不同磷濃度條件下地表球囊霉對黃瓜枯萎病抗性和抗氧化酶活性的影響

王倡憲 王艷 張志

摘要：試驗采用盆缽培養(yǎng)的方法于黃瓜育苗時接種地表球囊霉（G. versiforme），并分別澆灌磷濃度為0、31、93 mg/kg 的營養(yǎng)液，于苗齡為4周時，采用灌根法接種尖孢鐮刀菌（Fusarium oxysporum f. sp.）分生孢子懸液，以明確不同磷濃度條件下G. versiforme對黃瓜幼苗枯萎病的防效及相關(guān)酶活性的影響。結(jié)果表明，磷濃度為31 mg/kg時，G. versiforme可明顯提高黃瓜幼苗對枯萎病的抗性，接種病原菌后9 d時，菌根化幼苗的病情指數(shù)較相應(yīng)對照降低10百分點;同時，接種G.versiforme的幼苗葉片中蔗糖含量為其相應(yīng)對照的1.4倍。幼苗接種病原菌后，與各自相應(yīng)的對照相比，接種G.versiforme處理葉片中多酚氧化酶（PPO）活性較高，過氧化物酶（POD）活性相對穩(wěn)定，且峰值出現(xiàn)時間較晚。

關(guān)鍵詞：黃瓜;地表球囊霉;磷濃度;枯萎病;抗病性;抗氧化酶

中圖分類號： S436.421.1+3文獻標志碼： A

文章編號：1002-1302（2019）18-0129-03

收稿日期：2018-08-03

基金項目：黑龍江省教育廳科學(xué)技術(shù)研究項目（編號：12511403）。

作者簡介：王倡憲（1974—），女，內(nèi)蒙古包頭人，博士，副教授，主要從事植物根際營養(yǎng)的教學(xué)與科研工作。E-mail：wangcxsz08@163.com。

黃瓜（Cucumis sativus L.）作為我國主要栽培蔬菜種類之一，近年來，種植面積和產(chǎn)量均呈現(xiàn)增加趨勢，與此同時，土傳病害逐年加重是黃瓜栽培過程中存在的一個古老而又現(xiàn)實的問題[1-3]。其中，由尖孢鐮刀菌黃瓜?；停‵usarium xysporum f.sp.cucumerinum）病原菌引起的枯萎病易發(fā)難防，危害嚴重，目前，該病以化學(xué)農(nóng)藥防治為主，而由此引起的瓜果質(zhì)量下降與環(huán)境污染問題已成為人們?nèi)找骊P(guān)注的焦點[4]。

隸屬于球囊霉門的叢枝菌根（arbuscular mycorrhizal，AM）真菌廣泛分布于農(nóng)業(yè)生態(tài)系統(tǒng)中，該類真菌可以和包括黃瓜在內(nèi)的約90%維管植物形成菌根共生體，互惠型共生體建成后，AM真菌對寄主的生長發(fā)育及抗逆性的提高均表現(xiàn)出積極效應(yīng)[5-6]。近年來，有關(guān)AM真菌對黃瓜枯萎病防效及其機制的研究陸續(xù)展開，但是，結(jié)果卻不盡相同，主要是由于AM真菌的防效與AM真菌種類、寄主、土壤環(huán)境等諸多因素有關(guān)，其中，介質(zhì)中的磷水平是影響共生體發(fā)育的最根本因素[7-13]。鑒于此，本試驗探索不同磷濃度條件下AM真菌對黃瓜枯萎病的抗性及不同處理下黃瓜葉片中與抗性相關(guān)酶活性的變化，以明確AM真菌對黃瓜枯萎病的防效及適宜磷濃度，并為深入研究相關(guān)機制奠定理論基礎(chǔ)。

1?材料與方法

1.1?試驗材料

黃瓜：津綠3號，由天津科潤黃瓜研究所提供。播種前將充分吸水的種子在10% H2O2中浸泡10 min進行表面消毒，然后用蒸餾水洗凈藥液，在55 ℃條件下水浴浸種，浸種時不斷攪拌，持續(xù)20 min，使種子吸水膨脹，供給種子萌發(fā)所需基本水量，并起到種子表面消毒的作用，取出后于28 ℃恒溫箱中黑暗催芽。

