精準(zhǔn)醫(yī)學(xué)背景下關(guān)于臨床PCR擴(kuò)增實驗室存在的不足及反思

朱一帆 時超杰 李莎莎 何敖林

[摘要] 近年來精準(zhǔn)醫(yī)學(xué)的應(yīng)用不斷擴(kuò)大，促進(jìn)了PCR實驗室的蓬勃發(fā)展，同時PCR實驗室的檢測準(zhǔn)確度也影響著精準(zhǔn)醫(yī)療的臨床效果。PCR技術(shù)要求相對較高，稍有污染或操作不慎就容易造成結(jié)果偏差，所以檢查實驗室的疏漏和改進(jìn)完善尤為重要。

[關(guān)鍵詞] 精準(zhǔn)醫(yī)學(xué);PCR實驗室;檢測準(zhǔn)確度

[中圖分類號] R19 [文獻(xiàn)標(biāo)識碼] A [文章編號] 1672-5654（2019）09（b）-0023-03

近年來隨著基因組測序技術(shù)的不斷進(jìn)步以及大數(shù)據(jù)科學(xué)的快速發(fā)展，精準(zhǔn)醫(yī)學(xué)—一種新型醫(yī)學(xué)概念與醫(yī)療模式受到越來越多人的廣泛關(guān)注。精準(zhǔn)醫(yī)療是指利用患者的基因組信息，再與蛋白質(zhì)組學(xué)等相關(guān)內(nèi)環(huán)境信息相結(jié)合，最后制定出針對患者的一套包括精確診斷、用藥及預(yù)后判斷的治療方案，可以實現(xiàn)治療效益最大化和醫(yī)療資源配置最優(yōu)化[1]。基因檢測是精準(zhǔn)醫(yī)療中最基礎(chǔ)的一環(huán)，數(shù)據(jù)的背后都離不開PCR實驗室的支持，因此PCR實驗室出具的檢測結(jié)果的準(zhǔn)確性就顯得尤為重要?，F(xiàn)在PCR技術(shù)已經(jīng)在傳染病、腫瘤靶向、生殖遺傳等領(lǐng)域被廣泛應(yīng)用，但因為該技術(shù)對待測核酸進(jìn)行了多次、大量的擴(kuò)增，所以即使極微量的污染也容易導(dǎo)致結(jié)果出現(xiàn)假陽性;其次PCR技術(shù)要求相對較高，實驗過程繁復(fù)，中間環(huán)節(jié)如果出現(xiàn)遺漏疏忽，就有可能導(dǎo)致結(jié)果假陰性。為避免結(jié)果假陰性、假陽性以及出現(xiàn)誤差，需要實驗室人員及時發(fā)現(xiàn)實驗室存在的不足并加以改正，這樣才能為臨床的進(jìn)一步治療提供最精準(zhǔn)的數(shù)據(jù)。

1 ?該院臨床PCR擴(kuò)增實驗室介紹

1.1 ?PCR實驗室的基本概況

基于昆山地區(qū)腫瘤發(fā)生率逐年增高的現(xiàn)狀，該PCR擴(kuò)增實驗室計劃引進(jìn)部分高端分子診斷項目，在此基礎(chǔ)上開展藥物基因組學(xué)檢測、腫瘤分子靶向檢測、生殖及遺傳相關(guān)疾病的檢測，以提高醫(yī)院的分子診斷水平。該PCR實驗室為昆山市第一人民醫(yī)院臨床實驗研究中心下設(shè)的專業(yè)分子檢測實驗室，按照《醫(yī)療機(jī)構(gòu)臨床基因擴(kuò)增檢驗實驗室管理辦法》建立，并通過江蘇省臨床檢驗中心認(rèn)證，從事臨床標(biāo)本的基因擴(kuò)增檢測及相關(guān)實驗工作。該PCR實驗室主要通過實時熒光PCR技術(shù)檢測基因位點做出臨床診斷，由試劑貯存準(zhǔn)備區(qū)、標(biāo)本制備區(qū)、擴(kuò)增區(qū)和產(chǎn)物檢測區(qū)4個區(qū)組成，配備有副主任檢驗師1名，主管檢驗師1名，初級檢驗師2名。

