響應(yīng)面優(yōu)化芥末籽油的水酶法提取工藝及其脂肪酸分析

,2,*,3

(1.云南民族大學(xué)化學(xué)與環(huán)境學(xué)院,云南昆明 650500;2.云南省跨境民族地區(qū)生物質(zhì)資源清潔利用國(guó)際聯(lián)合研究中心,云南昆明 650500;3.民族地區(qū)礦產(chǎn)資源綜合利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,云南昆明 650500)

芥末(SinapisalbaL.)為十字花科植物,其成熟的種子經(jīng)碾磨后得到的油為芥末油[1],它具有一種獨(dú)特的味覺(jué)刺激性氣味,主要為異硫氰酸烯丙酯[2],可刺激唾液和胃液的分泌,能夠解膩爽口、增強(qiáng)食欲,有開(kāi)胃作用;還富含多種脂肪酸的甘油酯,如芥酸、油酸、亞油酸和亞麻酸等,被廣泛應(yīng)用于制作涼拌菜、酸菜、蘸水、咖喱粉的調(diào)味品[3];另外還有解魚(yú)蟹之毒、美容養(yǎng)顏等功效[4]。

芥末籽油的傳統(tǒng)提取工藝主要為壓榨和蒸餾法[5],壓榨法成本高、出油率較低,且需要經(jīng)熱力機(jī)械處理,容易影響熱敏性物質(zhì)的活性,而蒸餾法同樣存在出油率較低、不利于工業(yè)化生產(chǎn)的缺點(diǎn)[6]。水酶法主要在物理破碎的基礎(chǔ)上,直接采用蛋白酶[7]、淀粉酶[8]、果膠酶[9]、纖維素酶[10]等破壞植物細(xì)胞,使油脂從破壞了的組織中被釋放出來(lái),該過(guò)程不需要有機(jī)溶劑,所提取的油脂不需要脫膠工序,也能保持油脂原有的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值,且設(shè)備簡(jiǎn)單、操作安全、環(huán)境友好,該法所得油脂質(zhì)量高、色澤淺[11-12]、符合當(dāng)代可持續(xù)發(fā)展理念。

雖然國(guó)內(nèi)外已對(duì)水酶法提取花生油[13]、米糠油[14]、菜籽油等[15]展開(kāi)了大量的研究,但尚未見(jiàn)水酶法提取芥末籽油的相關(guān)報(bào)道。本文主要研究了各因素對(duì)芥末籽出油率的影響,采用響應(yīng)面分析法確定了較優(yōu)的提取工藝條件,進(jìn)一步采用GC-MS分析脂肪酸的組分,為芥末油的綜合利用奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

芥末籽 購(gòu)自內(nèi)蒙古,堿性蛋白酶(20萬(wàn)U/g)、中性蛋白酶(6萬(wàn)U/g)、α-淀粉酶(3700U/g)、纖維素酶(140萬(wàn)U/g) 北京奧博星生物技術(shù)有限公司;鹽酸 重慶川東化工有限公司;氫氧化鈉(分析純) 天津市風(fēng)船化學(xué)試劑科技有限公司。

7890-5435氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀 美國(guó)安捷倫公司;GZX-9246M BE數(shù)顯鼓風(fēng)干燥箱 天津市泰斯特儀器有限公司;F2102型植物粉碎機(jī) 寧波雙嘉儀器有限公司;PHsJ-4A實(shí)驗(yàn)室pH計(jì) 上海精密儀器有限公司;榮華THZ-82A水浴恒溫振蕩器 上海邦西儀器科技有限公司;LXJ-IIB 離心機(jī) 廣豐科技有限公司;KQ-250E型超聲波清洗機(jī) 昆山市超聲儀器有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 芥末籽油水酶法提取及出油率的計(jì)算 工藝流程:芥末籽→干燥粉碎→過(guò)篩(40目篩)→配液→超聲→調(diào)pH、溫度→加酶酶解→高溫滅酶(90 ℃,10 min)→離心分離→收集上層清油→稱重→計(jì)算出油率。