育苗基質(zhì)及容器：將滅菌的草炭與蛭石以1 ∶1的體積比混合均勻。營養(yǎng)缽（上口徑8.5 cm，底徑6.0 cm，高7.5 cm）用福爾馬林密封1周進行消毒處理，待氣味散盡后備用。

AM菌劑：以玉米為寄主，以草炭為基質(zhì)擴繁2個月，混合接種劑中含有地表球囊霉（G.versiforme，縮寫為G.v）真菌的孢子、菌絲和被侵染根段。

病原菌（Fusarium oxysporum f.sp.，略寫為F.o，由中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護研究所提供）孢子懸液：先將病原菌在馬鈴薯葡萄糖瓊脂（PDA）培養(yǎng)基上25 ℃黑暗培養(yǎng)3 d，然后從菌落邊緣挑取2塊直徑為3～4 mm的菌塊于滅菌的馬鈴薯-葡萄糖培養(yǎng)液中28 ℃、50 r/min培養(yǎng)2周，用消毒的雙層紗布濾掉菌絲，將剩余的培養(yǎng)液于4 ℃、9 000 r/min 下離心3次，收集孢子懸液，用血球板計數(shù)，最后用10 mmol/L MgSO4·7H2O調(diào)節(jié)孢子濃度至5×104 CFU/mL。病原菌孢子懸液制備過程中的所有器皿及制備后的病原菌殘余物均須滅菌處理。

1.2?試驗設(shè)計

本試驗共設(shè)6個處理。AM真菌：接種G.v（M）、不接種G.v的對照（NM）;磷水平：P0（0 mg/kg）、P1（31 mg/kg）、P2（93 mg/kg）。

6個處理分別表示為：（1）MP0;（2）MP1;（3）MP2;（4）NMP0;（5）NMP1;（6）NMP2。每處理設(shè)15次重復(fù)。磷以Ca（H2PO4）2·H2O的形式加入Hoagland營養(yǎng)液中，調(diào)節(jié)營養(yǎng)液pH值為6.5。

1.3?試驗實施

試驗采用生物模擬培養(yǎng)的方法于人工氣候室進行。每盆裝基質(zhì)90 g，播種2粒黃瓜種子，出苗后留1株，其中接種AM真菌處理將菌劑與基質(zhì)混勻裝盆，每盆菌劑用量為10 g，不接種的對照加入等量的滅菌菌劑和10 mL菌種濾液，以保證其他微生物的種類一致。從播種開始，1周后出苗，第2周開始隔日澆灌1/4強度不同P濃度營養(yǎng)液，第3周真葉展開，澆灌1/2強度不同磷濃度的營養(yǎng)液。出苗4周后采用灌根法接種病原菌，每盆接種20 mL病原菌孢子懸液，接種后即停止?jié)补酄I養(yǎng)液。

1.4?分析測定

分別于接種病原菌后1、3、5、7、9 d隨機取3株黃瓜幼苗進行葉片中多酚氧化酶（PPO）、過氧化物酶（POD）活性測定，同時取根樣調(diào)查根系發(fā)病情況，最后1次取樣測定植株生物量并計算病情指數(shù);植株葉片全氮、全磷含量用FIA分析儀測定;菌根侵染率用網(wǎng)格交叉法測定[14];PPO活性采用兒茶酚比色法、POD活性采用愈創(chuàng)木酚比色法[15]測定。