1.2 ?現(xiàn)開展的臨床項目簡介

該PCR實驗室現(xiàn)已開展及計劃開展基因檢測項目共7項，包括EGFR基因突變檢測、MTHFR基因突變檢測、ALDH2基因突變檢測、CYP2C9基因突變檢測、VKORC1基因突變檢測、CYP2C19基因突變檢測、藥物性耳聾基因突變檢測，主要為針對抗凝藥物、腫瘤藥物、葉酸、氨基糖苷類抗生素等藥物的臨床基因檢測。目的在于檢測藥物對不同基因型人群是否有效、指導(dǎo)最適劑量、檢驗藥物療效、提示不良反應(yīng)。

2 ?PCR實驗室現(xiàn)存在的不足

2.1 ?PCR實驗過程中易發(fā)生污染

產(chǎn)生污染主要有以下4個原因：①是PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的污染。這也是最常見的污染原因。PCR產(chǎn)物經(jīng)反復(fù)多次的擴(kuò)增，其復(fù)制量遠(yuǎn)遠(yuǎn)超過PCR的檢測極限，所以即使是極微量的污染也足以造成實驗結(jié)果假陽性。②試劑的污染。在試劑的配制過程中，接觸了污染的容器、移液器、槍頭、溶液等物導(dǎo)致試劑被污染。③待測樣品被污染。放置樣品的容器被污染或由于容器密封不嚴(yán)導(dǎo)致樣品與外界接觸被污染;其次在核酸提取過程中使用了被污染的移液器或槍頭導(dǎo)致樣品被污染;另外，某些樣品中含有病毒，若彌散到空氣中則有可能形成交叉污染。④氣溶膠污染。若氣溶膠中包含病毒等污染物擴(kuò)散至空氣中極有可能造成PCR產(chǎn)物污染。氣溶膠是由空氣與液體表面摩擦而產(chǎn)生的，開蓋、晃動反應(yīng)管及污染加樣器的反復(fù)吸樣都可形成氣溶膠從而導(dǎo)致交叉污染。據(jù)計算一個氣溶膠顆粒可含48 000拷貝，因此，應(yīng)尤其重視由氣溶膠導(dǎo)致污染的問題[2]。PCR實驗室只要出現(xiàn)了污染，之前的結(jié)果報告就變?yōu)闊o效而且也無法進(jìn)行其他的實驗操作。必須找出并徹底清除污染源，才能得到準(zhǔn)確有效的實驗結(jié)果。

2.2 ?實驗室的質(zhì)量控制存在缺陷

實驗室的質(zhì)量控制分為：室內(nèi)質(zhì)量控制和室間質(zhì)量控制。室內(nèi)質(zhì)量控制是指實驗室人員通過一定的方法和步驟，連續(xù)評價實驗室工作的可靠程度，旨在監(jiān)測和控制實驗室常規(guī)工作的精密度，提高實驗室常規(guī)工作中批內(nèi)、批間樣本檢驗的一致性，以確定測定結(jié)果是否可靠及可否發(fā)出報告的一項工作[3]。室間質(zhì)量控制是指客觀比較實驗室的測定結(jié)果與靶值的差異，由外部機(jī)構(gòu)采取一定的方法，連續(xù)、客觀地評價實驗室的結(jié)果，發(fā)現(xiàn)誤差并校正結(jié)果，使各實驗室之間的結(jié)果具有可比性[4-5]。該實驗室存在以下幾個缺點：①使用的質(zhì)控品因為存放時間長久，存在使用時間超過保質(zhì)期的問題，并且質(zhì)控品來源單一導(dǎo)致不能及時發(fā)現(xiàn)質(zhì)控品的質(zhì)量問題;②質(zhì)量控制的方法在SOP文件中表述不明確;③出現(xiàn)失控后反思問題分析原因不夠全面、深入，多為混勻不充分、移液器存在誤差、孵育時間不夠等粗略的理由;④質(zhì)控周期太長，如果實驗過程中存在疏漏，不能及時發(fā)現(xiàn)并改正。

