卵形巴貝斯蟲(chóng)AMA1 基因的克隆與原核表達(dá)

田萬(wàn)年,劉 杰,張馨月,薛書(shū)江,賈立軍,張守發(fā)

(1.吉林農(nóng)業(yè)科技學(xué)院動(dòng)物科技學(xué)院,吉林 吉林132101;2.延邊大學(xué)農(nóng)學(xué)院,吉林 延吉 133002)

牛的卵形巴貝斯蟲(chóng)病(Babesiosis)是由巴貝斯科巴貝斯屬的卵形巴貝斯蟲(chóng)(Babesia ovata)寄生于牛紅細(xì)胞內(nèi)所引起的寄生蟲(chóng)病。在我國(guó),牛卵形巴貝斯蟲(chóng)病主要傳播媒介為長(zhǎng)角血蜱,主要分布于我國(guó)的河南、四川、甘肅和吉林等省份。該病危害嚴(yán)重,病牛臨床癥狀為高熱、貧血、黃疸和血紅蛋白尿,多引起死亡。卵形巴貝斯蟲(chóng)AMA1 基因在侵染宿主細(xì)胞中具有介導(dǎo)粘附和入侵宿主細(xì)胞的作用,具有較好的反應(yīng)原性和免疫原性[1]。目前國(guó)內(nèi)尚未見(jiàn)有關(guān)牛卵形巴貝斯蟲(chóng)病的重組蛋白與免疫方面研究。鑒于以上情況,本試驗(yàn)對(duì)卵形巴貝斯蟲(chóng)AMA1 基因進(jìn)行克隆和表達(dá),并進(jìn)行反應(yīng)原性分析,為進(jìn)一步建立該病的免疫診斷方法及基因工程疫苗奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 血液樣本來(lái)源 采自吉林省琿春市散養(yǎng)延邊黃牛,經(jīng)血涂片鏡檢陽(yáng)性的抗凝血,-20 ℃冰箱保存。卵形巴貝斯蟲(chóng)標(biāo)準(zhǔn)陽(yáng)性血清、酶標(biāo)羊抗牛IgG由日本帶廣畜產(chǎn)大學(xué)玄學(xué)南教授惠贈(zèng)。

1.2 主要試劑 pMD18-T 載體、pGEX-4T-1 載體、T4 DNA 連接酶,均購(gòu)自Promega 公司;E.coliJM109、E.coliBL21、XhoⅠ、EcoRⅠ、TaqDNA 聚合酶、dNTP、Agarose Gel DNA Extraction Kit、DNA Marker、蛋白質(zhì)Marker 等,均購(gòu)自寶生物工程(大連)有限公司。DMEM 為美國(guó)Life Technolongies 公司產(chǎn)品。

1.3 引物設(shè)計(jì)與合成 根據(jù)GenBank 上登錄的卵形巴貝斯蟲(chóng)AMA1 基因序列(KT312793),利用Primer Premier 5.0 軟件設(shè)計(jì)了1 對(duì)特異性引物。上下游引物5′端分別加入EcoRⅠ和XhoⅠ限制性內(nèi)切酶(下劃線部分)。上游引物為5′-ACGAATTCGATACGGCTGTCGGTAGCAA-3′,下游引物為5′-CCGCTCGAGGAGCTGTCACCATTGTCCTTAA-3′。擴(kuò)增目的片段大小為1 042 bp,引物由上海英駿生物技術(shù)有限公司合成。

1.4 AMA1 目的基因的克隆 按照全血基因組DNA 提取試劑盒方法提取基因組DNA。以基因組DNA 為模板進(jìn)行PCR 擴(kuò)增,PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)純化、回收后與克隆載體pMD18-T 連接,轉(zhuǎn)化到E.coliJM109。采用試劑盒方法提取質(zhì)粒DNA,經(jīng)PCR 鑒定為陽(yáng)性的菌液送往上海英駿生物技術(shù)有限公司進(jìn)行測(cè)序。

1.5 生物信息學(xué)分析 應(yīng)用互聯(lián)網(wǎng)在線軟件TMHMM2.0 及DNAMAN 軟件對(duì)克隆的卵形巴貝斯蟲(chóng)AMA1 基因核苷酸、蛋白結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析。

