• <tr id="yyy80"></tr>
  • <sup id="yyy80"></sup>
  • <tfoot id="yyy80"><noscript id="yyy80"></noscript></tfoot>
  • 99热精品在线国产_美女午夜性视频免费_国产精品国产高清国产av_av欧美777_自拍偷自拍亚洲精品老妇_亚洲熟女精品中文字幕_www日本黄色视频网_国产精品野战在线观看 ?

    我國主產(chǎn)地溫石棉可吸入纖維致鼠肺損傷與抑癌基因p53、p16的表達

    2019-11-28 05:15:10曾婭莉鄒文蓉董發(fā)勤張青碧鄧建軍
    巖石礦物學雜志 2019年6期
    關(guān)鍵詞:石棉染毒粉塵

    曾婭莉,崔 琰,鄒文蓉,馬 驥,董發(fā)勤,張青碧,鄧建軍,楊 潔,高 ●

    (1. 四川綿陽四○四醫(yī)院, 四川 綿陽 621000; 2. 西南醫(yī)科大學, 四川 瀘州 646000; 3. 西南科技大學, 四川 綿陽 621000)

    吸入性粉塵可引起呼吸、心血管、血液系統(tǒng)甚至病毒傳播等疾病(Guanetal., 2016; Wangetal., 2016; Yeetal., 2016; Gaoetal., 2017),危害人體健康。我國是溫石棉生產(chǎn)和使用大國,人們在生產(chǎn)和使用過程中產(chǎn)生大量吸入性纖維粉塵,污染環(huán)境。國際上對溫石棉的安全性一直存在較大爭議,長期吸入這些粉塵是否致肺損傷或肺癌性未知。國外研究資料(Bernsteinetal., 2013; Gaoetal., 2015; Bauretal., 2015; Gilhametal., 2016)顯示,溫石棉具有致間皮瘤或者肺癌的風險。國內(nèi)關(guān)于可吸入性溫石棉纖維粉塵的安全性研究較少,杜利利等(2014)的流行病學調(diào)查顯示長期接觸溫石棉的礦工,其肺癌、石棉肺、肺心病、呼吸系統(tǒng)疾病的死亡率明顯提高。近年來本課題組一直從事溫石棉粉塵職業(yè)病和安全性的基礎(chǔ)性研究。曾婭莉等(2013)通過細胞培養(yǎng)技術(shù)、體外分析比較了四川新康及陜西陜南溫石棉的安全性,結(jié)果顯示兩種溫石棉對細胞生長具有較強抑制作用,顯著下調(diào)p16和p53蛋白,有誘導癌癥發(fā)展的風險。柏●等(2017)采用多次非暴露式氣管滴注的染毒法研究了四川新康溫石棉纖維粉塵對雄性Wistar大鼠肺組織的危害,檢測了各項生化指標,結(jié)果顯示四川新康溫石棉纖維粉塵可致大鼠肺損傷。王玉琳等(2018)研究發(fā)現(xiàn)溫石棉可通過ROS途徑激活線粒體凋亡通路,誘導A549細胞發(fā)生凋亡。黃鳳德等(2018)分析了四大礦區(qū)溫石棉的物相成分、譜學特征等,研究比較了四大礦區(qū)溫石棉對A549細胞的生長抑制和細胞周期的影響,實驗結(jié)果顯示四大礦區(qū)溫石棉的主要物相是斜纖蛇紋石,但不同產(chǎn)地的溫石棉結(jié)構(gòu)表面完善性、化學基團存在差異,4種溫石棉纖維粉塵均于G2/M期阻滯A549細胞。由于青海茫崖、甘肅阿克塞、陜西陜南和四川新康礦區(qū)是我國溫石棉主要產(chǎn)地,目前尚缺乏對4種主產(chǎn)地的溫石棉纖維粉塵在生物體內(nèi)對呼吸系統(tǒng)損傷和致癌風險的比較和評估。課題組在前期研究的基礎(chǔ)上,選取由我國四大礦區(qū)溫石棉制備成的可吸入纖維粉塵,研究比較了可吸入溫石棉粉塵對Wistar大鼠肺組織的有無損傷及損程度,同時檢測了大鼠的抑癌基因p53、p16,評估其有無致癌風險,從體內(nèi)和分子水平探討了我國四大礦區(qū)可吸入性溫石棉的生物安全性,欲為環(huán)境檢測和職業(yè)病防護提供理論依據(jù)。

    1 材料與方法

    1.1 材料

    1.1.1 實驗對象

    實驗對象為體重180~200 g的Wistar雄性大鼠,購買自華西醫(yī)科大學SP級實驗動物中心。四大礦區(qū)溫石棉分別采自青海省茫崖礦區(qū)、甘肅省阿克塞礦區(qū)、陜西省陜南礦區(qū)和四川省新康礦區(qū)。

    1.1.2 試劑和儀器

    試劑有HE試劑(武漢博士德生物工程有限公司)、Triol試劑提取盒(北京TIANGEN BIOTECH CO,LTD)、Prime Script TM RT reagent Kit with gDNA Eraser和PCR試劑(大連Takara公司),引物由Takara公司設(shè)計。

    儀器有高速多功能粉碎機(RH-800,浙江榮浩工貿(mào)有限公司)、臥式行星球磨機(QM-3SP4J,南京大學儀器廠)、激光粒度分析儀(90 plus,美國Brookhaven公司)、紅外光譜儀(Spectrum One,美國PE公司)、RT-PCR擴增儀(Mastercycler X50h,德國Eppendorf公司)、DNA/RNA測定儀(ND-1000,美國Nano Drop)、凝膠電泳成像系統(tǒng)(GelDocXR,美國BIO-RAD公司)、凝膠電泳掃描儀(GE Image scanner III,美國GE Healthcare公司)。