2.3 ?規(guī)范管理不到位

為了提高實驗室的檢測質(zhì)量，避免實驗室污染以及確保實驗室的生物安全，規(guī)范有效的管理是實現(xiàn)這一切的根本措施。但有時會出現(xiàn)管理不到位甚至是疏忽的地方，比如隨意出入實驗室，甚至逆行;沒有按照規(guī)范穿戴口罩、鞋套;試驗期間緩沖間兩側(cè)門同時打開;實驗完畢后忘記開紫外燈消毒等。這些不規(guī)范的行為為實驗室的安全和污染埋下了隱患，從而影響檢驗結(jié)果的準(zhǔn)確性。因此，有效的管理和實驗室操作規(guī)程的規(guī)范執(zhí)行尤為重要。

3 ?改進(jìn)方法

3.1 ?防治污染的措施

3.1.1 ?實驗室清潔 ?①每個實驗區(qū)都應(yīng)配備專用的消毒試劑、工具。②如有樣本或者試劑外濺的情況，應(yīng)立即先用 10%次氯酸鈉擦拭，再用清水擦洗，作好記錄。③實驗結(jié)束后用10%次氯酸鈉對有可能被污染的區(qū)域如桌面、生物安全柜等進(jìn)行消毒，并用移動消毒車對這些區(qū)域消毒（30 min）。④每日結(jié)束工作后用10%次氯酸鈉擦拭移液器。⑤在實驗結(jié)束離開實驗室前，開啟室內(nèi)紫外燈定對實驗室進(jìn)行紫外照射消毒（60 min）。⑥工作服需要每周交于洗衣房清洗消毒，而且不可將不同區(qū)的工作服于同一天清洗。

3.1.2 規(guī)范操作 ?①在操作中佩戴手套避免接觸到與試管內(nèi)面，使用帶濾芯的吸頭、離心管。②取樣，加標(biāo)本、反應(yīng)液之前應(yīng)先高速離心將管蓋上液體沉于管底，以避免開蓋時液體飛濺和產(chǎn)生氣溶膠污染環(huán)境[6]。③若發(fā)生液體飛濺，首先隔離相關(guān)未被污染的物品，其次用吸水紙將液體吸干，再用2 000 mg/L的次氯酸鈉消毒液覆蓋30 min，75%乙醇擦拭2遍，最后用紫外燈消毒39 min[7]。

3.1.3 廢棄物的處理 ?①剩余血液的處理：由實驗室工作人員在每工作日下午16：00交科洗滌人員連同盛血用的試管一起置黃色垃圾袋中送醫(yī)療器具處理公司處理，并記錄。②一次性塑料吸管、移液器吸頭的處理：實驗過程中使用后的一次性塑料吸管、移液器吸頭放入含10%次氯酸鈉的廢物缸中，每天工作結(jié)束后，置黃色垃圾袋中交科洗滌人員送醫(yī)療器具處理公司處理，并記錄。③廢棄的擴(kuò)增產(chǎn)物的處理：置于一次性塑料袋中，再放至黃色垃圾袋中，交專門人員處理，并記錄。④使用過的一次性口罩、手套、帽子等，放置于黃色垃圾袋中，交科洗滌人員送醫(yī)療器具處理公司，并記錄。

