混合鹽堿脅迫對龍葵幼苗生理生化特性的影響

于爽 高劍 于洋 楊新宇 王春雪 冀屹

摘要：為了明確龍葵（Solanum nigrum L.）幼苗對不同鹽堿脅迫的適應(yīng)性差異，從而合理高效地利用龍葵資源，以龍葵幼苗為材料，用不同濃度的中性單鹽NaCl、中性混合鹽（NaCl、Na2SO4的濃度比為1 ∶2）和堿性混合鹽（NaCl、Na2SO4、NaHCO3、Na2CO3的濃度比為5 ∶23 ∶9 ∶3）進(jìn)行脅迫處理，研究龍葵幼苗抗氧化酶與滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)含量的變化。結(jié)果表明，在中性鹽與堿性鹽的作用下，龍葵幼苗都會(huì)遭受氧化脅迫。隨著鹽濃度的升高，葉片中的丙二醛含量增大，超氧化物歧化酶（SOD）、過氧化物酶（POD）、過氧化氫酶（CAT）活性也在一定范圍內(nèi)增大。在堿性混合鹽的作用下，抗氧化酶活性在鹽濃度為100～150 mmol/L時(shí)達(dá)到最大值，然后開始下降;在中性混合鹽脅迫下，只有POD活性上升，SOD、CAT活性均表現(xiàn)出先上升然后下降的趨勢;在中性單鹽NaCl的脅迫下，只有CAT活性在鹽濃度>200 mmol/L 時(shí)下降，而其他2種酶活性持續(xù)上升。在堿性混合鹽作用下，龍葵幼苗會(huì)積累更多的丙二醛，在鹽濃度為300 mmol/L時(shí)達(dá)到最高值，滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)（脯氨酸、可溶性糖）的含量也在一定范圍內(nèi)增加。

關(guān)鍵詞：龍葵;鹽堿脅迫;生理指標(biāo);生化指標(biāo)

中圖分類號： S332.6;Q945.78文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A

文章編號：1002-1302（2019）18-0164-04

收稿日期：2019-03-01

基金項(xiàng)目：2018年度黑龍江省省屬高等學(xué)?；究蒲袠I(yè)務(wù)費(fèi)科研項(xiàng)目（編號：1353ZD007）;黑龍江省大學(xué)生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)訓(xùn)練計(jì)劃（編號：201810233044）;牡丹江師范學(xué)院學(xué)位與研究生教育教學(xué)改革研究項(xiàng)目“植物學(xué)科研究生課程體系建設(shè)與優(yōu)化”（2018）。

作者簡介：于?爽（1974—），女，黑龍江寶清人，碩士，教授，主要從事植物生物學(xué)的教學(xué)與研究工作。E-mail：swxys@126.com。

近年來，由于化肥的過量施用及缺乏正確合理的灌溉方式，鹽堿化土地面積逐年擴(kuò)大。土壤鹽堿化已經(jīng)成為世界性的環(huán)境問題[1]，嚴(yán)重影響了植物的生長和發(fā)育。鹽堿土的分布類型多種多樣[2-3]，以往的研究只注重中性鹽脅迫方面[4]，但是在實(shí)際情況中，鹽與堿是相伴而生的[5]，研究混合鹽堿下植物的生理生化響應(yīng)規(guī)律及與單鹽脅迫的差異性，具有十分重要的意義。

龍葵（Solanum nigrum L.）是茄科茄屬的一年生草本植物，在我國分布廣泛，其性寒、味苦、微甘[6-8]，可以作為中草藥飼料添加劑，龍葵的嫩枝葉也可以作為畜禽飼料源[9]。龍葵的果肉甜而多汁，營養(yǎng)豐富，含有較高的維生素C、維生素B及多種礦物質(zhì)，可以制成果醋飲料，具有廣闊的應(yīng)用前景[10-12]。研究發(fā)現(xiàn)，龍葵對干旱和低溫具有一定的適應(yīng)性[13-16]，而關(guān)于混合鹽堿條件下龍葵生理生化響應(yīng)方面的研究還未見報(bào)道。本研究利用溶液培養(yǎng)模擬土壤鹽堿化條件對龍葵幼苗進(jìn)行處理，探討龍葵幼苗在混合鹽堿脅迫下的生理生化指標(biāo)變化規(guī)律，以期為龍葵的種植及開發(fā)利用提供一定的理論依據(jù)。

