電鏡在腎移植診斷中的應(yīng)用進(jìn)展

付曉宇，曲利娟（解放軍聯(lián)勤保障部隊(duì)九〇〇醫(yī)院病理科，福建 福州 350025）

近年來(lái)，隨著手術(shù)技術(shù)的標(biāo)準(zhǔn)化、成熟化以及新型免疫抑制劑的應(yīng)用等因素使腎移植的成功率有很大的提高。然而受多種因素的影響，腎功能延遲恢復(fù)及各種排斥反應(yīng)仍然是導(dǎo)致腎移植術(shù)后并發(fā)癥的主要因素，故對(duì)移植相關(guān)性腎損害的早期診斷、早期合理治療則成為移植腎功能順利恢復(fù)的首要因素［1］。電鏡超微結(jié)構(gòu)觀察在移植腎早期排斥反應(yīng)、移植腎復(fù)發(fā)、新發(fā)腎小球疾病的早期診斷有重要作用，兩者都是導(dǎo)致移植物晚期丟失的重要原因，早期發(fā)現(xiàn)和治療有助于延長(zhǎng)移植物存活時(shí)間。本文將從電鏡在移植腎的超微病理診斷中的應(yīng)用價(jià)值進(jìn)行綜述。

1 電鏡在腎移植診斷的優(yōu)勢(shì)

移植腎穿刺活檢被認(rèn)為是移植腎后病理診斷的金標(biāo)準(zhǔn)，隨著穿刺技術(shù)的成熟，逐漸成為移植腎常規(guī)檢查項(xiàng)目［2］。但是國(guó)內(nèi)許多醫(yī)療機(jī)構(gòu)受條件限制，只能開(kāi)展光鏡及免疫熒光或免疫組化，造成部分病例的漏誤診［3］。Haas等［4］通過(guò)回顧性研究發(fā)現(xiàn)，21%的腎臟穿刺標(biāo)本電鏡觀察可以提供有效信息，并對(duì)4%的腎穿活檢標(biāo)本的確診起決定性作用。Wavamunno等［5］研究發(fā)現(xiàn)移植性腎小球?。╣lomerulonephritis，GN）在出現(xiàn)臨床癥狀之前，通過(guò)電鏡已經(jīng)能觀察到組織學(xué)超微結(jié)構(gòu)的改變，并且通過(guò)定期隨訪及病理學(xué)檢查證實(shí)了電鏡對(duì)GN的早期診斷具有光鏡不可替代的作用，光鏡首診平均時(shí)間為2.3年，而電鏡首診平均時(shí)間為39 d，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。在一項(xiàng)評(píng)價(jià)類固醇治療亞臨床排斥反應(yīng)的隨機(jī)試驗(yàn)中，研究組通過(guò)超微組織學(xué)檢查發(fā)現(xiàn)的可疑排斥反應(yīng)病例，經(jīng)過(guò)類固醇的預(yù)防性治療，與對(duì)照組相比，可以明顯延緩亞臨床排斥反應(yīng)的進(jìn)展，改善腎功能狀態(tài)，即對(duì)亞臨床腎損害的病例早期診斷及早期治療有利于改善腎移植的預(yù)后［6］。Buehring等［7］在腎移植后的多瘤病毒感染的研究中也有相似的結(jié)論，腎移植后多瘤病毒感染性腎病是大量應(yīng)用免疫抑制劑治療的一個(gè)并發(fā)癥，通過(guò)超微結(jié)構(gòu)觀察，在免疫和排斥的平衡中尋找到免疫抑制劑的最小用量，降低免疫抑制劑過(guò)量引發(fā)的感染性病變，從而改善移植腎的預(yù)后。