3.2 ?提高PCR實驗室的質(zhì)量控制水平

PCR實驗室的質(zhì)量控制應(yīng)注意以下幾點：①選擇質(zhì)控品時應(yīng)考慮其濃度、基質(zhì)、穩(wěn)定性等特性，表達(dá)陰性質(zhì)控品可作定量試驗，表達(dá)弱陽性和陰性質(zhì)控品可作定性試驗。②擴(kuò)大質(zhì)控品的來源，選擇不同廠家的同一種質(zhì)控品分別做質(zhì)控試驗，對比結(jié)果。③為更好地監(jiān)測每一個孔的擴(kuò)增有效性，建議對質(zhì)控品每次擴(kuò)增的位置進(jìn)行順延，順延規(guī)則應(yīng)在SOP文件中表述清楚。④出現(xiàn)失控后反思問題不能流于表面，應(yīng)該多從以下幾個方面考慮：核酸的提取過程中是否存在誤差、擴(kuò)增時各個反應(yīng)孔之間的溫度升降是否一致、探針的純度、標(biāo)記效率是否符合標(biāo)準(zhǔn)、實驗人員的技術(shù)水平是否達(dá)標(biāo)[8]。⑤縮短質(zhì)控的試驗周期，以便及時發(fā)現(xiàn)問題并處理問題。

3.3 ?加強(qiáng)PCR實驗室的規(guī)范管理

①設(shè)備的管理：儀器設(shè)備的管理由實驗室負(fù)責(zé)人組織執(zhí)行和監(jiān)督管理。需定期作校準(zhǔn)或檢定的儀器應(yīng)有校準(zhǔn)。PCR實驗室每個分區(qū)的儀器設(shè)備均為專用。實驗人員必須先熟悉掌握儀器的操作流程和相關(guān)性能才能使用該儀器，并經(jīng)實驗室負(fù)責(zé)人考核認(rèn)可后方可進(jìn)行儀器操作。主要儀器使用后應(yīng)做好使用記錄和日常維護(hù)，如高速冷凍離心機(jī)、基因擴(kuò)增儀等。實驗室儀器應(yīng)由專門人員管理維護(hù)，非本室人員在使用儀器時應(yīng)有專人指導(dǎo)并作好記錄。

②人員的管理。實驗人員必須嚴(yán)格遵守實驗室的各項規(guī)章制度和操作流程。由實驗室負(fù)責(zé)人安排本實驗室人員的工作，如常規(guī)檢驗工作、設(shè)備維修管理、實驗室清潔消毒等。新安排人員須經(jīng)基因擴(kuò)增技術(shù)培訓(xùn)并取得合格證后方可上崗。加強(qiáng)實驗人員“無基因、防污染”的概念及生物安全培訓(xùn)。安裝門禁系統(tǒng)、氣鎖連動門等措施來加強(qiáng)管理。實驗人員進(jìn)入實驗室路徑：公共清潔區(qū)—更衣區(qū)—緩沖間—污染實驗區(qū)。實驗室人員退出實驗室路徑：污染實驗區(qū)—緩沖間—更衣區(qū)—公共清潔區(qū)，不可逆行。

4 ?小結(jié)

精準(zhǔn)醫(yī)學(xué)時代的來臨使得醫(yī)學(xué)實踐變得越來越個體化，它從每個人在基因、環(huán)境等方面的差異，為每位患者提供最適合的治療。在精準(zhǔn)醫(yī)學(xué)不斷發(fā)展普及的大趨勢下，PCR的臨床應(yīng)用也從最初的感染性疾病的檢測，到現(xiàn)在腫瘤的診斷與個體化治療、產(chǎn)前篩查及遺傳病診斷等。因此要獲得精準(zhǔn)的數(shù)據(jù)就需要嚴(yán)格按照實驗室規(guī)范來進(jìn)行工作，及時發(fā)現(xiàn)疏漏并改正，不斷反思改進(jìn)，只有規(guī)范PCR的臨床應(yīng)用，才能更好地為臨床一線服務(wù)。

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（收稿日期：2019-06-19）