淺談食品微生物檢驗中大腸菌群測定的注意事項

周燕霞

洽洽食品股份有限公司 安徽合肥 230601

在食品微生物檢驗中，大腸菌群是評價食品衛(wèi)生質(zhì)量的重要指標之一。大腸菌群是指一群能發(fā)酵乳糖、產(chǎn)酸產(chǎn)氣、需氧和兼性厭氧的革蘭氏無芽孢桿菌。調(diào)查研究表明，大腸菌群多存在于溫血動物糞便、人類經(jīng)常活動的場所以及有糞便污染的地方，人畜糞便對外界環(huán)境的污染是大腸菌群在自然界存在的主要原因。

在食品微生物檢驗中，大腸菌群檢驗大多采用大腸菌群平板計數(shù)法，主要原理為大腸菌群在固體培養(yǎng)基中發(fā)酵乳糖產(chǎn)酸，在指示劑的作用下形成可計數(shù)的紅色或紫色，帶有或不帶有沉淀環(huán)的菌。在食品微生物檢驗大腸菌群測定當中，對相應的事項加以注意，從而取得更為準確的檢測結(jié)果[1]。

1 樣品采集

樣品的采集應遵循隨機性、代表性的原則，采樣時檢查樣品是否完整，是否有破損情況。根據(jù)食品的種類及數(shù)量，采樣數(shù)量及方法應按標準檢驗方法的要求進行。樣品采集后應立即送往檢驗室進行檢驗，送檢過程中一般不超過3h，如路程較遠，可保存在1～5℃環(huán)境中，如需冷凍者，則在凍存狀態(tài)下送檢。如果發(fā)現(xiàn)有下列情況之一者，可拒絕檢驗：

（1）樣品經(jīng)過特殊高壓、煮沸或其他方法殺菌者，失去代表原食品檢驗意義者。

（2）瓶、袋裝食品已啟開者，熟肉及其制品、熟禽等食品已折碎不完整者，即失去原食品形狀者（食物中毒樣品除外）。

（3）按規(guī)定采樣數(shù)量不足者。

對送檢符合要求的樣品， 檢驗室收到后，應立即進行檢驗，如果條件不具備，應置4℃冰箱存放，及時準備創(chuàng)造條件，然后進行檢驗[2]。

2 器具和稀釋液

在大腸菌群檢測中，實驗中使用的試管、移液槍槍頭、培養(yǎng)皿、鑷子、剪刀等，用牛皮紙包扎，必須都經(jīng)過高壓蒸汽滅菌鍋在121℃下滅菌15min，并用滅菌指示條驗證滅菌效果。試驗中使用的225mL稀釋液稱量瓶和9mL稀釋液試管，都需要經(jīng)過高壓蒸汽滅菌鍋在121℃下滅菌15min。滅菌前，避免9mL稀釋液試管塞由于高壓蒸汽噴出，試管塞不要塞得過緊。同時，從滅菌鍋取出時，應按壓試管塞，以免高壓蒸汽使其過松。

3 樣品稀釋

在無菌室內(nèi)，按照無菌操作取25克或25毫升樣品進行稀釋，于225毫升滅菌稀釋液中進行剪碎放置，經(jīng)過充分振蕩，稀釋為1：10的溶液。根據(jù)實際的檢測要求和對樣品污染情況的估計，將溶液配置為10倍遞增稀釋液。每次稀釋后，必須對滅菌移液槍槍頭進行更換。稀釋過程中，移液槍槍頭不能與容器口外側(cè)和其他位置接觸，避免帶入其他污染物。在加入9mL稀釋液時，應沿試管壁緩慢加入，避免接觸稀釋液。

4 平板接種培養(yǎng)

不同梯度的稀釋液，應接種2個平板，用滅菌移液槍槍頭吸取1mL稀釋液加入其中。大腸菌群平板培養(yǎng)所用的培養(yǎng)基為結(jié)晶紫中性紅膽鹽瓊脂（VRBA），配置方式按照瓶身使用說明，加熱煮沸，煮沸不超過2min，并在3小時內(nèi)使用完。配置好的VRBA培養(yǎng)基在46℃恒溫水浴中保溫，以備后續(xù)使用。如果超過了限定溫度，可能會對大腸菌群生長造成影響。而如果溫度過低，則瓊脂容易發(fā)生凝固，難以均勻的混合。在對平皿進行傾注的過程中，應傾入15～20毫升，避免太薄干裂或太厚影響后續(xù)證實實驗的菌落挑取[3]。對于帶有沉淀的瓊脂底部，應當進行舍棄。在加入平皿之后，為了避免片狀大腸菌群產(chǎn)生，應當將培養(yǎng)基快速傾注混合，然后進行旋轉(zhuǎn)混勻。對于被檢樣品來說，從最初的稀釋到最后的傾注，時間應當控制在20分鐘以內(nèi)。在大腸菌群測定中，為了對污染進行更好的控制，應當進行空白對照實驗。

5 證實實驗

接種環(huán)和鑷子等金屬工具，需將鎳鉻絲環(huán)口等接觸培養(yǎng)基的地方在火焰的氧化焰部位灼燒至紅，以避免接種環(huán)上可能存在的微生物污染培養(yǎng)基，然后將其余可能伸人試管或培養(yǎng)皿的部分均勻地通過火焰，需冷卻后進行接種以免溫度太高殺死菌種。接種時，也需在酒精燈火焰周圍進行，以保證無菌環(huán)境。根據(jù)生長的菌落大小及形態(tài)，判斷挑取典型菌落和可疑菌落，典型菌落為紫紅色，周圍有紅色的膽鹽沉淀環(huán)，菌落直徑為0.5mm或更大，可疑菌落直徑較典型菌落直徑小。若肉湯管中小導管是否產(chǎn)氣很難判斷，可輕輕晃動試管，將試管傾斜一定角度，如果有大量小氣泡從底部升上來，并有逐漸增多的趨勢，此時可判定為陽性

6 培養(yǎng)及廢棄物處理

培養(yǎng)過程中，避免頻繁打開培養(yǎng)箱，隨時監(jiān)控培養(yǎng)箱溫度，保證其在適宜的溫度進行培養(yǎng)。經(jīng)培養(yǎng)的污染材料及廢棄物應放在嚴密的容器或鐵絲筐內(nèi)，并集中存放在指定地點，待統(tǒng)一進行高壓滅菌（121℃30min）方可處理。打碎的培養(yǎng)物，立即用5%煤酚皂溶液或石炭酸液噴灑和浸泡被污染部位，浸泡半小時后再擦拭干凈。

7 環(huán)境的影響

檢測時，窗戶和空調(diào)要關閉，定期開啟紫外燈，對房間進行殺菌處理。檢測前，將超凈臺內(nèi)部進行清潔，用 75%酒精進行擦拭消毒，并提前半小時將超凈臺紫外燈打開，對超凈臺內(nèi)部環(huán)境進行殺菌。.每次檢測后，要對超凈臺內(nèi)部進行清理、清潔，并用75%酒精進行擦拭消毒。紫外燈根據(jù)其使用壽命要及時更換。檢測同時，要做上相應菌落檢測的環(huán)境空白。不得隨意出入無菌間，如需要傳遞物品，可通過傳遞窗傳遞。整個實驗過程應在酒精燈火焰的外焰保護區(qū)域進行操作。

8 結(jié)語

食品安全關系到消費者健康不容忽視，人們對食品安全問題重視程度也在不斷提高，對應的食品安全檢測問題必須引起重視，確保得到食品相對應的準確結(jié)果。