準(zhǔn)確稱取芥末籽粉20 g于200 mL燒杯中,按7∶1 (mL/g)的液固比添加140 mL的蒸餾水,超聲功率為80 W的條件下,于超聲波清洗器中超聲破壁8 min后,加入適量的酶,再用氫氧化鈉調(diào)節(jié)體系的 pH,再在水浴恒溫振蕩器中酶解一定的時(shí)間,酶解結(jié)束后升溫至90 ℃滅酶10 min,待自然冷卻后,置于離心機(jī)上于5000 r/min的條件下離心12 min后,待油水層分開(kāi)后,將上層油相置于分液漏斗中并加入5 mL石油醚,靜置5 min,收集上層油相后,用無(wú)水碳酸鈉干燥后稱重,即得芥末籽油。芥末籽出油率按下式計(jì)算:

1.2.2 不同酶制劑對(duì)芥末籽出油率的影響 參照1.2.1的提取方法,在加酶量2.5%、液固比7∶1 (mL/g)、酶解時(shí)間6 h、酶解溫度、酶解 pH為對(duì)應(yīng)酶的適宜值的條件下,比較堿性蛋白酶、中性蛋白酶、α-淀粉酶、纖維素酶和不加酶(空白)五種情況下對(duì)芥末籽出油率的影響,從而確定出適宜酶制劑。每處理組設(shè)3個(gè)重復(fù)。四種常見(jiàn)酶的最適pH及溫度條件參見(jiàn)表1。

表1 四種常見(jiàn)酶的最適pH及溫度Table 1 Optimum pH and temperature of four common enzymes

1.2.3 單因素實(shí)驗(yàn) 以芥末籽油出油率為指標(biāo),在總加酶量確定的條件下分別考察液固比、堿性蛋白酶酶解時(shí)間和酶解溫度對(duì)芥末籽油出油率的影響。

1.2.3.1 酶解時(shí)間對(duì)出油率的影響 在酶解溫度45 ℃、酶解pH10.0、液固比7∶1 (mL/g)和加酶量2.5%的條件下,考察芥末籽分別在2、4、6、8和10 h酶解時(shí)間下對(duì)芥末籽出油率的影響。每處理組設(shè)3個(gè)重復(fù)。

1.2.3.2 酶解溫度對(duì)出油率的影響 在酶解時(shí)間6 h、酶解pH10.0、液固比 7∶1 (mL/g)和加酶量2.5%的條件下,考察芥末籽在41、43、45、47和49 ℃的酶解溫度下對(duì)芥末籽出油率的影響。每處理組設(shè)3個(gè)重復(fù)。

1.2.3.3 液固比對(duì)出油率的影響 在酶解時(shí)間6 h、酶解溫度45 ℃、酶解pH10.0和加酶量2.5%的條件下,考察芥末籽在4∶1、5∶1、6∶1、7∶1、8∶1和9∶1 (mL/g)的液固比條件下對(duì)芥末籽出油率的影響。每處理組設(shè)3個(gè)重復(fù)。

1.2.4 響應(yīng)面優(yōu)化出油率實(shí)驗(yàn) 以實(shí)驗(yàn)中的液固比、酶解溫度和酶解時(shí)間3個(gè)因素為自變量,以芥末籽出油率為響應(yīng)值,以-1、0、1代表因素水平編碼,采用Design Expert軟件進(jìn)行實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)[16],根據(jù)CCD設(shè)計(jì)原理,液固比、酶解溫度、酶解時(shí)間各設(shè)置3個(gè)水平,見(jiàn)表2。然后根據(jù)所得設(shè)計(jì)結(jié)果再次進(jìn)行實(shí)驗(yàn)優(yōu)化,對(duì)優(yōu)化后的實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行響應(yīng)面分析,獲取所需實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)。

表2 Box-Behnken實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)因素水平Table 2 Factors and level of response surfaceoptimization in Box-Behnken design

1.2.5 酶解芥末油中脂肪酸組成的GC-MS測(cè)定 甲酯化:稱取水酶法所得芥末油1 mL于圓底燒瓶中,加入10 mL甲醇—?dú)溲趸c(體積比為10∶1)溶液,于8O ℃恒溫水浴鍋中加熱反應(yīng)20 min后冷卻,用正己烷萃取2～3次,合并萃取液,蒸餾水洗滌3次,并用無(wú)水硫酸鈉干燥,取上清液待測(cè)。