1?材料與方法

1.1?試驗(yàn)材料

本試驗(yàn)于2016年7月在牡丹江師范學(xué)院溫室中進(jìn)行。從牡丹江西山采集成熟的龍葵果實(shí)，將種子取出并播種到塑料盆缽中，在26 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)至幼苗長出4張真葉時(shí)，取生長良好、大小相同的幼苗作為試驗(yàn)材料。

1.2?鹽脅迫處理

用1/2 Hoagland配制鹽溶液，將幼苗放置于廣口瓶中進(jìn)行培養(yǎng)，廣口瓶用黑紙遮光以保證根系不見光。設(shè)A組為NaCl中性鹽溶液，B組為NaCl+Na2SO4中性混合鹽溶液（濃度比為1 ∶2），C組為NaCl+Na2SO4+NaHCO3+Na2CO3堿性混合鹽溶液（濃度比為5 ∶23 ∶9 ∶3）。每組均設(shè)置0（對照）50、100、150、200、300 mmol/L 6個(gè)濃度梯度，對照為1/2 Hoagland營養(yǎng)液。每個(gè)處理設(shè)置3個(gè)重復(fù)。為了避免鹽沖擊現(xiàn)象，先用低濃度鹽溶液培養(yǎng)，逐漸更換成高濃度鹽溶液，最終達(dá)到最高濃度，其間定期更換處理液。在達(dá)到最高濃度10 d 后，采集各個(gè)植株的第3～4張功能葉，進(jìn)行各個(gè)指標(biāo)的測定。

1.3?指標(biāo)測定

采用蒽酮比色法測定可溶性糖含量;采用硫代巴比妥酸法測定丙二醛（MDA）含量;采用茚三酮比色法測定脯氨酸含量;采用氮藍(lán)四唑法測定超氧化物歧化酶（SOD）活性;采用高錳酸鉀滴定法測定過氧化氫酶（CAT）活性;采用愈創(chuàng)木酚比色法測定過氧化物酶（POD）活性[17-18]。每個(gè)樣品、每個(gè)指標(biāo)重復(fù)檢測3次。

1.4?數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

采用Excel 2007和SPSS 18.0對試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。

2?結(jié)果與分析

2.1?鹽堿脅迫對龍葵葉片脯氨酸含量的影響

脯氨酸是植物中主要的滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)，植物在受到逆境脅迫時(shí)，體內(nèi)會(huì)大量累積脯氨酸，進(jìn)而調(diào)節(jié)細(xì)胞的滲透勢[19]，植物的抗逆能力與脯氨酸的累積量呈正相關(guān)。從圖1可以看出，龍葵幼苗葉片內(nèi)的脯氨酸含量隨著鹽濃度的不斷升高整體上出現(xiàn)不同程度的上升趨勢。當(dāng)鹽濃度為50～150 mmol/L 時(shí)，堿性鹽脅迫相比于中性鹽脅迫對植物產(chǎn)生的影響更早。當(dāng)鹽濃度為200 mmol/L時(shí)，堿性混合鹽處理的脯氨酸含量最高，是對照的9.0倍（P<0.05），差異顯著，中性單鹽、中性混合鹽處理的脯氨酸含量分別是對照的3.1、5.5倍（P<0.05）。當(dāng)鹽濃度為300 mmol/L時(shí)，中性單鹽和中性混合鹽處理的脯氨酸含量最高。由此可見，相比于中性鹽，堿性鹽對脯氨酸含量的影響較大。在鹽濃度為0～200 mmol/L的范圍內(nèi)，脯氨酸含量能夠表現(xiàn)出植株受傷害的程度，而鹽濃度為300 mmol/L時(shí)，會(huì)超越植株的忍耐程度，其組織和器官的生理代謝功能已經(jīng)被破壞。

2.2?鹽堿脅迫對龍葵葉片可溶性糖含量的影響

植物在適應(yīng)鹽漬環(huán)境的過程中會(huì)產(chǎn)生可溶性糖，又因?yàn)榭扇苄蕴窃诩?xì)胞中的溶解度較大，因此在鹽漬情況下，隨可溶性糖含量的增多，能夠使細(xì)胞質(zhì)濃度變大，從而使植物的吸水能力變強(qiáng)，增強(qiáng)其耐鹽性[20]。由圖2可以看出，在中性鹽脅迫下，可溶性糖含量隨著鹽濃度的增加呈上升趨勢，中性單鹽、中性混合鹽處理的可溶性糖含量在其濃度為300 mmol/L 時(shí)達(dá)到最高值，分別是對照的3.3、4.1倍（P<0.05），與對照間的差異達(dá)到顯著水平。而在堿性鹽脅迫下，可溶性糖含量呈現(xiàn)先升后降的趨勢，200 mmol/L時(shí)最高，是對照的4.7倍（P<0.05），堿性混合鹽與中性單鹽、中性混合鹽的差異也最大，C處理是A處理的1.97倍，是B處理的1.43倍（P<0.05），差異顯著。龍葵通過增加葉片的可溶性糖含量，以保護(hù)細(xì)胞免受傷害。當(dāng)鹽濃度為200～300 mmol/L時(shí)，可溶性糖含量開始下降，可能由于鹽濃度的繼續(xù)增加，致使細(xì)胞的滲透性調(diào)節(jié)系統(tǒng)失衡。