    1.2 實驗方法

    1.2.1 可吸入溫石棉纖維粉塵的制備

    4種產(chǎn)地的可吸入溫石棉纖維由高速粉碎機初步粉碎至 60目,按照粒料液(無水乙醇)比1∶1,用球磨機濕磨,檢測纖維粒徑。當纖維粒徑約為5 μm時收集礦漿,120 ℃烘干,再次磨碎,400目過篩,高壓滅菌,加生理鹽水配置成8 mg/mL儲存液,備用。

    1.2.2 粉塵染毒W(wǎng)istar雄性大鼠造模

    將8~10 周齡健康未成年Wistar雄性大鼠54只,隨機分為3組即2 mg/mL染毒組、陰性和陽性對照組,每組18只,分籠喂養(yǎng),適應性喂養(yǎng)1 周。將4種溫石棉儲備液分別稀釋為2.0 mg/mL應用液,加入青霉素鈉8 000 U/mL,超聲處理30 min,采用非暴露式氣管滴注法染毒W(wǎng)istar雄性大鼠,每次滴注0.5 mL,間隔1個月滴注1次。陽性對照組將苯并芘溶于玉米油配成40 mg/mL染毒液,陰性對照組使用生理鹽水,每次滴注0.1 mL。滴注后大鼠自由飲水、進食,觀察其生長、發(fā)育及活動等一般情況。

    1.2.3 纖維粒徑、物相和化學成分特征

    采用90 plus激光粒度分析儀檢測各組溫石棉纖維粒徑,采用Spectrum One傅里葉變換紅外光譜儀分析研磨后的粉塵結(jié)構(gòu)和表面化學基團。

    1.2.4 肺組織臟器系數(shù)和病理檢測

    分別于染毒1、3及6 個月時稱重后處死Wistar大鼠,迅速分離肺組織并稱量,置-80℃冰箱保存?zhèn)溆谩istar大鼠的肺組織臟器系數(shù)=肺組織(g)/體重(g)。肉眼觀察處死Wistar大鼠的肺組織外觀,選取主支氣管周圍肺組織,生理鹽水反復沖洗。置10%福爾馬林溶液中固定,常規(guī)脫水,石蠟包埋,切片,HE染色,光學顯微鏡下觀察肺組織的病理變化。

    1.2.5 染毒W(wǎng)istar大鼠肺p53和p16基因檢測

    將處死Wistar大鼠的肺組織,按Triol試劑盒說明書提取總RNA,DNA/RNA測定儀檢測RNA的濃度和純度,調(diào)整RNA濃度一致,按照聚合酶鏈反應(polymerase chain reaction, PCR)試劑說明書進行PCR擴增。引物設(shè)計: p53引物,104pb,正向5’→3’: AGGAAATCCGTATGCTGAGTATCTG,反向5’→3’: GGATAGTGGTATAGTCGGAGCCG); p16引物, 97pb, 正向5’→3’CTAGAGCGGGGACATCACGA,反向5’→3’: AGCAGAAGTTATGCCTGTCGGT)。擴增條件:94℃變性2 min,94℃ 30 s、63℃ 30 s、72℃20 s,循環(huán)35次,72℃終末延伸3 min。瓊脂糖凝膠電泳PCR產(chǎn)物,凝膠電泳成像系統(tǒng)對電泳條帶照相和灰度值的掃描,以β-actin為內(nèi)參對照。

    1.3 統(tǒng)計學處理

    2 結(jié)果

    2.1 纖維粉塵粒徑分布

    4種溫石棉纖維通過臥式行星球磨機濕磨20 h,收集樣本。采用90 plus激光粒度分析儀測定粒徑,結(jié)果見表1。從纖維粒度分布數(shù)據(jù)來看各纖維的平均粒徑均小于或接近5 μm,符合可吸入粉塵粒徑要求。

    表 1 濕磨法20 h的四大礦區(qū)溫石棉纖維粒度分布 μmTable 1 Particle size distribution of chrysotile fibers in four main mining areas with 20 h wet grinding

    注:d10對應的粒徑數(shù)據(jù)表示小于此粒徑的顆粒體積分數(shù)占全部顆粒的10%,d25、d50、d75以此類推。

    2.2 研磨前后粉塵的結(jié)構(gòu)和官能基團分析

    Salamatipour等(2016)研究顯示,研磨石棉的方法不同可顯著影響粉塵表面含鐵量,鐵可誘導細胞產(chǎn)生的活性氧,從而形成細胞毒性差異,并建議在研究石棉纖維的細胞毒性時應詳細描述粉塵制備方式。本研究中采用濕磨法,為了使研磨后的各樣品粒徑小于10 μm,又防止過度研磨破壞纖維表面結(jié)構(gòu)從而干擾實驗結(jié)果,通過紅外光譜分析了研磨后各纖維粉塵組化學基團,以分析研磨后的粉塵是否有理化性質(zhì)改變。

    Enrico等(2009)研究發(fā)現(xiàn),溫石棉的結(jié)晶度和OH-含量與其在動物體內(nèi)的溶解性、降解及細胞毒性相關(guān)。由圖1可見,經(jīng)過研磨后的4種溫石棉樣品的FT-IR圖譜的吸收峰的峰位峰形基本不變。 比較4種圖譜, 發(fā)現(xiàn)茫崖、陜南溫石棉在(1 622、1 618 cm-1)附近的吸收譜帶向高波數(shù)偏移,新康溫石棉在(1 630、1 455 cm-1)附近的吸收譜帶發(fā)生了偏移。這是由于紅外光譜對陽離子質(zhì)量和電價比較敏感,OH-伸縮振動頻率受到與OH-配位的八面體陽離子的影響產(chǎn)生分裂并向低波數(shù)方向位移。阿克塞和陜南溫石棉在1 060 cm-1附近的Si—O伸縮振動峰吸收帶分裂比茫崖和新康石棉明顯,表明這兩種溫石棉的表面結(jié)構(gòu)較茫崖和新康溫石棉的完善。通過上述分析,可初步確定4種溫石棉樣品為纖蛇紋石,研磨后的溫石棉粉塵結(jié)晶度和化學基團未發(fā)生明顯變化。

