海人酸促進(jìn)小膠質(zhì)細(xì)胞增殖的P38MAPK/AP-1信號(hào)通路的研究

王娜　佟鳳芝　曾常茜

【摘 要】目的：觀察海人酸活化BV-2小膠質(zhì)細(xì)胞的增殖，通過(guò)P38MAPK/AP-1信號(hào)通路探討海人酸活化BV-2小膠質(zhì)細(xì)胞增殖的相關(guān)分子機(jī)制。方法：BV-2細(xì)胞隨機(jī)分為對(duì)照組、海人酸組，用倒置顯微鏡觀察各組BV-2細(xì)胞數(shù)量及形態(tài);用免疫組化法檢測(cè)各組BV-2細(xì)胞c-Jun、c-Fos和P38蛋白的表達(dá)。結(jié)果：倒置顯微鏡結(jié)果顯示，海人酸組與對(duì)照組相比，BV-2細(xì)胞數(shù)量增加，胞體變大變圓，突起變短或消失;免疫組化結(jié)果顯示，對(duì)照組BV-2細(xì)胞c-Jun蛋白表達(dá)陽(yáng)性率為0.041±0.003;海人酸組BV-2細(xì)胞c-Jun蛋白表達(dá)陽(yáng)性率為0.805±0.029，較對(duì)照組顯著增加（P<0.05）;對(duì)照組BV-2細(xì)胞c-Fos蛋白表達(dá)陽(yáng)性率為0.039±0.003;海人酸組BV-2細(xì)胞c-Fos蛋白表達(dá)陽(yáng)性率為0.784±0.028，較對(duì)照組顯著增加（P<0.05）;對(duì)照組BV-2細(xì)胞p38蛋白表達(dá)陽(yáng)性率為0.216±0.013;海人酸組BV-2細(xì)胞p38蛋白表達(dá)陽(yáng)性率為0.438±0.014，較對(duì)照組顯著增加（P<0.05）。結(jié)論：海人酸活化的BV-2細(xì)胞增殖，其分子機(jī)制可能與上調(diào)P38MAPK/AP-1信號(hào)通蛋白表達(dá)有關(guān)。

【關(guān)鍵詞】BV-2小膠質(zhì)細(xì)胞;增殖;P38MAPK;AP-1

【中圖分類號(hào)】R282【文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼】A【文章編號(hào)】1005-0019（2019）22--01

癲癇是大腦神經(jīng)元異樣放電誘發(fā)的腦功能障礙疾病[1]。癲癇的病因之一是小膠質(zhì)細(xì)胞的數(shù)量及形態(tài)異常，導(dǎo)致細(xì)胞殘骸積累和炎癥反應(yīng)增加[2]。所以，深入研究小膠質(zhì)細(xì)胞增殖價(jià)值是防治癲癇的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。本實(shí)驗(yàn)檢測(cè)海人酸活化小膠質(zhì)細(xì)胞P38MAPK、AP-1蛋白表達(dá)，旨在揭示海人酸活化小膠質(zhì)細(xì)胞的分子機(jī)制。

1 材料

BV-2小膠質(zhì)細(xì)胞株由中國(guó)醫(yī)科大學(xué)提供。兔抗小鼠p38蛋白抗體、兔抗小鼠c-Jun抗體、羊抗兔HRP-IgG抗體、小鼠抗小鼠c-Fos抗體、兔抗小鼠HRP-IgG抗體、DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清、海人酸、DAB 顯色劑均購(gòu)自試劑公司。

2 方法

2.1 細(xì)胞的實(shí)驗(yàn)分組

將BV-2細(xì)胞隨機(jī)分為對(duì)照組、海人酸組。

2.2 倒置顯微鏡觀察BV-2細(xì)胞增殖

BV-2細(xì)胞5% CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)24h，分為二組，觀察小膠質(zhì)細(xì)胞數(shù)量及形態(tài)。

2.3 免疫組化法檢測(cè)BV-2細(xì)胞c-Jun，c-Fos和P38蛋白表達(dá)

將處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的BV-2細(xì)胞分為三組，PBS清洗后，多聚甲醛處理，曲拉通固定，H2O2孵育，羊血清封閉。再加入兔抗小鼠c-Jun 抗體、兔抗小鼠p38蛋白抗體、小鼠抗小鼠c-Fos抗體，4 ℃冰箱中過(guò)夜，次日PBS沖洗后加入羊抗兔HRP-IgG抗體、兔抗小鼠HRP-IgG抗體，PBS沖洗。DAB顯色，蘇木素復(fù)染，中性樹(shù)膠封片，鏡下觀察。

2.4 統(tǒng)計(jì)分析

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用SPSS17.0統(tǒng)計(jì)軟件，計(jì)量資料以（）表示，組間比較用單因素方差分析。P<0.05為差異具有顯著性。