2 電鏡在移植相關(guān)性腎病診斷中的應(yīng)用

2.1 腎移植后腎小球損害的超微結(jié)構(gòu)觀察：腎移植活檢中腎小球疾病并不少見(jiàn)，主要包括復(fù)發(fā)性腎小球病、新發(fā)性腎小球病及移植性腎小球病，這些腎病的出現(xiàn)加速了移植物功能的衰退，繼而失活［8］。研究表明，移植腎功能失活及慢性排斥反應(yīng)是造成腎移植失敗的主要原因，此外，復(fù)發(fā)性腎小球病是導(dǎo)致晚期移植物失功能的另一主要原因［9］。局灶節(jié)段性腎小球硬化癥（focal segmental glomerulosclerosis，F(xiàn)SGS） 最常見(jiàn)的移植相關(guān)性腎病，另外糖尿病腎病、IgA腎病、膜性腎病、膜增殖性腎小球腎炎、狼瘡性腎炎等也較為常見(jiàn)［10］。利用光鏡和免疫病理可以診斷多數(shù)復(fù)發(fā)、新發(fā)性腎小球腎病。但是早期FSGS光鏡沒(méi)有明顯病理改變，臨床表現(xiàn)也無(wú)特異性，常常表現(xiàn)為無(wú)癥狀或大量蛋白尿［11］，僅表現(xiàn)足細(xì)胞足突融合及微絨毛變性等特征性超微病理改變，如果不做電鏡極易漏診。Gallon等［12］研究表明足突融合完全可以通過(guò)血漿置換或利妥昔單抗等治療措施恢復(fù)正常。因此利用電鏡對(duì)FSGS的早期診斷可以達(dá)到早期治療，從而延長(zhǎng)移植物存活的目的。

糖尿病腎病是腎移植后易復(fù)發(fā)的系統(tǒng)性疾病，電鏡表現(xiàn)毛細(xì)血管襻基底膜增厚，可達(dá)570 nm，足細(xì)胞足突融合脫落，系膜基質(zhì)增生并形成K-W結(jié)節(jié)［13］。有文獻(xiàn)報(bào)道IgA腎病復(fù)發(fā)率高達(dá)50%，電鏡下表現(xiàn)系膜區(qū)及系膜旁區(qū)團(tuán)塊狀電子致密物沉積，經(jīng)免疫病理證實(shí)免疫復(fù)合物為IgA［14］。膜性腎?。╩embranousnephropathy，MN）的復(fù)發(fā)率為33% ～ 44%［15］，電鏡下可見(jiàn)基底膜上皮下電子致密物沉積、釘突、鏈條甚至蟲(chóng)蝕樣透亮區(qū)等特征性病理改變［16］。但文獻(xiàn)報(bào)道復(fù)發(fā)性MN電子致密物較原發(fā)性MN明顯減少［17］，可能會(huì)對(duì)光鏡及免疫病理診斷造成一定困難而漏診。膜增殖性腎小球腎炎（membranousproliferative glomerulophritis，MPGN）也好發(fā)于移植性腎小球內(nèi)。Ⅰ型、Ⅲ型MPGN電鏡可見(jiàn)基底膜內(nèi)皮下、上皮下和系膜區(qū)多部位多少不等的電子致密物沉積，致密物密度較高、邊界清楚；Ⅱ型MPGN（亦稱致密物沉積?。┑膹?fù)發(fā)率較Ⅰ型、Ⅲ型高，電鏡下基底膜致密層內(nèi)均質(zhì)連續(xù)的緞帶狀高電子致密物沉積是Ⅱ型MPGN的特征性病理改變。文獻(xiàn)報(bào)道的多數(shù)致密物沉積病都是在光鏡漏誤診后，由電鏡進(jìn)一步修正病理診斷的。另外，結(jié)締組織疾病、淀粉樣腎病、冷球蛋白血癥、免疫觸須樣腎小球病等均可在腎移植后復(fù)發(fā)，復(fù)發(fā)后的腎臟病理改變與自體腎相似。而復(fù)發(fā)性非腎小球腎病包括草酸鹽腎病、胱氨酸病、痛風(fēng)性腎病和Fabry 病等，均有典型的晶體樣或包涵體結(jié)構(gòu)，必須通過(guò)電鏡證實(shí)有否典型的包涵體而確診［13］。