    2.3 肺組織外觀

    4種溫石棉纖維粉塵染毒W(wǎng)istar大鼠1~6個月,肺組織病變基本相似,肺損傷程度與染毒時間呈正比,4種產(chǎn)地的溫石棉纖維粉塵染毒W(wǎng)istar大鼠肺組織病變程度不同。與對照組相比,染毒1個月,Wistar大鼠肺組織體積變大,氣管周圍充血明顯,表面可見少量白色瘤狀突起,凹凸不平。染毒3個月,Wistar大鼠肺外觀充血明顯,體積比染毒1個月時縮小,肺組織塌陷,皺縮,肺表面的白色瘤狀增多。染毒6個月,Wistar大鼠肺體積進一步縮小,組織實變,彈性變差,充血明顯,肺組織表面凹凸不平加重,4種溫石棉染毒后肺組織均未發(fā)現(xiàn)肉眼可見瘤變。圖2顯示的是茫崖溫石棉染毒W(wǎng)istar大鼠組肺外觀,其余各染毒組肺組織外觀相似。

    2.4 肺組織臟器系數(shù)

    與陰性對照組比較,染毒1 個月,4組溫石棉纖維粉塵染毒W(wǎng)istar大鼠肺系數(shù)變化無顯著差異。染毒3個月,新康、茫崖和陜南溫石棉纖維粉塵染毒的Wistar大鼠體重明顯減輕,肺重量顯著增加,肺系數(shù)變大,變化具有顯著意義(P<0.05)。染毒6個月,4組溫石棉纖維粉塵染毒W(wǎng)istar大鼠肺系數(shù)增大,變化具有顯著意義(P<0.05),如表2所示。染毒6個月,4組可吸入溫石棉纖維粉塵染毒W(wǎng)istar大鼠肺組織臟器系數(shù)由大到小的順序均為: 新康>茫崖>阿克塞>陜南。

    圖 1 我國四大礦區(qū)溫石棉研磨后的FT-IR圖Fig.1 FT-IR diagrams of chrysotile grinding 20 h in four main mining areas of China

    圖 2 茫崖溫石棉染毒1、3、6個月Wistar大鼠肺組織外觀圖Fig.2 1, 3 and 6 months lung histomorphology of Wistar rats exposed to 2.0 mg/mL chrysotile asbestos in Mangya

    表 2 我國四大礦區(qū)溫石棉染毒1、3、6個月Wistar大鼠肺組織肺系數(shù)Table 2 Lung organ visceral coefficient of Wistar rats exposed to chrysotile asbestos fiber dust at the time in 1, 3, 6 months in four major mining areas of China

    a表示與對照組比較有顯著差異(P<0.05)。

    2.5 肺組織病理切片(HE染色)

    4組溫石棉染毒W(wǎng)istar大鼠肺組織均發(fā)生顯著的病理改變,出現(xiàn)不同程度的充血、水腫、炎性細胞和巨噬細胞浸潤,肺間隔增寬,平滑肌破壞,肺泡大小不均和數(shù)量減少。隨著粉塵作用時間延長,各染毒組Wistar大鼠肺病變逐漸加重,出現(xiàn)嚴重肺實變、纖維化,肺泡細胞大量破裂,肺組織塌陷。不同產(chǎn)地溫石棉致病變的方式不同,阿克塞溫石棉組的Wistar大鼠肺以出血和炎癥細胞浸潤為主,茫崖溫石棉組的Wistar大鼠肺以炎癥細胞浸潤為主,肺泡輕度改變;陜南和新康溫石棉組染毒的Wistar大鼠肺以肺間隔增寬、支氣管周圍炎性細胞浸潤病變?yōu)橹?圖3)。

    2.6 肺組織p53、p16基因檢測

    與陰性對照組相比,染毒1個月時各組p53基因表達無顯著性降低;染毒3個月時,除四川新康外各染毒組p53基因均降低,與對照組相比差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05);染毒6個月時各組p53基因進一步降低表達降低,與對照組相比差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。p53基因降低趨勢由大到小為:阿克塞>陜南>茫崖>新康(圖4)。

    與陰性對照組相比,染毒1個月時除阿克塞溫石棉組外,其余各組p16基因表達均顯著性降低,染毒3~6個月各組p16基因表達進一步降低,與對照組相比差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。p16基因表達降低趨勢由大到小為:新康>茫崖>阿克塞>陜南(圖5)。

    圖 3 四大溫石棉礦區(qū)可吸入纖維粉塵染毒W(wǎng)istar 大鼠的肺組織HE切片圖Fig.3 HE section of lung tissue of Wistar rats exposed to inhalable fiber dust at the time in 1, 3, 6 months in four main chrysotile asbestos mining areas

    3 討論

    3.1 溫石棉可改變肺組織外觀及肺臟系數(shù)

