滅幽湯治療幽門螺桿菌相關(guān)性胃炎脾胃濕熱證的機(jī)理研究*

王小娟 杜中華 喻 斌 郭建生△ 羅 燕 夏 蓉 尹 姣

（1.湖南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院，湖南 長沙 410007；2.湖南中醫(yī)藥大學(xué)，湖南 長沙410007）

幽門螺桿菌相關(guān)性胃炎（HAG）在臨床辨證分型中多表現(xiàn)為脾胃濕熱證［1-4］。筆者的臨床經(jīng)驗(yàn)方——滅幽湯在治療HAG脾胃濕熱證方面取得了良好療效，其功效為清熱利濕、理氣制酸止痛。本課題組對滅幽湯作了一系列的臨床和實(shí)驗(yàn)研究［5-11］，在此基礎(chǔ)上進(jìn)一步探索滅幽湯的作用機(jī)理?，F(xiàn)報告如下。

1 材料與方法

1.1 動物 SPF級8周齡BALB/c小鼠54只，雌雄各半，購自南京君科生物科技有限公司。實(shí)驗(yàn)動物質(zhì)量合格證號 0017145，許可證號 SCXK（蘇）2011-0003。

1.2 Hp菌種 悉尼標(biāo)準(zhǔn)菌株 （Sydney strain 1，SSI），SSI含有細(xì)胞毒素相關(guān)基因（cagA）蛋白和空泡細(xì)胞毒素（vacA），濃度為 Hp菌液 1×109cfu/mL，由湖南中醫(yī)藥大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院病原免疫學(xué)教研室提供。

1.3 藥物 滅幽湯（黃芩、蒲公英、三七、白及、青皮、陳皮、烏賊骨）組方藥材均購于湖南省藥材公司飲片加工廠，經(jīng)湖南中醫(yī)藥研究院鑒定，符合《中國藥典》相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)；藥物浸泡30min后，加水沒過藥面5 cm，武火煎至沸騰后改文火，繼續(xù)煎煮20min，取汁另置。繼續(xù)加水，煎煮沸騰后，文火續(xù)煎20min，取汁。兩次藥汁合并后濃縮至每毫升含生藥1 g，并用離心機(jī)去除藥汁中殘渣，4℃保存。枸櫞酸鉍鉀由麗珠醫(yī)藥生產(chǎn)，批號1212248。替硝唑由山東魯抗醫(yī)藥集團(tuán)賽特有限責(zé)任公司出廠，國藥準(zhǔn)字H20033090；克拉霉素由杭州中美華東制藥有限公司出廠，國藥準(zhǔn)字H10970216。

1.4 儀器與試劑 HHS-2電子恒溫不銹鋼水浴鍋，上海南陽；LEICA DM LB2型雙目顯微鏡，德國LEICA；Shandon325型石蠟切片機(jī)，英國Shandon；Motic B5顯微攝像系統(tǒng)，麥克奧迪實(shí)業(yè)集團(tuán)公司。臺式冷凍離心機(jī)，eppendorf；熒光定量PCR儀、熒光PCR 板，Thermo；恒溫水浴箱，J-MAX；旋渦混合器，其林貝爾；電泳儀、水平瓊脂糖電泳槽，北京六一；-80℃冰箱，中科美菱；電動玻璃勻漿器，新芝；電子天平，民橋；精密pH計，雷磁。膠體金法幽門螺桿菌檢測試劑盒，艾康生物技術(shù)（杭州）有限公司，生產(chǎn)批號201203139；TLR4抗體，武漢博士徳 （BA1717）；二抗試劑盒，北京中衫金橋（SP-9002） 逆轉(zhuǎn)錄試劑盒，F(xiàn)ermentas；EDTA、Tris、DEPC、E.B.，Sigma；Trizol，Invitrogen；Taq 酶 、DL2000 DNA Marker、dNTP，Genstar。 引物， 上海生工；SYBGREEN PCR Master Mix，ABI；IL-6 ELISA 檢 測 試劑 盒 ，R&D公司（E-25764）。普通飼料由湖南斯萊克景達(dá)實(shí)驗(yàn)動物有限公司提供，高糖高脂飼料 （普通飼料+8%蜂蜜+12%豬油）由湖南斯萊克景達(dá)實(shí)驗(yàn)動物有限公司代加工。