GN是抗體介導(dǎo)的排斥反應(yīng)（antibody-mediated rejection，AMR）最典型的病變，是導(dǎo)致蛋白尿［18］、肌酐升高、高血壓和移植物存活縮短的重要原因。目前認(rèn)為GN的發(fā)病機(jī)制可能是因?yàn)檠貉h(huán)中的抗移植物抗體造成內(nèi)皮細(xì)胞損傷、活化引發(fā)內(nèi)皮細(xì)胞的再生，產(chǎn)生新的基底膜物質(zhì)，繼而形成基底膜假雙軌現(xiàn)象［19-20］。有學(xué)者認(rèn)為GN是AMR引起的一種形態(tài)學(xué)損害，而不是一種特殊診斷［21］。

GN的診斷標(biāo)準(zhǔn)是腎小球基底膜雙軌的形成，為了量化診斷標(biāo)準(zhǔn)，Banff 1997會(huì)議統(tǒng)一了GN的診斷標(biāo)準(zhǔn)，即形成雙軌的腎小球血管襻的數(shù)量要大于10%［22］。Banff 2015會(huì)議再次修正了診斷標(biāo)準(zhǔn)，進(jìn)一步量化受累腎小球血管襻雙軌的數(shù)量，并對(duì)GN進(jìn)行分級(jí)（表1）［23］。GN還可出現(xiàn)以下伴隨表現(xiàn)：系膜基質(zhì)增生、系膜溶解、局灶節(jié)段腎小球硬化、纖維蛋白沉積及微血管炎癥等，這些病理表現(xiàn)僅有提示作用，不作為主要診斷標(biāo)準(zhǔn)［21］。GN的超微病理特征是足細(xì)胞足突消失、內(nèi)皮細(xì)胞腫脹、胞漿空泡化、內(nèi)皮孔丟失、腎小球內(nèi)皮細(xì)胞鋸齒狀突起、內(nèi)皮下間隙增寬、細(xì)胞碎片及纖維蛋白沉積［24］，通常不存在電子致密物沉積。Wavamunno等［25］通過(guò)對(duì)比分析發(fā)現(xiàn)：內(nèi)皮細(xì)胞腫脹、空泡化以及內(nèi)皮間隙增寬等病理學(xué)表現(xiàn)多在移植后1 ～ 3個(gè)月內(nèi)出現(xiàn)。隨著疾病進(jìn)展，腎移植后1年內(nèi)可出現(xiàn)腎小球基底膜雙軌化，而3年后內(nèi)皮孔會(huì)明顯減少。這些超微特征也可以在病理診斷中給臨床一個(gè)疾病進(jìn)展階段的提示，從而對(duì)臨床治療起到重要的輔助提示作用。

2.2 腎移植后腎小管間質(zhì)損害的超微結(jié)構(gòu)觀察：1991年加拿大Banff會(huì)議，首先提出了慢性移植物腎病的概念，主要含義是間質(zhì)纖維化和腎小管萎縮［26］。2001年Banff會(huì)議根據(jù)供體特異性抗體和C4d抗體作為急性AMR的特征提出了急性AMR的定義［27］。2005年Banff會(huì)議，針對(duì)腎小管萎縮及間質(zhì)纖維化區(qū)域出現(xiàn)的作用機(jī)制不明的炎癥細(xì)胞，到底是介導(dǎo)排斥反應(yīng)的細(xì)胞抑或是萎縮腎小管的“收尸”細(xì)胞，無(wú)法達(dá)成一致意見(jiàn)，強(qiáng)調(diào)在無(wú)法確定這種組織學(xué)改變病因的情況下引入非特定來(lái)源的間質(zhì)纖維化和腎小管萎縮（interstitial fibrosis and tubular atrophy，IF/TA）的概念［28］。Banff分類的更新反映了臨床病理專家對(duì)腎移植術(shù)后疾病本質(zhì)的認(rèn)知的進(jìn)步。