    由不同染毒時間Wistar肺組織外觀可見,我國四大產(chǎn)地可吸入溫石棉纖維粉塵均不同程度損害肺組織,使肺組織產(chǎn)生炎性或纖維化改變,但未見瘤樣組織。臟器系數(shù)是毒理實驗中常用指標,動物染毒后,受損臟器重量可發(fā)生改變,臟器系數(shù)也隨之改變。臟器系數(shù)增大,表示臟器充血、水腫或增生肥大等病變;臟器系數(shù)減小,表示臟器萎縮及其他退行性改變。與對照組比較,溫石棉纖維粉塵染毒W(wǎng)istar大鼠1個月,肺臟系數(shù)無顯著性變化,染毒3~6個月,Wistar大鼠體重逐漸降低,肺組織重量逐漸增加,肺臟系數(shù)隨之增大,與對照組相比差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。肺臟器系數(shù)和肺組織外觀結(jié)果顯示我國四大產(chǎn)地的溫石棉可吸入纖維粉塵可損害肺組織,使肺組織充血、水腫或肥大增生,隨之實變,損傷程度和病變方式隨產(chǎn)地不同。Kim等(2015)研究發(fā)現(xiàn)暴露于高濃度石棉環(huán)境中礦工體內(nèi)的肺石棉斑和肺纖維化顯著高于正常人,CT結(jié)果顯示胸膜石棉斑塊數(shù)量和大小不同。Lemaire等(1986)研究發(fā)現(xiàn)石棉肺病變特點是巨噬細胞積累,成纖維細胞增殖和膠原沉積。這些研究顯示溫石棉的可吸入纖維粉塵可致肺組織損傷,長期吸入可使肺組織纖維化,與本研究結(jié)果一致。

    圖 4 我國四大礦區(qū)溫石棉纖維粉塵染毒W(wǎng)istar大鼠肺組織的p53基因表達Fig. 4 p53 gene expression in lung tissue of Wistar rats exposed to chrysotile asbestos fiber dust at the time in 1, 3, 6 months in four major mining areas of China

    圖 5 我國四大礦區(qū)溫石棉纖維粉塵染毒W(wǎng)istar大鼠肺組織的p16基因表達Fig. 5 p16 gene expression in lung tissue of Wistar rats exposed to chrysotile asbestos fiber dust at the time in 1, 3, 6 months in four major mining areas of China

    3.2 溫石棉可致肺組織病理改變

    HE染色結(jié)果顯示,4種溫石棉可吸入纖維粉塵可不同程度和方式損傷肺組織結(jié)構(gòu),長期染毒均可使肺組織纖維化(圖2、圖3)。FT-IR分析結(jié)果顯示,溫石棉主要成分、化學基團與表面結(jié)構(gòu)的完善性與產(chǎn)地之間存在差異(圖1),這可能與4種產(chǎn)地溫石棉對生物安全性不同相關(guān)。溫石棉主要結(jié)構(gòu)為由硅氧(SiO2)四面體和Mg(OH)2八面體組成的具雙層型結(jié)構(gòu)的三八面體硅酸鹽礦物,不同產(chǎn)地溫石棉的SiO2和雜質(zhì)含量不同。Piao等(2001)研究顯示暴露于SiO2顆??芍麓笫蠓谓M織損傷,早期主要表現(xiàn)為炎癥,后期為肺間質(zhì)纖維化。4種不同產(chǎn)地溫石棉可吸入纖維粉塵對Wistar大鼠肺組織損傷程度與方式可能與SiO2和雜質(zhì)含量相關(guān)。

    關(guān)于溫石棉的細胞毒性和機制國內(nèi)有少量研究。查雨欣等(2017)研究發(fā)現(xiàn),新康和茫崖溫石棉可致大鼠體內(nèi)產(chǎn)生過量ROS,導致脂質(zhì)過氧化作用,抗氧化酶SOD耗竭或失代償,清除自由基的能力下降,造成大鼠肺氧化應激損傷,不同地域溫石棉氧化損傷作用存在差異。黃鳳德等(2018)研究顯示我國4大主產(chǎn)地的溫石棉均不同程度地抑制A549細胞增殖,誘導細胞凋亡和阻滯細胞周期,推測溫石棉誘導細胞與凋亡大小與不同產(chǎn)地的化合物雜質(zhì)含量不同相關(guān)。曾婭莉等(2012)研究顯示溫石棉纖維對V79細胞具有細胞毒性,其毒性大小與溫石棉在有機酸中的溶蝕性相關(guān)。何靜等(2014)研究發(fā)現(xiàn)不同礦床的溫石棉,因生成條件不盡相同,表現(xiàn)活性基團不同,則對細胞的毒性不同,這些研究與本實驗結(jié)果相似,具體原因還需進一步研究。

    3.3 溫石棉降低肺p53、p16基因表達

    p53基因具有抑制細胞分裂、修復損傷的DNA以及誘導細胞凋亡等功能。p53基因時刻監(jiān)控著細胞染色體DNA的完整性,參與DNA的復制與修復,如果修復失敗,p53蛋白即啟動凋亡,誘導細胞自殺,從而防止細胞惡變。p16基因是參與細胞周期調(diào)控的基本基因,可調(diào)節(jié)細胞的增殖及分裂。目前研究資料認為p16是比p53更為重要的一種新型抗癌基因,有人把它比作細胞周期中的剎車裝置,一旦失靈則會導致細胞惡性增殖,導致惡性腫瘤發(fā)生。p53、p16基因是細胞周期重要的調(diào)控因子和抑癌基因,它可修復受損的DNA,避免細胞癌變,與肺癌的發(fā)病密切相關(guān)(Demirhanetal., 2010; Stankovicetal., 2014; Yangetal., 2017)。它們的降低,意味著個體容易發(fā)生癌變,檢測p53和p16基因?qū)δ[瘤的診斷具有十分重要的意義。

    本實驗檢測到我國四大產(chǎn)地的溫石棉可吸入纖維染毒W(wǎng)istar大鼠后均降低抑癌基因p16和p53表達,但不同產(chǎn)地的溫石棉纖維粉塵對p53與p16降低的程度不同。 Mishra 等(1997)研究顯示老鼠暴露于溫石棉纖維的氣溶膠24 h,免疫組化法檢測到p53蛋白升高,8 d開始下降,14 d后低于正常水平。曾婭莉等(2013)研究顯示我國四大產(chǎn)地的溫石棉均不同程度抑制V79細胞生長,下調(diào)p16和p53,有誘導癌癥發(fā)展的風險。葉微等(2015)研究顯示4種溫石棉的單細胞凝膠電泳實驗和V79細胞微核實驗可致細胞染色體和DNA的不穩(wěn)定性,這些研究與本實驗結(jié)果類似。至于溫石棉致腫瘤的風險評估,還需進一步證實。