1.5 分組與造模 將56只BALB/c小鼠按體質(zhì)量分層后分為4組，每組14只，雌雄各半?？瞻捉M給予普通飼料常規(guī)飼養(yǎng)；模型組、滅幽湯組、胃三聯(lián)組先給予高糖高脂飼料，自由飲水飼養(yǎng)10 d，于第11日放于溫度（35±2）℃，濕度（95±1）%的人工濕熱箱中，繼續(xù)給予高糖高脂飼料，自由飲水。模型組、滅幽湯組、胃三聯(lián)組均于第16日灌胃接種1×109cfu/mL濃度的Hp菌液0.3mL/只，灌胃前24 h禁食，4 h禁水；灌胃后禁食禁水2 h。隔日1次，連續(xù)接種3次。最后1次接種結(jié)束后，飼養(yǎng)條件維持不變，定植2周后以膠體金法檢測血清Hp抗體，取胃黏膜做病理切片觀察炎癥情況，以及做電鏡下觀察Hp定植情況。

1.6 給藥方法 造模成功后，分別給予滅幽湯組、胃三聯(lián)組小鼠灌胃給藥，模型組、空白組小鼠給予等量蒸餾水灌胃，每日1次。按照小鼠與人臨床用藥劑量、體型系數(shù)公式 dB=dA×RB/RA×（WA/WB）1/3計算小鼠用藥劑量，胃三聯(lián)組小鼠用藥劑量為279.8mg/kg，滅幽湯組用藥劑量為12.4 g/kg。

1.7 標(biāo)本采集與檢測 2周后摘眼球取血，然后脫頸椎處死所有小鼠，迅速取出全胃，沿胃大彎剖開，用冰生理鹽水沖洗干凈后放入4%多聚甲醛中4℃固定24 h，石蠟包埋，切片。ELISA檢測血清中白介素（IL）-6的含量，免疫組化法檢測小鼠胃黏膜組織中TLR4的蛋白陽性表達(dá)，實(shí)時熒光定量PCR法檢測小鼠胃黏膜組織中的TLR4基因的mRNA含量。（1）TLR4蛋白陽性表達(dá)：石蠟切片脫蠟至水，蒸餾水沖洗，PBS浸泡5min。0.01mol/L枸櫞酸鈉緩沖液（pH6.0）中微波爐加熱修復(fù)抗原。 3%H2O2室溫孵育 10min，PBS 沖洗，5min×3次。10%正常山羊血清封閉，室溫孵育10min。傾去血清，滴加濃度（1∶100）TLR4 的一抗，37 ℃孵育 2 h。 PBS沖洗，5min×3次。 滴加二抗（1%BSA-PBS 稀釋），37℃孵育30min。PBS沖洗，5min×3次。滴加辣根酶標(biāo)記鏈霉卵白素（PBS稀釋），37℃孵育30min。PBS沖洗，5min×3次。加入DAB顯色劑顯色。自來水充分沖洗，復(fù)染，封片。使用CMIAS真彩色病理圖像分析系統(tǒng)對樣本圖像進(jìn)行分析。每個樣本隨機(jī)選取3個高倍視野，計算黃褐色陽性表達(dá)的面密度（陽性表達(dá)總面積/統(tǒng)計區(qū)域總面積）表示，以此表示TLR4蛋白的表達(dá)，進(jìn)行半定量分析。（2）TLR4基因的含量：提取胃黏膜組織總RNA。逆轉(zhuǎn)錄cDNA總體系20μL：組織中mRNA為模板進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，逆轉(zhuǎn)錄cDNA；反應(yīng)條件：70℃加熱 5min，37℃加熱 5min，42℃加熱 1.5 h；72℃反應(yīng)10min。 TLR4 引物序列為 F：5′-CCTTTCAGGGAATTAAGCTCC-3′，R：5′-ACCGATGGACGTGTAAACCA-3′。qRT-PCR 反應(yīng)體系總體積 30μL，反應(yīng)條件：95℃10min，然后95℃ 5 s，54℃ 30 s，共40個循環(huán)。 采用相對定量比較actin基因與目標(biāo)基因的Ct值，得出所測目標(biāo)基因相對表達(dá)量。相對mRNA表達(dá)=2-△Ct×100%，△Ct值=靶基因Ct值-actin Ct值。結(jié)果由PCR儀配套軟件計算。