急性腎損傷主要由缺血和毒性損傷引起，主要累及腎小管而非腎小球。目前急性腎小管損傷（acute tubular injury，ATI）缺乏行之有效的組織損傷標(biāo)記物，并且光鏡下腎小管上皮細(xì)胞損傷的嚴(yán)重程度往往與形態(tài)學(xué)表現(xiàn)并不完全對(duì)應(yīng)，因此電鏡對(duì)腎小管損傷的診斷尤為重要［29］。缺血對(duì)腎小管的損傷造成的病理改變比較輕微，表現(xiàn)為刷狀緣變薄或缺失，胞漿透明、顆粒狀，以及遠(yuǎn)端小管管型等［30］。毒性引起的病理變化更明顯、更嚴(yán)重，表現(xiàn)為近端小管細(xì)胞腫脹變淺，胞漿空泡化［31］，腎小管包涵體，腎小管周圍毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞腫脹等［24］。主要機(jī)制可能與自噬［32］、凋亡［33］、壞死［34］等相關(guān)。電鏡可將ATI分為早期和晚期。早期表現(xiàn)細(xì)胞刷狀緣缺失，并出現(xiàn)特征性的尖膜囊。尖膜囊系腎小管上皮細(xì)胞頂端刷狀緣隆起所致，胞質(zhì)腫脹，有不規(guī)則嵴的梭狀線粒體，腎小管上皮細(xì)胞成分與腎小管基底膜分離。晚期出現(xiàn)上皮細(xì)胞再生，再生的上皮細(xì)胞呈扁平狀、細(xì)胞核深染，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)擴(kuò)張并占據(jù)細(xì)胞胞質(zhì)的空間［30］。區(qū)分早期和晚期腎小管細(xì)胞損傷可以為臨床醫(yī)生提供一個(gè)關(guān)于腎小管損傷的疾病進(jìn)展的概念。評(píng)估腎小管損傷的受累程度是彌漫性還是局灶性，可為急性腎損傷的病因及預(yù)后提供重要線索。

表1 Banff 2015移植腎小球病分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)

GN患者的腎小管周圍毛細(xì)血管床也可發(fā)生內(nèi)皮細(xì)胞活化和基底膜損傷。發(fā)病機(jī)制同樣與AMR相關(guān)，表現(xiàn)亦與腎小球毛細(xì)血管基底膜病變相似。Banff會(huì)議認(rèn)為即使在沒(méi)有腎小球的情況下，腎小管周圍毛細(xì)血管基底膜多層化也可以作為慢性排斥反應(yīng)組織損傷的診斷標(biāo)準(zhǔn)。Monga等［35］研究發(fā)現(xiàn)，由于腎小管周圍毛細(xì)血管的變化往往與GN共存，依據(jù)毛細(xì)血管基底膜的多層化可以推斷GN的存在或潛在可能性［36］。但許多學(xué)者認(rèn)為，管周毛細(xì)血管基底膜多層化并不完全是AMR的特異性改變。有報(bào)道感染后腎小球腎炎、狼瘡性腎炎、環(huán)孢菌素腎毒性和梗阻性尿路病同樣會(huì)出現(xiàn)這個(gè)現(xiàn)象［37］。Banff 2015標(biāo)準(zhǔn)指出［23］：當(dāng)一條管周毛細(xì)血管基底膜達(dá)到7層以上或者2條毛細(xì)血管達(dá)到5層以上，可以診斷慢性體液排斥反應(yīng)。De Kort等［38］通過(guò)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析發(fā)現(xiàn)，至少要觀察10個(gè)管周毛細(xì)血管，如每個(gè)管周毛細(xì)血管基底膜平均達(dá)到2.5層，可以顯著預(yù)測(cè)移植腎病變的預(yù)后。目前這一標(biāo)準(zhǔn)并未寫(xiě)進(jìn)Banff診斷標(biāo)準(zhǔn)，也許可以期待Banff 2019診斷標(biāo)準(zhǔn)的發(fā)布。