    4 結(jié)論

    (1) 我國四大溫石棉礦區(qū)可吸入纖維粉塵不同程度損傷Wistar大鼠肺組織,可致肺出血、水腫、炎癥細胞浸潤的急性損傷,長期暴露可致肺組織纖維化。

    (2) 我國四大溫石棉礦區(qū)可吸入纖維粉塵可不同程度下調(diào)Wistar大鼠肺組織p53、p16抑癌基因,具有致肺癌的風險。

    猜你喜歡
    石棉染毒粉塵
    高壓粉塵防爆電機過厚粉塵層的形成與分析
    防爆電機(2021年6期)2022-01-17 02:40:28
    大生產(chǎn)
    香煙煙霧染毒改良方法的應用*
    粉塵大戰(zhàn)
    染毒的臍帶
    光散射法粉塵儀在超低排放的應用
    PM2.5毒理學實驗染毒方法及毒理學效應
    石棉聯(lián)社舉辦農(nóng)信杯柑甜歡樂拍
    石棉粉塵危害與預防
    勞動保護(2016年2期)2016-03-10 15:09:00
    歐洲國家應盡快消除石棉相關(guān)疾病
    勞動保護(2015年6期)2015-06-16 02:14:47
    色尼玛亚洲综合影院| av国产免费在线观看| 床上黄色一级片| 岛国在线免费视频观看| 成年免费大片在线观看| 久久久久久久久中文| 日本黄色视频三级网站网址| 国产精品免费一区二区三区在线| 99riav亚洲国产免费| 国产v大片淫在线免费观看| 精品久久久久久久人妻蜜臀av| 亚洲成人免费电影在线观看| 欧美午夜高清在线| av超薄肉色丝袜交足视频| 又爽又黄无遮挡网站| 亚洲av成人一区二区三| 欧美又色又爽又黄视频| 天天添夜夜摸| 三级毛片av免费| 中文字幕久久专区| 国产99白浆流出| 91麻豆精品激情在线观看国产| 亚洲黑人精品在线| 人妻久久中文字幕网| 在线观看舔阴道视频| 久久精品人妻少妇| 久久久久久大精品| 最新在线观看一区二区三区| 成人永久免费在线观看视频| 男女午夜视频在线观看| 日韩欧美免费精品| 国产视频内射| 老司机深夜福利视频在线观看| 神马国产精品三级电影在线观看 | 亚洲国产精品久久男人天堂| 在线观看66精品国产| 在线观看一区二区三区| 亚洲精品久久国产高清桃花| 成人18禁高潮啪啪吃奶动态图| 国产精品98久久久久久宅男小说| 宅男免费午夜| 午夜精品在线福利| 免费观看精品视频网站| 午夜福利高清视频| 亚洲av日韩精品久久久久久密| 午夜精品久久久久久毛片777| 黄色a级毛片大全视频| 国产精品久久久久久久电影 | 女人高潮潮喷娇喘18禁视频| 精品国产乱码久久久久久男人| 精品一区二区三区四区五区乱码| 国产亚洲精品综合一区在线观看 | 校园春色视频在线观看| 国语自产精品视频在线第100页| 色噜噜av男人的天堂激情| 久久精品国产亚洲av高清一级| 少妇的丰满在线观看| 女人爽到高潮嗷嗷叫在线视频| 亚洲精品在线观看二区| 国产伦人伦偷精品视频| 欧美中文综合在线视频| 成人特级黄色片久久久久久久| 欧美午夜高清在线| 成人手机av| 精品第一国产精品| 久久婷婷成人综合色麻豆| 波多野结衣高清作品| tocl精华| 一区二区三区国产精品乱码| av天堂在线播放| 亚洲av电影在线进入| 国产成人一区二区三区免费视频网站| 亚洲一区二区三区不卡视频| 欧美在线黄色| 一边摸一边抽搐一进一小说| 怎么达到女性高潮| 久久欧美精品欧美久久欧美| 亚洲欧美一区二区三区黑人| 日本在线视频免费播放| 欧美日韩黄片免| 国产高清视频在线观看网站| 麻豆成人午夜福利视频| 好看av亚洲va欧美ⅴa在| 日韩欧美精品v在线| 在线观看美女被高潮喷水网站 | 999久久久国产精品视频| 国产午夜精品久久久久久| 可以在线观看的亚洲视频| 国产激情偷乱视频一区二区| 神马国产精品三级电影在线观看 | 精品少妇一区二区三区视频日本电影| 丰满的人妻完整版| 欧美色视频一区免费| 亚洲 欧美一区二区三区| 日本免费一区二区三区高清不卡| 国产一区二区三区在线臀色熟女| 可以免费在线观看a视频的电影网站| 99国产精品一区二区三区| 五月伊人婷婷丁香| 麻豆av在线久日| 久久人妻av系列| 动漫黄色视频在线观看| 亚洲精品粉嫩美女一区| 成年免费大片在线观看| 国产精品99久久99久久久不卡| 少妇被粗大的猛进出69影院| 好男人在线观看高清免费视频| 99精品在免费线老司机午夜| 日韩欧美精品v在线| 99国产精品一区二区蜜桃av| 国内精品久久久久精免费| 男人舔女人的私密视频| 日本免费a在线| 欧美日韩亚洲国产一区二区在线观看| 午夜两性在线视频| 亚洲无线在线观看| 人妻久久中文字幕网| 精品少妇一区二区三区视频日本电影| 国产三级黄色录像| 99久久综合精品五月天人人| 国产精品免费视频内射| 天堂√8在线中文| 免费在线观看黄色视频的| 99久久99久久久精品蜜桃| 一级a爱片免费观看的视频| 久久久久久久精品吃奶| 成人18禁高潮啪啪吃奶动态图| 我的老师免费观看完整版| 色综合站精品国产| 亚洲一区高清亚洲精品| 一二三四在线观看免费中文在| 丰满人妻一区二区三区视频av | 麻豆国产97在线/欧美 | 久久久久亚洲av毛片大全| 在线观看美女被高潮喷水网站 | 国产野战对白在线观看| www.www免费av| 啦啦啦观看免费观看视频高清| www.