2?結(jié)果與分析

2.1?不同磷濃度條件下，AM真菌對植株生長及抗病性的影響

從表1可以看出，植株長勢及生物量隨介質(zhì)中磷濃度的增加而增加，并且以磷濃度為93 mg/kg時植株生物量最高。3種磷濃度條件下，只有無磷處理條件下接種AM真菌的植株生物量顯著高于其相應(yīng)的對照，磷濃度為31、93 mg/kg 時，接種AM真菌幼苗的生物量與其各自相應(yīng)對照間差異均未達到顯著水平，表明在無磷營養(yǎng)脅迫條件下，AM真菌具有顯著的促生效應(yīng)，隨著介質(zhì)中磷濃度的升高，AM真菌的促生效應(yīng)降低。蔗糖作為植株體內(nèi)光合作用的主要運輸產(chǎn)物，它在植株葉片中含量的高低間接反映了植株體內(nèi)的能量儲備狀況及植株根系可獲得能量物質(zhì)的潛力。3種磷濃度條件下，接種AM真菌處理植株葉片中蔗糖含量與各自相應(yīng)的對照間均無顯著差異，磷濃度為31 mg/kg 時，接種AM真菌的幼苗葉片中蔗糖含量顯著高于無磷條件的對照，該處理幼苗葉片中的蔗糖含量為其相應(yīng)對照的1.4倍。接種病原菌后較高的磷濃度（93 mg/kg）下，G.V.依然可以侵染黃瓜幼苗根系，且菌根侵染率高達40.2%。高磷處理條件下植株葉片中蔗糖含量低于中等磷濃度處理可能是寄主中可利用碳源供給AM真菌所致。有研究認為，在足夠的磷供應(yīng)條件下，如果菌根侵染率不因磷濃度升高而有所下降時，AM真菌會誘導(dǎo)光合產(chǎn)物從寄主轉(zhuǎn)運至AM真菌[16]。取樣調(diào)查根系發(fā)病情況時發(fā)現(xiàn)，無磷條件下，3 d取樣時，非菌根化植株即有10%的側(cè)根壞死，而接種AM真菌處理到接種后5 d才有零星的側(cè)根壞死，但到接種后9 d取樣時，2處理間的受害程度基本一樣嚴重，這主要是由無磷條件下植株長勢相對較弱，容易受到病原菌的侵害所致。在中等磷條件下，AM真菌的抗病效應(yīng)較為明顯。而在高磷條件下，AM真菌對植株的抗病性基本無影響，這主要由于在該條件下，無論接種與否，植株生長相對較為健壯，不易感染病害。

2.2?不同磷濃度條件下，AM真菌對葉片中多酚氧化酶、過氧化物酶活性的影響

2.2.1?多酚氧化酶活性

不同磷濃度條件下，接種病原菌后植株葉片PPO活性變化見圖1，可以看出，在無磷處理條件下， 菌根化植株葉片中PPO活性在接種病原菌后3 d即達到第1個峰值，且顯著高于對照，到接種病原菌后的7 d出現(xiàn)第2個酶活性高峰，而不接種的對照到接種病原菌后的7 d才達到其僅有的一個峰值，接種后第3天和第7天此時的酶活分別為同時期對照酶活性的8.3倍和1.9倍。當(dāng)營養(yǎng)液中磷水平上升為31 mg/kg 時，菌根化植株葉片中PPO活性的變化趨勢與其相應(yīng)的對照基本一致，即到接種病原菌后7 d，葉片中PPO活性均達到僅有的一個峰值，但接種病原菌后一直以接種AM真菌處理PPO活性較高;當(dāng)磷濃度增加至93 mg/kg 時，接種AM真菌處理葉片中PPO活性于接種病原菌后7 d達峰值，此時的酶活性為相應(yīng)對照的3.4倍，盡管對照酶活性于接種病原菌后3 d就達到其僅有的一個峰值，但此時的酶活性與接種AM真菌處理的酶活性相等。

綜合上述接種病原菌后植株在不同磷濃度條件下葉片中PPO酶活性變化趨勢可以推斷，植株受到病原入侵時，菌根化植株對外源病原菌的侵入表現(xiàn)得更為敏感，而非菌根化植株的反應(yīng)較為遲鈍。即在無磷條件下，接種病原菌后菌根化幼苗葉片中PPO活性較高且峰值出現(xiàn)得較早，而非菌根化植株體內(nèi)PPO活性較低且峰值出現(xiàn)得較晚，且在3種磷濃度條件下，以無磷條件下菌根化植株對病原菌的侵入更為敏感，這可能是在低磷條件下菌根共生體的形成受到了影響所致。

2.2.2?過氧化物酶活性?在無磷處理條件下，接種病原菌后非菌根化植株葉片中POD活性變幅一直明顯大于菌根化處理（圖2），即對照POD活性于接種病原菌后3 d即達到峰值，此時的酶活性為菌根化處理的7.2倍，而菌根化植株葉片POD活性于接種病原菌后5 d達到其僅有的一個峰值。磷濃度為31 mg/kg 時，菌根化植株葉片POD活性于接種病原菌后7 d達到峰值，而不接種的對照比菌根化處理提前2 d 達到其峰值。當(dāng)營養(yǎng)液中磷濃度增加至93 mg/kg時，接種AM真菌處理植株葉片POD活性于接種病原菌后9 d達到峰值，但此時的酶活性與相應(yīng)的對照接近，而對照植株葉片POD活性較相應(yīng)的菌根化處理提前4 d達到最大值，且此時的酶活性為菌根化處理的1.6倍。