1.6 重組表達(dá)載體的構(gòu)建 分別提取陽(yáng)性克隆和表達(dá)載體pGEX-4T-1 質(zhì)粒DNA,分別用EcoRⅠ和XhoⅠ進(jìn)行雙酶切,酶切后產(chǎn)物進(jìn)行連接,產(chǎn)物轉(zhuǎn)化到E.coliBL21 感受態(tài)細(xì)胞內(nèi),提取質(zhì)粒DNA,進(jìn)行PCR 和酶切鑒定。將鑒定為陽(yáng)性的菌液送往上海英駿生物技術(shù)有限公司測(cè)序。

1.7 重組蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)及SDS-PAGE 取經(jīng)鑒定為陽(yáng)性的重組菌100 μL 接種到10 mL Amp/LB培養(yǎng)基內(nèi),待細(xì)菌培養(yǎng)到OD值達(dá)到0.6 時(shí),加入終濃度為1 mmol/L 的IPTG 進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)。將經(jīng)誘導(dǎo)表達(dá)的菌液進(jìn)行離心,棄上清,用PBS(pH 值7.4)洗滌沉淀2 次,加入5×上樣緩沖液、2 mol/L DTT,煮沸5 min,置于-20 ℃?zhèn)溆?。按常?guī)方法制備12%分離膠和5%濃縮膠,將處理好的樣品取15 μL上樣。電泳產(chǎn)物置于考馬斯亮蘭R250 中染色、脫色,在凝膠成像儀下觀察。

1.8 表達(dá)產(chǎn)物的Western Blot 分析 將SDSPAGE 電泳凝膠轉(zhuǎn)印到NC 膜上,進(jìn)行免疫印跡。一抗選用牛卵形巴貝斯蟲(chóng)陽(yáng)性血清,二抗為辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的羊抗牛IgG,在凝膠成像儀下觀察結(jié)果。

2 結(jié)果

2.1 卵形巴貝斯蟲(chóng)AMA1 基因的克隆與鑒定 以基因組DNA 為模板,經(jīng)PCR 擴(kuò)增后獲得大小約為1 042 bp目的片段,與預(yù)期結(jié)果相一致(見(jiàn)圖1)。將目的基因克隆到pMD18-T 載體上,將陽(yáng)性菌液進(jìn)行測(cè)序,結(jié)果顯示,與GenBank 收錄的牛卵形巴貝斯蟲(chóng)AMA1 基因(KT312793)同源性為99.8%。

圖1 卵形巴貝斯蟲(chóng)PCR 擴(kuò)增

2.2 生物信息學(xué)分析 克隆的卵形巴貝斯蟲(chóng)AMA1 基因經(jīng)DNAMAN 軟件分析,ORF 大小為1 042 bp,編碼347 個(gè)氨基酸,分子量大小為42 ku。應(yīng)用TMHMM Server 2.0 軟件在線預(yù)測(cè)顯示,該蛋白在膜外的可能性接近于1(見(jiàn)中插彩版圖2),推測(cè)該蛋白為膜外蛋白,可在大腸桿菌中表達(dá)。

2.3 重組表達(dá)質(zhì)粒的鑒定 篩選為陽(yáng)性的重組pGEX-4T-BoAMA1 質(zhì)粒為模板進(jìn)行PCR 鑒定和酶切鑒定。經(jīng)PCR 擴(kuò)增后,獲得一條約為1 042 bp 的目的片段,與預(yù)期的大小相符(見(jiàn)圖3);用EcoRⅠ和XhoⅠ對(duì)重組質(zhì)粒進(jìn)行酶切后,獲得約為2 600 bp和1 042 bp 的2 條目的片段(見(jiàn)圖4),目的基因片段成功插入到原核表達(dá)載體中。