3 結(jié)果

3.1 海人酸活化BV-2細(xì)胞的增殖

結(jié)果見(jiàn)圖1。倒置顯微鏡下可見(jiàn)對(duì)照組（圖A）BV-2細(xì)胞貼壁，形態(tài)規(guī)則，體積瘦小，突起細(xì)而長(zhǎng)。海人酸組（圖B）與對(duì)照組相比，BV-2細(xì)胞數(shù)量較多，且生長(zhǎng)密集成團(tuán)，細(xì)胞體積變大變圓，突起變短或消失。

3.2 海人酸活化BV-2細(xì)胞c-Jun蛋白、c-Fos蛋白及p38蛋白的表達(dá)

結(jié)果見(jiàn)表1。對(duì)照組BV-2細(xì)胞c-Jun蛋白表達(dá)陽(yáng)性率為0.041±0.003，c-Fos蛋白表達(dá)陽(yáng)性率為0.039±0.003，p38蛋白表達(dá)陽(yáng)性率為0.216±0.013;海人酸組BV-2細(xì)胞c-Jun蛋白表達(dá)陽(yáng)性率為0.805±0.029，c-Fos蛋白表達(dá)陽(yáng)性率為0.784±0.028，p38蛋白表達(dá)陽(yáng)性率為0.438±0.014，結(jié)果均高于對(duì)照組（P<0.05）。

4 討論

4.1 海人酸活化小膠質(zhì)細(xì)胞的增殖

Benson MJ等[3]用海人酸建立小鼠癲癇模型，用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)到小鼠海馬M1小膠質(zhì)細(xì)胞數(shù)量明顯增多。本實(shí)驗(yàn)用海人酸體外作用BV-2細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)海人酸組與對(duì)照組比較胞體增大，突起減少甚至不見(jiàn)，細(xì)胞分布密集，數(shù)量明顯增多，表明海人酸可以促進(jìn)BV-2細(xì)胞增殖。

4.2 海人酸活化小膠質(zhì)細(xì)胞p38蛋白的表達(dá)

p38是絲裂原活化蛋白激酶（MAPKs）家族中重要的亞家族，參與轉(zhuǎn)錄調(diào)控、細(xì)胞增殖、凋亡等病理過(guò)程。Hwang CJ等[4]研究發(fā)現(xiàn)ERα基因缺陷小鼠小膠質(zhì)細(xì)胞活性增加，表明小膠質(zhì)細(xì)胞參與神經(jīng)損傷性疾病可能與p38蛋白高表達(dá)有關(guān)。本實(shí)驗(yàn)免疫組化測(cè)定細(xì)胞p38蛋白陽(yáng)性率顯著增高，表明p38蛋白可能參與了小膠質(zhì)細(xì)胞活化。

4.3 海人酸活化小膠質(zhì)細(xì)胞AP-1蛋白的表達(dá)

AP-1由c-Fos和c-Jun形成的同源或異源二聚體構(gòu)成，作用于基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控，參與細(xì)胞的分裂增殖[5]。Meade AJ等[6]用海人酸處理小膠質(zhì)細(xì)胞，模擬癲癇發(fā)病模型，發(fā)現(xiàn)小膠質(zhì)細(xì)胞死亡數(shù)量明顯下降。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)海人酸體外刺激小膠質(zhì)細(xì)胞，結(jié)果發(fā)現(xiàn)免疫組化測(cè)定細(xì)胞c-Jun和c-Fos蛋白陽(yáng)性率顯著增高，表明AP-1蛋白可能參與了癲癇小膠質(zhì)細(xì)胞活化。

綜上，海人酸促進(jìn)BV-2細(xì)胞增殖可能與上調(diào)P38MAPK/AP-1信號(hào)通蛋白表達(dá)有關(guān)，此為進(jìn)一步揭示小膠質(zhì)細(xì)胞增殖的分子機(jī)制提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)。有關(guān)海人酸活化小膠質(zhì)細(xì)胞對(duì)其他信號(hào)通路的作用機(jī)制尚不清楚，有待進(jìn)一步深入研究。

參考文獻(xiàn)

Ngugi AK， Bottomley C， Fegan G，et al.Premature mortality in active convulsive epilepsy in rural Kenya： Causes and associated factors[J].Neurology， 2014， 82（7）： 582-589.

Diazaparicio I， Beccari S， Abiega O， et al.Clearing the corpses： regulatory mechanisms， novel tools， and therapeutic potential of harnessing microglial phagocytosis in the diseased brain[J].Neural Regeneration Research， 2016， 11（10）：1533-1539.

Benson MJ， Manzanero S， Borges K.Complex alterations in microglial M1/M2 markers during the development of epilepsy in two mouse models[J].Epilepsia， 2015， 12（9）： 21-60.

Hwang CJ， Choi DY， Jung YY， et al.Inhibition of p38 pathway-dependent MPTP-induced dopaminergic neurodegeneration in estrogen receptor alpha knockout mice[J].Horm Behav.2016，80：19-29.

Wagner E F.AP-1-Introductory remarks.[J].Oncogene， 2001， 20（19）：2334-2335.

Meade A J， Meloni B P， Mastaglia F L， et al.AP-1 inhibitory peptides attenuate in vitro cortical neuronal cell death induced by kainic acid.[J].Brain Research， 2010， 1360（1）：8-16.