3 移植腎電鏡檢查的適應(yīng)證［24］

如果條件允許，建議所有移植腎病例都做電鏡檢查?；蛘叱霈F(xiàn)以下任何一種情況，建議電鏡檢查：① 如果腎小球疾病是引起腎衰竭的病因時(shí)；② 如果存在可疑有腎小球疾病的臨床表現(xiàn)（蛋白尿/血尿）時(shí)；③ 如果有發(fā)生AMR的風(fēng)險(xiǎn)（高風(fēng)險(xiǎn)移植、新出現(xiàn)的供者特異性抗體升高、原有的T細(xì)胞或抗體介導(dǎo)的排斥反應(yīng)）；④ 如果最近1次的腎活檢時(shí)間超過(guò)1年時(shí)。

出現(xiàn)以下情況必須做電鏡檢查：① 如果腎小球疾病是引起腎衰竭的病因時(shí)；② 如果存在可疑有腎小球疾病的臨床或病理表現(xiàn)（特別是光鏡下腎小球呈膜增殖性生長(zhǎng)模式）；③ 如果患者存在發(fā)生急性AMR的高風(fēng)險(xiǎn)因素，需要尋找僅存在于超微病理的結(jié)構(gòu)特征來(lái)確診慢行活動(dòng)性AMR的存在；④ 如果最近1次的腎活檢時(shí)間超過(guò)1年時(shí)。

4 腎移植的基因組學(xué)時(shí)代

目前的腎臟病理診斷是通過(guò)光鏡、電鏡及免疫病理建立的三維診斷模式。日常工作中發(fā)現(xiàn)，不同病因可以引起相同的損傷病理表現(xiàn)，而同一病因也可以引起不同的病理表現(xiàn)［39］?；蚪M學(xué)的出現(xiàn)可以幫助我們追本溯源，找到疾病的本質(zhì)。2013年Banff診斷及分類標(biāo)準(zhǔn)中首次提出AMR的分子診斷［40］。之后，2017年Banff會(huì)議發(fā)布分子檢測(cè)指南，除了AMR，與細(xì)胞介導(dǎo)排斥反應(yīng)密切相關(guān)的免疫損傷相關(guān)基因的檢測(cè)也被納入指南里［41］。

Venner等［42］通過(guò)多中心聯(lián)合收集了腎移植后各個(gè)時(shí)間段的腎穿標(biāo)本，并進(jìn)行纖維化的相關(guān)分子檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)腎移植術(shù)后第一周就存在肉眼無(wú)法觀測(cè)到的纖維化，光鏡在幾個(gè)月后才會(huì)觀察到這種纖維化。而早期腎移植標(biāo)本中的纖維化并不會(huì)引起AMR或GN甚至導(dǎo)致移植物丟失，可能只是腎移植過(guò)程中對(duì)損傷因素的反應(yīng)。研究還發(fā)現(xiàn)出現(xiàn)纖維化之前就存在轉(zhuǎn)錄位點(diǎn)AKI（acute kidney injury，AKI）和 FICOL（Fibrillar collagen）的表達(dá)。AKI是急性腎損傷的信號(hào)，它包括損傷修復(fù)相關(guān)轉(zhuǎn)錄物（IRRATS），代表了腎臟對(duì)損傷的反應(yīng)［43］。在腎移植術(shù)后早期，AKI與功能抑制、恢復(fù)和間質(zhì)炎癥有關(guān)［44］。腎移植后早期，幾乎所有AKI高表達(dá)的移植腎均長(zhǎng)期存活［45］。如移植腎間質(zhì)出現(xiàn)纖維化，可檢測(cè)到IGT（immunoglobulin transcripts）和MCATs（mast cell transcripts ）等轉(zhuǎn)錄位點(diǎn)。此外，還發(fā)現(xiàn)TxBx對(duì)移植早期萎縮纖維化有重要意義［46］。