色譜柱:HP-5MS(30 m×0.25 mm×0.25 um)毛細(xì)管柱,載氣為高純度的氦氣,流速為1 mL/min;程序升溫為初始溫度40 ℃保持3 min,以5 ℃/min升溫至300 ℃,恒溫3 min。進(jìn)樣量0.1微升,進(jìn)樣口溫度280 ℃。

質(zhì)譜條件:EI離子源溫度為230 ℃,電子能量70 eV,接口溫度230 ℃,發(fā)射電流為36.4 uA,溶劑延遲0.2 min,采用峰面積歸一化法進(jìn)行半定量分析,確定芥末油中的種類和相對(duì)含量。

1.3 數(shù)據(jù)處理

本實(shí)驗(yàn)所有數(shù)值均為三次以上測(cè)定值,以平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差表示,實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)均采用 Origin 8.5數(shù)據(jù)分析軟件,在響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)中采用Design-Expert 8.1.6 統(tǒng)計(jì)分析軟件,P>0.05為不顯著;0.01

2 結(jié)果與分析

2.1 不同酶制劑對(duì)芥末籽出油率的影響

由圖1看出,芥末籽出油率最高的是堿性蛋白酶,出油率達(dá)到21.5%,是對(duì)照組的10.75倍,是α-淀粉酶的2.38倍,說(shuō)明堿性蛋白酶在芥末籽出油率中提取效果是最佳的。其中纖維素酶和α-淀粉酶的效果不佳,雖然它能夠水解細(xì)胞壁的主要成分纖維素和分解細(xì)胞壁多糖,但其最適pH為酸性或中性,此條件下不利于蛋白質(zhì)與油脂的分離,造成蛋白質(zhì)的浪費(fèi),而采用堿性蛋白酶酶解可以破壞脂蛋白、脂小體蛋白膜的結(jié)構(gòu)從而釋放油脂[17],芥末籽出油率最高,故選取堿性蛋白酶進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

圖1 不同酶制劑對(duì)芥末籽出油率的影響Fig.1 Effect of different enzymeson the oil yield of mustard seeds

2.2 單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.2.1 酶解時(shí)間對(duì)出油率的影響 由圖2可知,酶解初期芥末籽出油率隨酶解時(shí)間的延長(zhǎng)呈現(xiàn)上升的趨勢(shì),當(dāng)酶解時(shí)間達(dá)到6 h時(shí),出油率最高,但6 h后,出油率反而呈現(xiàn)降低的趨勢(shì),這可能是酶解時(shí)間過(guò)長(zhǎng)時(shí),體系中的油脂溶出已經(jīng)達(dá)到了動(dòng)態(tài)平衡[18],說(shuō)明選擇合適的酶解時(shí)間既證油脂的品質(zhì),也節(jié)約生產(chǎn)成本,故確定適宜酶解時(shí)間為6 h。

圖2 酶解時(shí)間對(duì)芥末籽出油率的影響Fig.2 Effect of enzymatic reaction timeon oil yield of mustard seeds

2.2.2 酶解溫度對(duì)出油率的影響 如圖3所示,當(dāng)酶解溫度較低時(shí),堿性蛋白酶活性低,不利于酶解反應(yīng)的進(jìn)行,隨著酶解溫度的升高,出油率顯著升高,當(dāng)酶解溫度達(dá)到45 ℃時(shí),出油率最高達(dá)到了23%;但隨著溫度的升高,當(dāng)達(dá)到49 ℃時(shí),出油率降低到了16%。說(shuō)明過(guò)高的酶解溫度會(huì)導(dǎo)致酶變性或部分失活[19],不利于芥末籽油的提取,故確定適宜酶解溫度為45 ℃。

圖3 酶解溫度對(duì)芥末籽出油率的影響Fig.3 Effect of enzymatic temperatureon oil yield of mustard seeds

圖4 液固比對(duì)芥末籽出油率的影響Fig.4 Effect of liquid-solid ratioon oil yield of mustard seeds