自偷自拍.com| 性色av乱码一区二区三区2| 法律面前人人平等表现在哪些方面| 黑人巨大精品欧美一区二区mp4| 亚洲av成人av| 首页视频小说图片口味搜索| 亚洲 欧美 日韩 在线 免费| 久久中文字幕一级| 在线播放国产精品三级| 好男人电影高清在线观看| 免费观看人在逋| www.熟女人妻精品国产| 男人舔女人的私密视频| 亚洲一码二码三码区别大吗| 人妻丰满熟妇av一区二区三区| 久久欧美精品欧美久久欧美| 最近最新免费中文字幕在线| 午夜精品一区二区三区免费看| 午夜福利在线在线| 色精品久久人妻99蜜桃| 欧美日本视频| 黄片小视频在线播放| 久久精品国产亚洲av高清一级| 欧美3d第一页| av福利片在线观看| 亚洲片人在线观看| 一级作爱视频免费观看| 老司机在亚洲福利影院| videosex国产| 制服人妻中文乱码| 久久人人精品亚洲av| 99久久无色码亚洲精品果冻| 日日摸夜夜添夜夜添小说| 日韩成人在线观看一区二区三区| 在线观看午夜福利视频| 亚洲专区字幕在线| 黄片小视频在线播放| 国内精品久久久久久久电影| 亚洲人成网站在线播放欧美日韩| 制服丝袜大香蕉在线| 日韩欧美国产在线观看| 亚洲乱码一区二区免费版| 日本 欧美在线| 怎么达到女性高潮| 午夜福利欧美成人| 午夜激情福利司机影院| 国产精品一区二区精品视频观看| 欧美性猛交黑人性爽| 欧美日韩亚洲国产一区二区在线观看| 欧美+亚洲+日韩+国产| 久久久久久久精品吃奶| 国产精品野战在线观看| 免费av毛片视频| 可以在线观看的亚洲视频| 岛国在线观看网站| av有码第一页| 中文字幕最新亚洲高清| 精品人妻1区二区| 亚洲五月天丁香| 亚洲 欧美一区二区三区| 欧美在线黄色| 久久久久性生活片| 亚洲精品在线美女| 免费搜索国产男女视频| 亚洲中文日韩欧美视频| 久久中文看片网| 国产日本99.免费观看| 亚洲精品一卡2卡三卡4卡5卡| 亚洲精品国产精品久久久不卡| 成人三级做爰电影| 嫩草影视91久久| 一级片免费观看大全| 国产精品电影一区二区三区| 男女下面进入的视频免费午夜| 一级作爱视频免费观看| 欧美成人午夜精品| 亚洲七黄色美女视频| 50天的宝宝边吃奶边哭怎么回事| 男女下面进入的视频免费午夜| av福利片在线| 全区人妻精品视频| 国产精品久久久久久人妻精品电影| 中文字幕久久专区| 精品国产美女av久久久久小说| 99久久国产精品久久久| 不卡一级毛片| 国模一区二区三区四区视频 | 国产av在哪里看| 这个男人来自地球电影免费观看| 欧美性长视频在线观看| 欧美黑人欧美精品刺激| 色综合欧美亚洲国产小说| 麻豆久久精品国产亚洲av| 久久精品国产亚洲av高清一级| 国产99久久九九免费精品| 国产不卡一卡二| bbb黄色大片| 国产精品99久久99久久久不卡| 90打野战视频偷拍视频| 成人18禁高潮啪啪吃奶动态图| 亚洲自拍偷在线| 成人手机av| 亚洲最大成人中文| 亚洲av电影在线进入| 最新美女视频免费是黄的| 国产三级在线视频| 久久性视频一级片| 婷婷精品国产亚洲av| 淫秽高清视频在线观看| 国产探花在线观看一区二区| 精品乱码久久久久久99久播| 成人三级做爰电影| 亚洲欧美日韩无卡精品| 美女 人体艺术 gogo| 久热爱精品视频在线9| 最近视频中文字幕2019在线8| 国产人伦9x9x在线观看| 午夜福利欧美成人| 成年女人毛片免费观看观看9| 我的老师免费观看完整版| 男女视频在线观看网站免费 | 午夜福利在线观看吧| 韩国av一区二区三区四区| 天堂动漫精品| 两个人看的免费小视频| 草草在线视频免费看| 精品一区二区三区四区五区乱码| 午夜视频精品福利| 一边摸一边抽搐一进一小说| 欧美乱色亚洲激情| 精品久久久久久久毛片微露脸| 久久久久久久久免费视频了| 国产蜜桃级精品一区二区三区| 首页视频小说图片口味搜索| av中文乱码字幕在线| 两性夫妻黄色片| 岛国在线观看网站| 欧美性猛交╳xxx乱大交人| 欧美一级a爱片免费观看看 | 波多野结衣巨乳人妻| 他把我摸到了高潮在线观看| 成人亚洲精品av一区二区| 人人妻,人人澡人人爽秒播| 观看免费一级毛片| 丁香欧美五月| 桃色一区二区三区在线观看| 又粗又爽又猛毛片免费看| 