圖3 重組質(zhì)粒pGEX-4T-BoAMA1 的PCR 鑒定

圖4 重組質(zhì)粒pGEX-4T-BoAMA1 的酶切鑒定

2.4 表達(dá)產(chǎn)物的SDS-PAGE 分析 表達(dá)產(chǎn)物經(jīng)IPTG 體外誘導(dǎo)后,進(jìn)行SDS-PAGE 分析,在68 ku 位置處出現(xiàn)表達(dá)蛋白帶,以pGEX-4T-1 表達(dá)的GST 單體蛋白約26 ku,BoAMA1 蛋白約42 ku,二者融合蛋白大小與預(yù)期結(jié)果相一致(見(jiàn)圖5)。而未誘導(dǎo)的對(duì)照組未出現(xiàn)表達(dá)蛋白條帶。表達(dá)蛋白主要在沉淀中存在,以包涵體形式。

圖5 BoAMA1 蛋白的SDS-PAGE

2.5 表達(dá)產(chǎn)物Western Blot 分析 表達(dá)蛋白轉(zhuǎn)至NC 膜上后,與牛卵形巴貝斯蟲(chóng)陽(yáng)性血清反應(yīng),在68 ku 處出現(xiàn)一條特異性目的條帶(見(jiàn)圖6)。表明誘導(dǎo)的蛋白可被牛卵形巴貝斯蟲(chóng)陽(yáng)性血清識(shí)別,具有良好的反應(yīng)原性。

圖6 BoAMA1 蛋白的Western Blot 分析

3 討論

我國(guó)在20 世紀(jì)80 年代前,牛的巴貝斯蟲(chóng)種類包括牛巴貝斯蟲(chóng)(B.bovis)和雙芽巴貝斯蟲(chóng)(B.bigemina)[2]。白啟等從河南牛體內(nèi)分離到1 株大型巴貝斯蟲(chóng),后經(jīng)證實(shí)為卵形巴貝斯蟲(chóng)(B.ovata)[3]。目前牛卵形巴貝斯蟲(chóng)病的診斷主要通過(guò)臨床癥狀和血液涂片鏡檢方法,由于染色劑及相似病原體等人為因素影響鏡檢結(jié)果的判定,易出現(xiàn)誤差[4]。疫苗是防治卵形巴貝斯蟲(chóng)病最為有效的方法,目前國(guó)內(nèi)尚未研制出牛卵形巴貝斯蟲(chóng)病的疫苗。

AMA1 最早發(fā)現(xiàn)于諾氏瘧原蟲(chóng)中,AMA1 蛋白在瘧原蟲(chóng)侵染宿主細(xì)胞中是不可或缺的抗原蛋白,AMA1 是蟲(chóng)體入侵紅細(xì)胞之前以膜結(jié)合形式分泌到蟲(chóng)體表面蛋白[5]。范麗哲研究表明東方巴貝斯蟲(chóng)AMA1 蛋白具有良好的免疫反應(yīng)原性[6]。國(guó)內(nèi)尚未見(jiàn)對(duì)卵形巴貝斯蟲(chóng)AMA1 基因的研究報(bào)道。本試驗(yàn)成功克隆了卵形巴貝斯蟲(chóng)AMA1 基因,其片段大小為1 042 bp,其ORF 大小為1 042 bp,編碼347 個(gè)氨基酸,分子量大小為42 ku。測(cè)序分析表明,該基因與GenBank 中登錄的卵形巴貝斯蟲(chóng)的核苷酸同源性為99.8%。生物信息學(xué)分析預(yù)測(cè)顯示,BoAMA1 蛋白無(wú)跨膜區(qū),為膜外蛋白,因此,該蛋白可在大腸桿菌中表達(dá)。

體外誘導(dǎo)的BoAMA1 重組蛋白經(jīng)SDS-PAGE 和Western Blot 分析顯示,表達(dá)的蛋白主要存在于破碎后的沉淀中,該蛋白以包涵體存在,為不可溶性蛋白。該蛋白能被牛卵形巴貝斯蟲(chóng)陽(yáng)性血清識(shí)別,表明該蛋白具有較好的反應(yīng)原性,為建立特異、敏感的卵形巴貝斯蟲(chóng)檢測(cè)方法奠定了基礎(chǔ),并為下一步開(kāi)發(fā)卵形巴貝斯蟲(chóng)病ELISA 診斷試劑盒提供了科學(xué)依據(jù)。