2.3?鹽堿脅迫對龍葵葉片丙二醛含量的影響

膜脂過氧化過程能夠產(chǎn)生一種非常重要的物質(zhì)MDA，其含量能夠衡量植物體內(nèi)自由基的動(dòng)態(tài)變化和細(xì)胞的受損程度[21]。由圖3可知，當(dāng)鹽濃度達(dá)到50 mmol/L時(shí)，3個(gè)處理組對丙二醛含量的影響是很小的，與對照相比差異不明顯，說明當(dāng)鹽濃度較低時(shí)，龍葵對于中性鹽與堿性鹽都有一定的適應(yīng)

性。當(dāng)鹽濃度大于100 mmol/L時(shí)，3個(gè)處理組的丙二醛含量隨著鹽濃度的升高而明顯增多。當(dāng)鹽濃度為300 mmol/L時(shí)，丙二醛含量均達(dá)到最高值，丙二醛含量與鹽濃度之間表現(xiàn)出正相關(guān)，上升趨勢為C組>B組>A組。說明混合鹽對龍葵的傷害要高于單鹽，而堿性鹽相比于中性鹽，對龍葵的傷害要更高。由此可見，在堿性鹽脅迫下會(huì)使龍葵的膜脂過氧化程度加強(qiáng)，對于龍葵葉片細(xì)胞膜系統(tǒng)功能的損傷更大。

2.4?鹽堿脅迫對龍葵葉片超氧化物歧化酶活性的影響

超氧化物歧化酶廣泛分布在植物體內(nèi)，其主要作用是去除活性氧，能夠把植物體內(nèi)具有破壞性的超氧化物陰離子自由基轉(zhuǎn)變?yōu)镠2O2，產(chǎn)物H2O2可由過氧化氫酶進(jìn)一步分解為H2O和O2，或被過氧化物酶利用，從而避免自由基對細(xì)胞進(jìn)行破壞[22]。從圖4可以看出，當(dāng)鹽溶液濃度升高時(shí)，中性單鹽處理的SOD活性呈現(xiàn)不斷升高的趨勢，在300 mmol/L處理下達(dá)到較高水平，此時(shí)的SOD活性是對照組的2.2倍，但不能夠確定是否為活性峰值;當(dāng)中性混合鹽和堿性混合鹽溶液濃度持續(xù)升高時(shí)，中性混合鹽、堿性混合鹽處理的SOD活性呈先上升后下降的趨勢，并且堿性混合鹽處理的SOD活性明顯大于中性混合鹽，中性混合鹽、堿性混合鹽達(dá)到SOD活性最佳水平時(shí)分別是對照的1.92、2.64倍。SOD活性體現(xiàn)了植物體內(nèi)活性氧產(chǎn)生的情況，這可能說明堿性混合鹽對SOD的影響要遠(yuǎn)高于中性混合鹽和中性單鹽。

2.5?鹽堿脅迫對龍葵過氧化物酶活性的影響

過氧化物酶是植物活性氧清除系統(tǒng)中防止植物受活性氧危害的具有重要意義的酶，植物體內(nèi)過多的H2O2就是由POD來清除從而起到防止植物受損作用的。植物耐鹽性的強(qiáng)弱在很大程度上是由POD活性的大小來決定的，因此植物耐鹽性的大小可用POD活性來衡量[23]。從圖5可以看出，中性單鹽、中性混合鹽處理下的POD活性隨著鹽濃度的增加呈現(xiàn)出上升趨勢，在300 mmol/L鹽濃度處理下達(dá)到較高水平，分別為對照組的2.48、3.30倍。在堿性混合鹽處理下呈先上升后下降的趨勢，在150 mmol/L鹽濃度時(shí)達(dá)到峰值，為對照組的3.52倍。POD作為組織老化的一種生理指標(biāo)，可以反映3種處理對植物機(jī)體的損害程度，在50～300 mmol/L濃度范圍內(nèi)，POD活性大小排序?yàn)镃組>B組>A組。

