)胞凋亡、衰老等生理病理活動(dòng)中起到重要作用，是氧化應(yīng)激作用的重要靶細(xì)胞器。SOD和GSH是人體內(nèi)重要的酶抗氧化系統(tǒng)的主要成員，MDA則是機(jī)體內(nèi)重要的脂質(zhì)過氧化代謝產(chǎn)物。郝琨等[21]研究發(fā)現(xiàn)丙泊酚通過升高SOD含量，降低MDA含量緩解氧化應(yīng)激有利于結(jié)直腸癌根治術(shù)患者恢復(fù)。本文研究發(fā)現(xiàn)，丙泊酚具有升高TPC-1細(xì)胞MDA、GSH含量，降低SOD含量的作用，提示丙泊酚通過改善氧化應(yīng)激調(diào)節(jié)TPC-1細(xì)胞增殖和凋亡。本研究只在細(xì)胞水平檢測(cè)丙泊酚的作用, 后期將做體內(nèi)實(shí)驗(yàn), 以更深入研究丙泊酚在乳頭狀甲狀腺癌中的作用。

4 結(jié)論

丙泊酚具有抑制乳頭狀甲狀腺癌TPC-1增殖，促進(jìn)細(xì)胞凋亡，降低線粒體膜電位，改善氧化應(yīng)激的作用，這可能是通過激活線粒體凋亡通路所實(shí)現(xiàn)。