5 種土霉素注射液在山羊體內(nèi)的藥動學(xué)比較

張 超,畢海林,肖裕章,袁啟峰,胡 軍,唐建華,

(1.重慶方通動物藥業(yè)有限公司,重慶 榮昌402460;2.西南大學(xué)動物科學(xué)學(xué)院,重慶 榮昌 402460)

土霉素屬于四環(huán)素類廣譜抗生素,對革蘭陽性和陰性細(xì)菌、立克次體、衣原體等都有抑制作用,由于具有良好的治療效果,被廣泛用于畜禽疾病的預(yù)防與治療。在目前非洲市場土霉素注射液的需求量較大,價(jià)格合理且質(zhì)量可靠的供應(yīng)廠家并不多。雖國內(nèi)報(bào)道了不同原料、濃度、溶媒的土霉素注射液的藥代動力學(xué)特點(diǎn)[1-3],但在不同動物中的藥動學(xué)參數(shù)必會有所差異。為此,本試驗(yàn)以山羊?yàn)榘袆游?就不同廠家的土霉素注射液產(chǎn)品進(jìn)行比較藥代動力學(xué)試驗(yàn),研究其在山羊體內(nèi)藥代動力學(xué)特征,從而為土霉素注射液在臨床上合理使用提供依據(jù)和指導(dǎo)。

1 材料與方法

1.1 試劑與藥品 土霉素標(biāo)準(zhǔn)品(含量：89.5%,K0031208),購自中國食品藥品檢定研究院;A、D土霉素注射液,為國外某公司產(chǎn)品;B、E 土霉素注射液,為山東某公司產(chǎn)品;C 土霉素注射液,為重慶方通動物藥業(yè)有限公司產(chǎn)品。草酸、高氯酸為分析純試劑。甲醇、乙腈為色譜純,水為屈臣氏純凈水。

1.2 儀器 高效液相色譜儀：Agilent1260,DAD 檢測器,配備四元泵、脫氣泵、色譜工作站、自動進(jìn)樣器和柱溫箱(Agilent 公司,美國)。色譜柱：Uranus C18(250 mm×4.6 mm,5 μm)。電子分析天平(賽多利斯科學(xué)儀器有限公司);渦旋混合器(上海青浦滬西儀器廠);高速離心機(jī)(上海菲恰爾分析儀器有限公司);可調(diào)微量移液器10～100、1 000 μL(Eppendorf 公司)。

1.3 試驗(yàn)動物 重慶大足黑山羊,30 只,6～8 月齡左右,體重范圍20～25 kg,自由采食、飲水,飼喂不含任何抗生素的日糧。

1.4 給藥與采樣 動物按隨機(jī)分組。試驗(yàn)前測定制劑的含量,按照2010 版《獸藥使用指南》制定劑量20 mg/kg·bw,分別頸部肌肉注射土霉素注射液。給藥前采取空白血漿,給藥后0.083、0.25、0.5、1、2、4、10、24、36、48、72、96 h,每次采血約3 mL,置于肝素鈉抗凝管中,3 000 r/min 離心10 min,用移液器小心吸取血漿于1.5 mL EP 管中,每個(gè)樣品保存2 份,置-20 ℃保存待測。

1.5 樣品處理 取0.6 mL 血漿,加入200 μL 的沉淀劑(10% 高氯酸),漩渦30 s 混勻,靜置后14 000 r/min 離心15 min,吸取上清液,經(jīng)0.22 μm針式濾膜過濾,取濾液20 μL 進(jìn)高效液相色譜分析。

1.6 色譜條件 流動相：0.01 mol/L 草酸溶液-甲醇-乙腈=75∶10∶15(V/V/V),色譜柱：C18 柱,進(jìn)樣量：20 μL,流速：1.0 mL/min,柱溫：35 ℃,紫外檢測波長：355 nm。

1.7 回收率和變異系數(shù) 將已知濃度的標(biāo)準(zhǔn)液加入山羊空白血漿中,配得低(0.5 μg/mL)、中(2 μg/mL)和高(5 μg/mL)3 個(gè)樣品濃度,按1.5 樣品處理方法處理樣品,進(jìn)行HPLC 測定;同時(shí)分別取濃度為0.5 μg/mL、2 μg/mL、5 μg/mL 土霉素標(biāo)準(zhǔn)系列溶液進(jìn)行HPLC 測定,不同濃度樣品分別重復(fù)5次,以峰面積比計(jì)算,求其回收率。每批(日內(nèi))作5 次重復(fù),共作5 個(gè)批次(日間)。計(jì)算每批內(nèi)和每批間的色譜峰面積平均值及標(biāo)準(zhǔn)誤,求得各變異系數(shù)。

1.8 標(biāo)準(zhǔn)曲線和線性范圍 在1.5 mL 的離心管中各加入0.6 mL 空白血漿,再依次加入土霉素系列濃度(1～50 μg/mL),旋渦混勻,使得各樣品中血漿的藥物濃度為0.2～10 μg/mL(按1.5 樣品處理方法處理樣品,進(jìn)行HPLC 測定。以土霉素色譜峰面積為橫坐標(biāo)(A),藥物濃度(B)為縱坐標(biāo),繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線,求得標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程和相關(guān)系數(shù)。