2.6?鹽堿脅迫對龍葵過氧化氫酶活性的影響

在植物組織中常見一種含鐵的過氧化氫酶，這種酶主要存在于抗氧化系統(tǒng)中，在葉綠素中也存在。由于過氧化氫酶能將其分解為H2O、O2，因此大大減少了由H2O2誘發(fā)產(chǎn)生的單線態(tài)氧和某些自由基，從而避免了對膜結(jié)構(gòu)、DNA及蛋白質(zhì)等的損傷[24]。由圖6可知，3組處理下的CAT活性隨著鹽溶液濃度的增加均呈先上升后下降的趨勢，3個(gè)處理組的CAT活性分別在200、150、100 mmol/L鹽濃度下達(dá)到峰值，分別是對照組的1.50、1.55、1.52倍。從先后達(dá)到峰值的處理水平可以看出，植物機(jī)體對于3種鹽溶液處理的耐受程度表現(xiàn)為中性單鹽處理>中性混合鹽處理>堿性混合鹽處理。

3?討論與結(jié)論

滲透脅迫是植物遭受鹽脅迫最直接的生理反應(yīng)，滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)的產(chǎn)生可以增強(qiáng)植物細(xì)胞的吸水能力[25]。脯氨酸和可溶性糖是植物體內(nèi)重要的滲透調(diào)節(jié)劑[26]，在本試驗(yàn)中，隨著鹽濃度的升高，龍葵葉片的脯氨酸與可溶性糖含量整體上呈現(xiàn)増加趨勢。在堿性鹽脅迫下，脯氨酸、可溶性糖的含量在鹽濃度達(dá)到200 mmol/L時(shí)出現(xiàn)峰值，之后便開始下降。這說明滲透調(diào)節(jié)系統(tǒng)在堿性鹽濃度高于200 mmol/L時(shí)已遭到損壞，無法維持滲透壓的穩(wěn)定，無法抵抗由鹽分逆境而引起的滲透脅迫[27]。中性鹽2個(gè)處理組（A組和B組）的可溶性糖含

量變化情況相同，都隨鹽濃度的不斷增加而增加，而且組間無顯著差異，這說明離子成分對可溶性糖含量所產(chǎn)生的影響要遠(yuǎn)小于鹽濃度所造成的影響。

POD、SOD、CAT是保護(hù)酶系統(tǒng)中最重要的3種酶，它們能抑制活性氧（ROS）對質(zhì)膜的破壞作用，MDA是植物遭受逆境脅迫后膜脂過氧化的重要產(chǎn)物，它們之間存在十分緊密的關(guān)系[28]。本研究中，在低濃度鹽脅迫下（<100 mmol/L），3種脅迫處理的MDA含量緩慢增加，POD、SOD活性都逐漸增強(qiáng)。當(dāng)鹽濃度增加至100～150 mmol/L時(shí)，堿性混合鹽處理下的龍葵葉片MDA含量快速増加，而SOD、CAT活性則呈下降趨勢。在中性鹽脅迫下，在濃度達(dá)到150～200 mmol/L時(shí)，中性混合鹽處理的CAT活性開始下降，而中性混合鹽、中性單鹽處理的POD活性均持續(xù)上升。究其原因，可能是在脅迫初期，細(xì)胞膜脂過氧化，MDA含量上升，與此同時(shí)植物為減緩細(xì)胞傷害，啟動(dòng)葉片內(nèi)保護(hù)酶POD、SOD、CAT，清除細(xì)胞內(nèi)多余的活性氧，致使抗氧化酶活性上升。植物細(xì)胞內(nèi)的活性氧隨著處理鹽濃度的增加而不斷積累，抗氧化酶活性因破壞了抗氧化酶結(jié)構(gòu)而下降。同時(shí)在脅迫后期，加劇了鹽脅迫的毒害作用，使植物細(xì)胞的膜脂過氧化更為嚴(yán)重。這主要是因?yàn)橐话阒参锒紩?huì)存在一個(gè)忍耐活性氧的閾值，當(dāng)植物體內(nèi)的活性氧水平超過這個(gè)閾值時(shí)，植物自身的抗氧化系統(tǒng)就會(huì)遭到破壞，從而導(dǎo)致植物自身的活性氧代謝失調(diào)，對植物自身造成了損傷。因此本研究得出，POD對活性氧的忍耐閾值最高，CAT最差，而SOD居中。

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