在3種磷水平條件下，接種病原菌后，AM真菌對植株體內(nèi)POD活性的影響具有相似的趨勢，結(jié)合植株的發(fā)病情況認為，植株受到病原侵襲時，其體內(nèi)POD活性的變化在很大程度上是植株受害程度的一種體現(xiàn)。具體而言，與菌根化幼苗葉片幼苗葉片中相對穩(wěn)定的POD活性相比，菌根化植株體內(nèi)POD活性變幅較大，且酶活性峰值出現(xiàn)時間早。

早期在番茄上的研究首次證實，AM共生體的形成可誘導(dǎo)寄主產(chǎn)生系統(tǒng)抗性[17]。即植株在受到病原菌攻擊時，被感染的部位會通過一定的方式對病原菌的入侵做出反應(yīng)，同時在未感染病原菌的部位也產(chǎn)生相類似的反應(yīng)。因此，不同磷濃度條件下，接種病原菌后，植株葉片PPO、POD活性的變化在一定程度上反映了植株根系受到病原侵襲時所誘導(dǎo)的防御反應(yīng)，且PPO、POD均與植株的抗病性有關(guān)，相關(guān)研究結(jié)果認為，當(dāng)植株受到病原菌的侵害時，植株體內(nèi)的PPO、POD活性均會升高，以增加其抗病性[18-20]。本研究中，在接種病原菌的條件下，AM真菌對植株體內(nèi)PPO、POD活性的影響不同，其中，菌根化植株P(guān)PO活性峰值總體出現(xiàn)得較早且酶活性較高，而非菌根化植株體內(nèi)PPO活性峰值出現(xiàn)得較晚且相對穩(wěn)定較低;周寶蜊等研究發(fā)現(xiàn)，接種病原菌條件下，菌根真菌可顯著提高寄主PPO活性[21]。菌根化植株體內(nèi)POD活性相對穩(wěn)定，且酶活性峰值出現(xiàn)時間較晚，而非菌根化植株體內(nèi)POD活性變幅較大，且酶活性峰值提早出現(xiàn)。接種病原菌后，當(dāng)介質(zhì)中無磷供給時，非菌根化幼苗葉片中POD活性的變化尤為明顯。這與已報道的相關(guān)研究結(jié)果[22]一致。

。

3?結(jié)論

在接種病原菌密度為5×104 CFU/mL的條件下，基質(zhì)中磷濃度影響植株的抗病性。其中，磷濃度為31 mg/kg時，AM真菌的促生效應(yīng)不明顯，但可明顯提高黃瓜幼苗對枯萎病的抗性。無磷條件下，AM真菌表現(xiàn)出顯著的促生效應(yīng)，但因植株長勢較弱，抗病能力極低。高磷條件下，接種AM真菌可在一定程度上減輕病害。G. versiforme（G.v）在較高的磷濃度（93 mg/kg）條件下，其菌根侵染率仍高達40.2%，因此在黃瓜生產(chǎn)中可將其引入磷含量較高的土壤，提高植株的抗病性。植株受到病原入侵時，植株體內(nèi)PPO活性的變化可作為植株受病原菌入侵后做出迅速反應(yīng)的指標;而接種病原菌后植株葉片中POD活性的變化只是病癥表現(xiàn)的反映。

參考文獻：

[1]沈?辰，熊?露，韓書慶，等. 我國果菜類蔬菜生產(chǎn)與流通形勢分析[J]. 中國蔬菜，2017（9）：7-11.

[2]張真和. 我國發(fā)展現(xiàn)代蔬菜產(chǎn)業(yè)面臨的突出問題與對策[J]. 中國蔬菜，2014（8）：1-6.

[3]喻景權(quán)，周?杰. “十二五”我國設(shè)施蔬菜生產(chǎn)和科技進展及其展望[J]. 中國蔬菜，2016（9）：18-30.