午夜福利视频1000在线观看| 女同久久另类99精品国产91| 啪啪无遮挡十八禁网站| 两性午夜刺激爽爽歪歪视频在线观看 | aaaaa片日本免费| 精品一区二区三区视频在线观看免费| 国产精品 国内视频| 香蕉久久夜色| 国产精品自产拍在线观看55亚洲| 亚洲av成人精品一区久久| 国产主播在线观看一区二区| 人妻久久中文字幕网| 2021天堂中文幕一二区在线观| 久9热在线精品视频| 一级黄色大片毛片| 免费看十八禁软件| 又黄又爽又免费观看的视频| 狠狠狠狠99中文字幕| 亚洲av片天天在线观看| 波多野结衣高清作品| 伦理电影免费视频| 男女做爰动态图高潮gif福利片| 夜夜夜夜夜久久久久| 亚洲全国av大片| 午夜福利视频1000在线观看| 黑人巨大精品欧美一区二区mp4| 日日干狠狠操夜夜爽| 欧美乱码精品一区二区三区| 亚洲狠狠婷婷综合久久图片| 成人精品一区二区免费| 天堂√8在线中文| 观看免费一级毛片| 丰满人妻一区二区三区视频av | 1024视频免费在线观看| 国产精品99久久99久久久不卡| 51午夜福利影视在线观看| 色综合婷婷激情| 久久香蕉国产精品| 丁香六月欧美| 长腿黑丝高跟| 久久国产精品人妻蜜桃| 精品国产美女av久久久久小说| 熟女少妇亚洲综合色aaa.| 天天躁狠狠躁夜夜躁狠狠躁| 国产亚洲欧美98| 好男人电影高清在线观看| 久久久国产成人免费| 日韩中文字幕欧美一区二区| 99riav亚洲国产免费| 黄色成人免费大全| 又大又爽又粗| 一区二区三区激情视频| 久久九九热精品免费| 中文亚洲av片在线观看爽| 一个人观看的视频www高清免费观看 | 久久 成人 亚洲| 国产欧美日韩精品亚洲av| 国产精品一区二区免费欧美| 国产精品一及| 九色国产91popny在线| 亚洲美女视频黄频| www.熟女人妻精品国产| 久久天堂一区二区三区四区| xxx96com| 亚洲精品美女久久av网站| 最新美女视频免费是黄的| 他把我摸到了高潮在线观看| 国产片内射在线| 国产高清激情床上av| 色av中文字幕| 日韩精品免费视频一区二区三区| 欧美中文综合在线视频| 色综合亚洲欧美另类图片| 亚洲第一电影网av| 国产精品一及| 国产成人av激情在线播放| 美女高潮喷水抽搐中文字幕| 欧美一级a爱片免费观看看 | 亚洲成av人片在线播放无| 一个人免费在线观看的高清视频| 9191精品国产免费久久| 制服丝袜大香蕉在线| 国产免费男女视频| av视频在线观看入口| 欧美激情久久久久久爽电影| 最近最新中文字幕大全免费视频| 老熟妇乱子伦视频在线观看| a级毛片在线看网站| 国产精品1区2区在线观看.| 亚洲七黄色美女视频| 精品免费久久久久久久清纯| 首页视频小说图片口味搜索| 午夜福利欧美成人| 在线播放国产精品三级| 国产成年人精品一区二区| 91老司机精品| 女生性感内裤真人,穿戴方法视频| 黑人欧美特级aaaaaa片| 波多野结衣高清作品| 一级毛片女人18水好多| 欧美一区二区国产精品久久精品 | 欧美午夜高清在线| 淫妇啪啪啪对白视频| 亚洲av成人av| 国产成人精品久久二区二区免费| 免费看美女性在线毛片视频| 不卡av一区二区三区| 欧美日韩乱码在线| 老司机在亚洲福利影院| 高清毛片免费观看视频网站| 身体一侧抽搐| 中文字幕精品亚洲无线码一区| 大型黄色视频在线免费观看| 亚洲欧美激情综合另类| 精华霜和精华液先用哪个| 亚洲欧美精品综合久久99| 国产真人三级小视频在线观看| 人妻久久中文字幕网| 亚洲精品久久成人aⅴ小说| 蜜桃久久精品国产亚洲av| 国产免费av片在线观看野外av| 日本三级黄在线观看| 免费av毛片视频| 两个人看的免费小视频| 国产三级黄色录像| 亚洲专区字幕在线| 一级片免费观看大全| 日本成人三级电影网站| 久久九九热精品免费| 日韩欧美 国产精品| 操出白浆在线播放| 久久人人精品亚洲av| 中出人妻视频一区二区| 草草在线视频免费看| 制服人妻中文乱码| 国产精品九九99| 色综合婷婷激情| 少妇裸体淫交视频免费看高清 | 听说在线观看完整版免费高清| 成人永久免费在线观看视频| 欧美黑人巨大hd| 全区人妻精品视频| 黄色片一级片一级黄色片| 人人妻人人澡欧美一区二区| 国产69精品久久久久777片 | a级毛片在线看网站| 亚洲中文字幕日韩| av福利片在线| 日韩成人在线观看一区二区三区| 欧美最黄视频在线播放免费| 亚洲欧洲精品一区二区精品久久久| 好男人电影高清在线观看| 国产精品久久视频播放| 欧美日韩精品网址| 久久久久久久精品吃奶| 国产激情久久老熟女| 国产不卡一卡二| 亚洲avbb在线观看| 久久人人精品亚洲av| 国产单亲对白刺激| 美女大奶头视频| 欧美成人免费av一区二区三区| 国产男靠女视频免费网站| 