1.8 統(tǒng)計學(xué)處理 應(yīng)用SPSS19.0統(tǒng)計軟件。計量資料以（±s）表示，符合正態(tài)性和方差齊性的資料，采用完全隨機(jī)化設(shè)計的方差分析、多重比較，不符合正態(tài)性和方差齊性，用秩和檢驗(yàn)Kruskal-WallisH檢驗(yàn)，兩組比較用 Wilcoxon檢驗(yàn)和 Mann-Whitney U檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 各組小鼠胃黏膜免疫組化結(jié)果 見圖1。免疫組化圖片中黃褐色區(qū)域?yàn)殛栃员磉_(dá)。光鏡下觀察，空白組小鼠胃黏膜組織TLR4有極少量表達(dá)；模型組小鼠胃黏膜組織TLR4有大量陽性表達(dá)；滅幽湯組和胃三聯(lián)組小鼠胃黏膜組織有少量TLR4陽性表達(dá)，明顯少于模型組。

圖1 各組小鼠胃黏膜組織TLR4免疫組化陽性表達(dá)

2.2 各組小鼠胃黏膜組織TLR4表達(dá)的比較 見表1?？瞻捉M小鼠胃黏膜組織中有極少量TLR4表達(dá)。與空白組比較，模型組小鼠胃黏膜TLR4表達(dá)增加，差異有顯著統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01），滅幽湯組與胃三聯(lián)組小鼠胃黏膜TLR4蛋白表達(dá)增加，差異有顯著統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01），TLR4mRNA 表達(dá)增加，差異有顯著統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01）。與模型組比較，滅幽湯組與胃三聯(lián)組小鼠胃黏膜TLR4表達(dá)降低，差異有顯著統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01）；滅幽湯組與胃三聯(lián)組相互比較，TLR4表達(dá)差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。

表1 各組小鼠胃黏膜組TLR4蛋白及其mRNA表達(dá)比較（±s）

表1 各組小鼠胃黏膜組TLR4蛋白及其mRNA表達(dá)比較（±s）

與空白組比較，*P＜0.01；與模型組比較，△P＜0.01。下同。

組 別 n TLR4蛋白（×10-3μm2） TLR4mRNA（×10-4）空白組 8 5.49±1.10 3.05±0.68模型組 8 78.83±19.66* 65.13±11.45*滅幽湯組 8 14.42±3.92*△ 12.50±6.40*△胃三聯(lián)組 8 15.90±5.22*△ 15.23±7.75*△

2.3 各組小鼠血清IL-6表達(dá)的比較 見表2?？瞻捉M小鼠血清中有極少量IL-6表達(dá)。與空白組比較，模型組小鼠血清中IL-6表達(dá)增加，差異有顯著統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01），滅幽湯組與胃三聯(lián)組小鼠血清中IL-6表達(dá)增加，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。與模型組比較，滅幽湯組與胃三聯(lián)組小鼠血清中IL-6表達(dá)降低，差異有顯著統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01）；滅幽湯組與胃三聯(lián)組比較，血清中IL-6表達(dá)差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。

表2 各組小鼠血清IL-6比較（±s）

表2 各組小鼠血清IL-6比較（±s）

組 別 n IL-6（ng/L）空白組 8模型組 8滅幽湯組 8 10.60±0.56 38.16±5.26*11.01±1.45△胃三聯(lián)組 811.56±1.54△