1.9 樣品測定與數(shù)據(jù)處理 給藥后不同時(shí)間點(diǎn)采集血漿樣品經(jīng)處理后,進(jìn)行HPLC 測定,藥時(shí)曲線圖采用GraphPad Prism 5 繪制;藥物動力學(xué)模型擬合采用3P97 藥代動力學(xué)軟件處理,采用Marquardt 法以權(quán)重1,1/C,1/C23 種進(jìn)行曲線擬合,根據(jù)WSS和AIC 值判斷最佳藥代動力學(xué)模型。采用SPSS 20對血藥濃度和藥動學(xué)參數(shù)進(jìn)行方差分析。其他相關(guān)參數(shù)和方程計(jì)算根據(jù)《生物藥劑學(xué)和藥物動力學(xué)》所列公式計(jì)算。

2 結(jié)果

2.1 色譜條件適用性 在本試驗(yàn)色譜條件下,土霉素與其他組分分離良好,色譜峰峰形較佳,測得土霉素保留時(shí)間為7.2 min(見圖1)。

2.2 回收率和變異系數(shù) 按上述樣品處理方法,在0.2、1、5 μg/mL 濃度下,平均回收率在(74.6±2.3)%～(81.5±3.1)% 之間,批內(nèi)和批間系數(shù)均不超過10.0%。由此可知,此血漿處理方法用液相檢測方法可靠,重復(fù)性好。

2.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線和線性范圍 血漿中土霉素線性回歸方程為Y=26.52X-1.477(R=0.999 9),線性范圍為0.1～10 μg/mL,按信噪比S/N=3 為檢測限(LOD),S/N=10 為定量限(LOQ),求得本方法測定血漿中土霉素檢測限為0.03 μg/mL,定量限為0.1 μg/mL。

2.4 血藥濃度和主要藥動學(xué)參數(shù) 土霉素注射液在山羊體內(nèi)符合一級吸收二室模型,土霉素注射液藥動學(xué)的血藥濃度時(shí)間曲線和主要藥動學(xué)參數(shù)見封三圖2 和表1。

圖1 土霉素專屬性高效液相色譜圖

圖2 山羊單劑量肌肉注射不同品種土霉素注射液后藥時(shí)曲線

表1 山羊單劑量注射土霉素注射液后主要藥動學(xué)參數(shù)比較

3 討論

試驗(yàn)前查看文獻(xiàn)報(bào)道[4-5]土霉素注射液的流動相,并根據(jù)條件比較選擇不同流動相,最終選定草酸溶液-乙腈-甲醇作為流動相。由于土霉素微溶于水,而流動相中必須含有有機(jī)溶劑,為了獲得較好的柱效和保留時(shí)間,需選擇酸性溶劑這樣可以減少土霉素中化學(xué)基團(tuán)在離子鍵、化學(xué)鍵等作用導(dǎo)致的峰拖尾,并且在酸性環(huán)境中能有效抑制色譜柱中十八烷基硅烷鍵合硅膠中的硅羥基離子化,減少離子間相互作用,有助于土霉素分離、形成良好峰型。最終確定流動相為：0.01 mol/L 草酸溶液-甲醇-乙腈=75∶10∶15。

土霉素注射液的處方和工藝,國內(nèi)外有多種版本,有用單一溶劑作溶媒的,也有用復(fù)合溶劑做溶媒的,產(chǎn)品在穩(wěn)定性和療效上也存在一些差異,本試驗(yàn)通過市場上不同濃度的土霉素注射液來比較其差異。結(jié)果顯示,高濃度(20%)土霉素注射液具有半衰期長,峰濃度高,藥時(shí)曲線下面積大等特點(diǎn),與低濃度(10%)土霉素注射液之間差異顯著;在相同劑量下,不同廠家的土霉素注射液在山羊體內(nèi)的藥動學(xué)特征可能與藥物中的輔料和用量不同有關(guān)。由于不同廠家在考慮配方的穩(wěn)定性、抗氧化性等方面,使用不同的有機(jī)溶媒(聚乙烯吡咯烷酮、α-吡咯烷酮、丙二醇等),導(dǎo)致對土霉素注射液的藥動學(xué)參數(shù)也會有所影響,徐士新等[8]也證實(shí)有機(jī)溶媒對藥動學(xué)參數(shù)的影響。在相同濃度規(guī)格(10% 或20%)土霉素注射液下,從達(dá)峰時(shí)間、達(dá)峰濃度、藥時(shí)曲線下面積可以看出在山羊體內(nèi)的過程具有相似的藥動學(xué)特征;表明在相同藥物濃度下,相同濃度規(guī)格制劑在配方設(shè)計(jì)中為保證藥物的穩(wěn)定性,使用的有機(jī)溶媒用量幾乎一致,從而使兩者具有相似的藥動學(xué)特征。

如今,安全用藥是人們關(guān)注的焦點(diǎn),要達(dá)到用藥安全必須對藥物進(jìn)行動力學(xué)試驗(yàn),在《獸藥管理?xiàng)l例》中對獸藥申報(bào)尤其是新獸藥和獸藥新劑型的申報(bào)提出了提交的藥代動力學(xué)參數(shù)要求,所以我們有必要對不同品種的藥物進(jìn)行動力學(xué)研究[6]。此研究不同品種土霉素注射液在山羊體內(nèi)均符合一級吸收二室模型,與廖雪玲等[7]報(bào)道一致。因此在使用不同品種的藥物時(shí)要充分了解藥物的在體內(nèi)的性質(zhì)特征,從而能充分發(fā)揮藥物本身的作用,發(fā)揮藥效。