亚洲人与动物交配视频| 午夜视频精品福利| 99精品久久久久人妻精品| 天天一区二区日本电影三级| 精品国产乱码久久久久久男人| 久久精品国产综合久久久| 90打野战视频偷拍视频| 99久久99久久久精品蜜桃| 天天添夜夜摸| 国产精品亚洲美女久久久| 在线观看美女被高潮喷水网站 | 日韩国内少妇激情av| 狠狠狠狠99中文字幕| www日本在线高清视频| a级毛片a级免费在线| 午夜日韩欧美国产| 久久精品影院6| 啦啦啦观看免费观看视频高清| 中文字幕人妻丝袜一区二区| 精品一区二区三区av网在线观看| 日韩精品免费视频一区二区三区| 老司机午夜福利在线观看视频| 五月伊人婷婷丁香| 色av中文字幕| 成人三级黄色视频| 桃色一区二区三区在线观看| 亚洲国产精品sss在线观看| 亚洲欧美精品综合久久99| www日本黄色视频网| 国产成人欧美在线观看| 久久国产乱子伦精品免费另类| 99久久国产精品久久久| 日本免费一区二区三区高清不卡| 欧美乱妇无乱码| 日本黄大片高清| 久久久国产成人免费| 色哟哟哟哟哟哟| 国产亚洲av嫩草精品影院| 国产亚洲av高清不卡| 欧美zozozo另类| 老司机深夜福利视频在线观看| 免费看美女性在线毛片视频| 91九色精品人成在线观看| 亚洲九九香蕉| 亚洲专区字幕在线| 在线观看美女被高潮喷水网站 | 天堂av国产一区二区熟女人妻 | 国产成人aa在线观看| 久久婷婷成人综合色麻豆| 欧美色视频一区免费| 亚洲成人久久性| 午夜精品在线福利| 久久久久久免费高清国产稀缺| 丝袜人妻中文字幕| 激情在线观看视频在线高清| 色播亚洲综合网| 777久久人妻少妇嫩草av网站| 男女视频在线观看网站免费 | 久久久久久久精品吃奶| 亚洲一区中文字幕在线| 欧美性猛交╳xxx乱大交人| 国产亚洲精品一区二区www| 久久中文字幕一级| 特级一级黄色大片| 搡老妇女老女人老熟妇| 欧美绝顶高潮抽搐喷水| 亚洲九九香蕉| 女人爽到高潮嗷嗷叫在线视频| 国产精品精品国产色婷婷| 可以在线观看毛片的网站| 99在线人妻在线中文字幕| 丁香六月欧美| 丝袜美腿诱惑在线| 婷婷亚洲欧美| 精品久久久久久久末码| 动漫黄色视频在线观看| 免费在线观看黄色视频的| 国产三级中文精品| 欧美3d第一页| 久久精品夜夜夜夜夜久久蜜豆 | 日韩中文字幕欧美一区二区| 色综合站精品国产| 中文字幕av在线有码专区| 久久中文字幕人妻熟女| 一级毛片女人18水好多| 亚洲专区中文字幕在线| 一级片免费观看大全| 国产高清videossex| 亚洲激情在线av| 色尼玛亚洲综合影院| 国产一区二区在线观看日韩 | 成人三级做爰电影| 国产三级在线视频| 两性夫妻黄色片| 中文亚洲av片在线观看爽| 高清毛片免费观看视频网站| 国产精品1区2区在线观看.| 毛片女人毛片| 日本黄大片高清| 午夜精品在线福利| 色哟哟哟哟哟哟| 无人区码免费观看不卡| 国产av在哪里看| 免费看日本二区| 亚洲国产精品sss在线观看| 亚洲国产中文字幕在线视频| 欧美午夜高清在线| 国产在线精品亚洲第一网站| 岛国视频午夜一区免费看| 黄色a级毛片大全视频| 亚洲中文av在线| 亚洲一区二区三区不卡视频| 夜夜爽天天搞| 999久久久精品免费观看国产| 久久久久九九精品影院| 每晚都被弄得嗷嗷叫到高潮| 国产亚洲欧美98| 亚洲成人中文字幕在线播放| √禁漫天堂资源中文www| 在线永久观看黄色视频| 久久国产精品人妻蜜桃| 美女高潮喷水抽搐中文字幕| 亚洲午夜理论影院| 日日干狠狠操夜夜爽| 麻豆成人av在线观看| 国产精华一区二区三区| 国内少妇人妻偷人精品xxx网站 | 欧美3d第一页| 国内揄拍国产精品人妻在线| 精品第一国产精品| 久久久久久国产a免费观看| 一本综合久久免费| 国产精品久久久久久人妻精品电影| 精品少妇一区二区三区视频日本电影| 欧美成狂野欧美在线观看| 老熟妇仑乱视频hdxx| e午夜精品久久久久久久| 国产又色又爽无遮挡免费看| 在线播放国产精品三级| 天堂√8在线中文| 香蕉久久夜色| 亚洲五月天丁香| 每晚都被弄得嗷嗷叫到高潮| 国产亚洲欧美98| 亚洲片人在线观看| 久久人妻av系列| 嫩草影院精品99| 国产精品国产高清国产av| 亚洲成av人片免费观看| 12—13女人毛片做爰片一| 国产区一区二久久| 久久精品国产亚洲av香蕉五月| 亚洲精品av麻豆狂野| 欧美性猛交╳xxx乱大交人| 亚洲专区国产一区二区| 久久午夜亚洲精品久久| 欧美又色又爽又黄视频| 美女扒开内裤让男人捅视频| 亚洲男人天堂网一区| 在线观看舔阴道视频| 欧美黑人巨大hd| 12—13女人毛片做爰片一| 成人国语在线视频| 久久婷婷人人爽人人干人人爱| 高潮久久久久久久久久久不卡| 欧美性猛交╳xxx乱大交人| 婷婷精品国产亚洲av|