除了介導(dǎo)排斥反應(yīng)的炎癥細(xì)胞，其他炎癥細(xì)胞并不是導(dǎo)致移植腎損傷的主流因子。相反，這些細(xì)胞有利于損傷修復(fù)和監(jiān)測(cè)近期移植腎腎單位損傷的活躍度［47］。主要的上游調(diào)控因子有：IL1B、OSM、INF、IFNG以及TGFB1［48］。當(dāng)損傷發(fā)生時(shí)，巨噬細(xì)胞的IL1B、TNF和OSM會(huì)促進(jìn)炎癥對(duì)損傷的修復(fù)［46］，引發(fā)損傷修復(fù)及萎縮纖維化的多種細(xì)胞表達(dá)OSM［49］，損傷的上皮細(xì)胞則會(huì)表達(dá)TGFB1 ITGB6［50］,推測(cè)炎癥細(xì)胞是通過(guò)MIR21信號(hào)通路參與修復(fù)的過(guò)程［51］。通過(guò)一系列分子表型檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)并證實(shí)了移植腎損傷反應(yīng)的時(shí)間序列，即急性腎損傷轉(zhuǎn)錄物的立即表達(dá)、數(shù)周后的纖維膠原轉(zhuǎn)錄物及數(shù)月后出現(xiàn)免疫球蛋白和肥大細(xì)胞轉(zhuǎn)錄物，據(jù)此可以推測(cè)移植腎損傷的進(jìn)程及程度。Venner等［42］發(fā)現(xiàn)晚期腎活檢組織中的纖維化與損傷及炎癥反應(yīng)相關(guān)，腎單位損傷引起纖維化并最終進(jìn)展為腎衰竭。

其他還有VCAN高表達(dá)于腎小管上皮細(xì)胞，NNMT高表達(dá)與內(nèi)皮細(xì)胞和上皮細(xì)胞，還發(fā)現(xiàn)與肺纖維化相關(guān)的CXCL6趨化因子也會(huì)在移植腎中高表達(dá)，其高表達(dá)與移植物失活相關(guān)［52］。與腎單位損傷相關(guān)的還有WNT/β-catenin信號(hào)通路，其主要的上游調(diào)控轉(zhuǎn)錄因子是RXRA、SREB1、HNF1A和 HNF4A 等［42］。

但是Banff 2017診斷標(biāo)準(zhǔn)沒(méi)有具體推薦分子表型及檢測(cè)平臺(tái)，可能原因是AMR/TCMR沒(méi)有特異性的損傷，腎移植后的并發(fā)癥仍難以簡(jiǎn)單歸結(jié)為單一的、特異性的基因轉(zhuǎn)錄表達(dá)。分子檢測(cè)應(yīng)用到病理診斷可能還需要時(shí)間。

5 小 結(jié)

電鏡超微結(jié)構(gòu)病理改變和特殊結(jié)構(gòu)的觀察，可以彌補(bǔ)光鏡、免疫病理的不足，為移植相關(guān)性腎病的病因診斷、組織學(xué)診斷提供更為準(zhǔn)確的依據(jù)。尤其慢性AMR是晚期移植物失活的重要原因，電鏡檢查作為早期診斷的一種潛在工具，可以有效延長(zhǎng)移植物存活。綜上所述，電鏡可以為移植腎病理診斷提供更為有意義的參考佐證，提高疾病的診斷準(zhǔn)確性，對(duì)于臨床提高疾病診斷的精確性和加強(qiáng)對(duì)疾病發(fā)病機(jī)制的認(rèn)識(shí)具有重要意義。