2.2.3 液固比對(duì)出油率的影響 如圖4所示,隨著液固比的增加,芥末籽出油率也隨之升高,當(dāng)液固比為7∶1 (mL/g)時(shí),出油率達(dá)到21%,之后隨著液固比的增加,出油率略有下降。表明當(dāng)體系中液固比較低時(shí),物料黏度較大,流動(dòng)性差,不利于酶與底物充分作用,反之,當(dāng)體系中液固比較高時(shí),堿性蛋白酶與底物的濃度均降低,分子之間彼此碰撞的幾率也大大的降低[20],此時(shí)酶解不充分,故本實(shí)驗(yàn)確定最適宜的液固比為7∶1 (mL/g)。

表4 芥末籽出油率回歸方差分析結(jié)果Table 4 Regression variance analysis results of the oil yield of mustard seed

注:*:P>0.05為不顯著;**:P<0.05為顯著;***:P<0.01為極顯著。2.3 響應(yīng)面優(yōu)化實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.3.1 數(shù)學(xué)模型的建立與顯著性結(jié)果 據(jù)CCD試驗(yàn)設(shè)計(jì),以液固比、酶解時(shí)間和酶解溫度3個(gè)因素作為自變量A、B、C,芥末籽油的出油率作為響應(yīng)值R,通過(guò)Expert 8.1.6分析軟件獲得的實(shí)驗(yàn)方案及其采用該方案獲得的實(shí)驗(yàn)結(jié)果如表3所示。

表3 CCD試驗(yàn)設(shè)計(jì)及實(shí)驗(yàn)結(jié)果Table 3 CCD test design and experimental results

由表3 CCD試驗(yàn)設(shè)計(jì)結(jié)果可知,響應(yīng)值芥末籽出油率R與各影響因子間的回歸方程為:

R出油率=21.20+2.06A+3.88B+0.69C+0.12AB-0.75AC+0.13BC-3.60A2-4.48B2_2.85C2

所得模擬方程具有較好的相關(guān)性,相關(guān)系數(shù)為R2=0.9238。此外,對(duì)回歸模型進(jìn)行了方差分析,結(jié)果如表4所示。

建立模型的P<0.01,具有極顯著性,失擬項(xiàng)的P=0.1075>0.05,無(wú)顯著性,由此可見(jiàn),所建模型可用于芥末籽出油率的響應(yīng)面分析。此外,A、B、A2、B2、C2項(xiàng)的P值均小于0.05,表現(xiàn)出顯著性,這表明液固比、酶解溫度、酶解時(shí)間均為提取芥末籽油過(guò)程中影響出油率的主要因素,其中B、A2和B2項(xiàng)的P<0.01,即液固比和溫度對(duì)出油率的影響極為顯著,而A和C2的P<0.05,表明液固比和酶解時(shí)間的影響效果要弱于酶解溫度。AB、AC、BC項(xiàng)中,P值均大于0.05,這表明以上三個(gè)因素對(duì)芥末籽出油率的影響交互作用不顯著。

2.3.2 響應(yīng)面分析 通過(guò)Expert 8.1.6分析軟件對(duì)表3中的數(shù)據(jù)進(jìn)行二次多元回歸擬合,交互作用顯著的響應(yīng)面等高線圖如圖5所示,3組圖很直觀的反映了液固比、溫度和時(shí)間對(duì)芥末籽出油率的影響。

圖5 各因素及其交互作用對(duì)水酶法提取影響出油率的響應(yīng)面圖Fig.5 Response surface diagram of each factor and its interaction effect on mustard oil extraction with enzyme

圖5顯示了A(液固比)、B(酶解溫度)和C(酶解時(shí)間)3個(gè)因素對(duì)芥末籽油出油率的等高線圖(a、c、e)和3D響應(yīng)面圖(b、d、f)。圖5a中沿著B(niǎo)因素(酶解溫度)向峰值方向移動(dòng),其等高線的密度明顯高于沿A因素(液固比)方向,則酶解溫度對(duì)芥末籽出油率的影響更為顯著,由對(duì)應(yīng)的3D響應(yīng)面圖(圖5b)也能獲取相同的結(jié)果,在A因素方向,響應(yīng)面曲線較為平緩,液固比對(duì)芥末籽出油率的影響較小,說(shuō)明酶解溫度對(duì)出油率的影響大于液固比。