3 討 論

HAG 屬于中醫(yī)學(xué) “胃脘痛”、“痞滿”、“嘈雜”、“泛酸”等病范疇。研究顯示，慢性胃病脾胃濕熱證的Hp感染率較高［12-14］，且Hp為致病生物因子符合現(xiàn)代濕熱證成因的研究［15-16］。 Toll樣受體（TLRs）是先天免疫反應(yīng)中識別病原微生物并作出防御反應(yīng)的重要受體，它能特異的識別病原體，介導(dǎo)跨膜信號轉(zhuǎn)導(dǎo)并誘導(dǎo)活化免疫細(xì)胞而觸發(fā)一系列的炎癥反應(yīng)［17］。TLR4是人類發(fā)現(xiàn)的第一個TLRs相關(guān)蛋白，其主要識別革蘭陰性菌細(xì)胞膜上的脂多糖（LPS），而LPS本身并不造成機(jī)體的嚴(yán)重?fù)p害，它主要通過促使巨噬細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞、中性粒細(xì)胞等釋放大量的細(xì)胞因子，導(dǎo)致機(jī)體組織的損害。LPS主要與巨噬細(xì)胞表面的Toll4受體結(jié)合，最終啟動TNF-α、IL-6等細(xì)胞因子基因的表達(dá)。

TLR4為巨噬細(xì)胞表面LPS的受體［18-20］，其表達(dá)的高低與細(xì)胞因子的釋放具有直接的關(guān)系。幽門螺桿菌LPS可以誘導(dǎo)體內(nèi)一些炎癥因子如IL-6分泌的增加［21-22］，這可能與幽門螺桿菌 LPS 激活 TLR4/NF-κB傳導(dǎo)通路有關(guān)［23-24］。細(xì)胞因子在介導(dǎo)和調(diào)節(jié)免疫應(yīng)答及炎癥反應(yīng)過程中起到重要作用，而IL-6是重要的促炎因子之一，具有多種生物學(xué)功能，參與細(xì)胞免疫、炎癥反應(yīng)等過程，對炎癥的發(fā)展起促進(jìn)作用，并可致胃十二指腸黏膜的損傷［25］。

滅幽湯功效為清熱利濕、理氣制酸止痛，其中蒲公英、黃連、三七具有抗Hp的作用；陳皮、青皮均具有舒張胃腸道平滑肌作用，可有效緩解胃痛脹滿等癥狀；烏賊骨具有中和胃酸作用，改善胃腸道環(huán)境從而影響Hp的生長環(huán)境達(dá)到輔助抗Hp保護(hù)胃黏膜的作用；青皮可改善胃腸血流量，白及具有胃腸道黏膜保護(hù)作用，協(xié)同三七共同促進(jìn)損傷的黏膜修復(fù)。胃三聯(lián)藥物是通過殺滅Hp，在胃黏膜表面形成保護(hù)膜干預(yù)Hp的定植來治療Hp相關(guān)性胃炎，而其他療法不同之處在于使用PPI、H2受體阻滯劑或者中和胃酸制劑，其作用機(jī)理為抑制胃酸分泌或者中和胃酸保護(hù)胃黏膜，同時胃酸的減少改變了Hp的生長環(huán)境，從而達(dá)到抑制乃至殺滅Hp的目的。

本研究顯示，模型組TLR4及下游炎癥因子IL-6表達(dá)顯著高于空白組，而經(jīng)藥物治后滅幽湯組、胃三聯(lián)組表達(dá)顯著降低，說明根除Hp后可以降低TLR4的表達(dá)，減少IL-6的產(chǎn)生。根據(jù)已知的胃三聯(lián)藥物作用機(jī)理和藥理研究對中藥組方滅幽湯的認(rèn)識，推測滅幽湯治療HAG脾胃濕熱證的功效，其機(jī)理可能是通過抑制Hp生長，殺滅Hp，干預(yù)TLR4、IL-6的表達(dá)從而降低胃黏膜組織的炎性程度以達(dá)到治療HAG脾胃濕熱證的目的。

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