[4]路?粉，王文橋. 我國蔬菜殺菌劑及其應(yīng)用狀況[J]. 中國蔬菜，2017（10）：6-13.

[5]Smith S E，Read D J. Mycorrhizal symbiosis[M]. 3rd ed. London：Academic Press，2008.

[6]Kubota M，McGonigle T P，Hyakumachi M. Co-occurrence of Arum- and Paris-type morphologies of arbuscular mycorrhizae in cucumber and tomato[J]. Mycorrhiza，2005，15（2）：73-77.

[7]Díaz F，Alvarado C，Ortiz C，et al. Plant nutrition and fruit quality of pepper associated with arbuscular mycorrhizal in greenhouse[J]. Revista Mexicana de Ciencias Agrícolas，2013，4（2）：315-321.

[8]Valentine A J，Osborne B A，Mitchell D T. Interactions between Phosphorus supply and total nutrient availability on mycorrhizal colonization，growth and photosynthesis of cucumber[J]. Scientia Horticulturae，2001，88（3）：177-189.

[9]Chen S C，Jin W J，Liu A R，et al. Arbuscular mycorrhizal fungi（AMF）increase growth and secondary metabolism in cucumber subjected to low temperature stress[J]. Scientia Horticulturae，2013，160（3）：222-229.

[10]Miransari M. Contribution of arbuscular mycorrhizal symbiosis to plant growth under different types of soil stress[J]. Plant Biology，2010，12（4）：563-569.

[11]Yan L，Chen Y L，Min L，et al. Effects of arbuscular mycorrhizal fungi communities on soil quality and the growth of cucumber seedlings in a greenhouse soil of continuously planting cucumber[J]. Pedosphere，2012，22（1）：79-87.

[12]Chandanie W A，Kubota M，Hyakumachi M. Interaction between arbuscular mycorrhizal fungus Glomus mosseae and plant growth promoting fungus Phoma sp. on their root colonization and growth promotion of cucumber（Cucumis sativus L.）[J]. Mycoscience，2005，46（3）：201-204.

[13]Chandanie W A，Kubota M，Hyakumachi M. Interaction between the arbuscular mycorrhizal fungus Glomus mosseae and plant growth-promoting fungi and their significance for enhancing plant growth and suppressing damping-off of cucumber（Cucumis sativus L.）[J]. Applied Soil Ecology，2009，41（3）：336-341.

[14]Phillips J M，Hayman D S，Improved procedures for clearing roots and staining parasitic and vesicular arbuscular mycorrhiza fungi for rapid assessment of infection[J]. Transactions of British Mycological Society，2010，55：158-161.

[15]李合生. 植物生理生化實驗原理與技術(shù)指導(dǎo)[M]. 北京：高等教育出版社，2000.

[16]Hayman D S. Vesicular-arbuscular mycorrhizas in field crop system[M]. Boca Raton：CRC press，1987.

[17]Cordier C，Pozo M J，Barea J M，et al. Cell defense responses associated with localized and systemic resistance to Phytophthora parasitica induced in tomato by an arbuscular mycorrhizal fungus[J]. Molecular Plant-Microbe Interactions，1998，11（10）：1017-1028.

[18]王紅英，錢春桃，張永兵，等. 不同抗性甜瓜接種蔓枯病菌后若干生理指標的變化[J]. 中國瓜菜，2012，25（1）：7-10.

[19]郭勤衛(wèi)，王紅英，李?季，等. BTH處理對甜瓜苗期抗蔓枯病相關(guān)POD和PPO酶活性的影響[J]. 中國瓜菜，2013，26（6）：7-10.

[20]張?寧，畢研飛，郭?靜，等. 不同抗性甜瓜接種蔓枯病菌后PAL、PPO與POD活性的變化[J]. 植物生理學(xué)報，2016，52（8）：1169-1175.

[21]周寶蜊，鄭繼東，畢曉華，等. 叢枝菌真菌對茄子黃萎病的防治效果和茄子植株生長的影響[J]. 生態(tài)學(xué)雜志，2015，34（4）：1026-1030.

[22]王倡憲，秦?嶺，馮?固，等. 叢枝菌根真菌對接種尖孢鐮刀菌后黃瓜根系次生代謝物的影響[J]. 植物保護學(xué)報，2005，32（2）：148-152.