圖5c和5d也顯示了A因素(液固比)和C因素(酶解時(shí)間)有明顯的交互作用。在等高線圖中,沿著C因素向峰值方向移動(dòng)的等高線密度要相對(duì)低于沿A因素方向。3D響應(yīng)面圖(圖5d)顯示在A因素方向響應(yīng)面曲線有一定的坡度,在C因素方向,響應(yīng)面曲線較為平緩,因此,液固比對(duì)出油率的影響大于酶解時(shí)間。

由圖5e和圖5f看出B因素(酶解溫度)和C因素(酶解時(shí)間)的交互作用同樣具有顯著性。由兩因素沿峰值方向的等高線密度及與之對(duì)應(yīng)的3D響應(yīng)面(圖5f)的陡峭程度可以看出,B、C兩因素對(duì)芥末籽出油率的影響也存在較大差異,酶解溫度的影響更為顯著。綜合分析可以發(fā)現(xiàn),3個(gè)因素對(duì)芥末籽出油率的影響有所不同,其影響程度大小為:酶解溫度>液固比>酶解時(shí)間。

通過(guò)響應(yīng)面分析試驗(yàn)對(duì)芥末籽出油率進(jìn)行了優(yōu)化分析,得到的最優(yōu)條件為:酶解溫度為45 ℃、液固比為7∶1 (mL/g)、酶解時(shí)間為6 h時(shí),預(yù)測(cè)的最優(yōu)芥末籽出油率為21.2%,通過(guò)3次實(shí)驗(yàn)檢驗(yàn)最優(yōu)預(yù)測(cè)條件下的提取效果,芥末籽出油率達(dá)到了(23%±0.58%),與預(yù)測(cè)值相差2.8%,總體接近預(yù)測(cè)值,說(shuō)明該響應(yīng)面分析模型下得到的最佳工藝條件具有較高的可靠性。

2.4 芥末油脂肪酸分析

通過(guò)氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀對(duì)酶解芥末油中脂肪酸進(jìn)行分析,總離子流色譜圖如圖6所示。

圖6 酶解芥末油中甲酯化產(chǎn)物成分的總離子流色譜圖Fig.6 Total ion chromatogram of the methyl esterificationproduct components in enzymatically treated mustard oil

采用GC-MS法測(cè)定分析酶解芥末油中主要的脂肪酸的組成,并通過(guò)峰面積歸一化法計(jì)算每種脂肪酸的相對(duì)含量。結(jié)果由表5所示,酶解芥末油中主要的脂肪酸是不飽和脂肪酸,相對(duì)含量高達(dá)為81.34%,飽和脂肪酸含量為6.26%;其中油酸含量高達(dá)50.72%,芥酸相對(duì)含量達(dá)到16.42%,二十碳烯酸相對(duì)含量達(dá)到13.51%。由于芥末籽的品種、產(chǎn)地和成熟度等都會(huì)對(duì)芥末油的化學(xué)組成有一定的影響,因此在不同的報(bào)道中對(duì)脂肪酸的組成有一定的差異。吳國(guó)欣等[21]用乙醚提取芥末籽中的芥末油,不飽和脂肪酸的相對(duì)含量高達(dá)80%以上,芥酸的相對(duì)含量為21.51%,油酸的相對(duì)含量為11.9%,亞油酸相對(duì)含量為34.8%;陳振德等[22]報(bào)道索氏提取的芥末油中不飽和脂肪酸占總量的90%以上,油酸相對(duì)含量高達(dá)19.57%,芥酸相對(duì)含量為25.56%。所以,芥末油中的高含量不飽和脂肪酸可有利于促進(jìn)兒童大腦生長(zhǎng)發(fā)育、調(diào)節(jié)血脂等,具有較高的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值。

表5 酶解芥末油甲酯化產(chǎn)物的成分分析與相對(duì)含量Table 5 Composition analysis and relativecontent of enzymatically hydrolyzed mustardoil methyl esterification products

3 結(jié)論

在水酶法提取工藝中,堿性蛋白酶是提取芥末籽油的最適酶制劑。影響出油率的因素主要為酶解溫度、液固比和酶解時(shí)間。響應(yīng)面法分析表明,2.5%堿性蛋白酶、pH10.0、酶解溫度為45 ℃、液固比為7∶1 (mL/g)和酶解時(shí)間6 h,芥末籽出油率可達(dá)到23%。成分分析顯示,該水酶法提取的芥末籽油具有較高的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值。