高壓均質(zhì)處理對(duì)不同濃度肌原纖維蛋白水懸液理化特性及蛋白結(jié)構(gòu)的影響

,*

(1.南京農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科技學(xué)院,國(guó)家肉品質(zhì)量安全控制工程技術(shù)研究中心,江蘇南京 210095;2.江蘇省肉類生產(chǎn)與加工質(zhì)量安全控制協(xié)同創(chuàng)新中心,江蘇南京 210095;3.山東省煙臺(tái)市東方海洋科技股份有限公司,山東煙臺(tái) 246003)

肉類蛋白營(yíng)養(yǎng)豐富,包含人類所需的所有必需和非必需氨基酸,其消化率遠(yuǎn)高于大豆蛋白等植物蛋白,屬于優(yōu)質(zhì)的人體蛋白質(zhì)補(bǔ)充劑[1-2]。肌原纖維蛋白(Myofibrillar proteins,MP)是肌肉蛋白中最主要的蛋白質(zhì),大約占肌肉蛋白的50%左右[3]。一般認(rèn)為,MP屬于鹽溶性蛋白,僅在高鹽濃度下有較高的溶解性,在水溶液中溶解性差[4]。在肉品加工中,MP溶解性直接影響產(chǎn)品加工特性,如粘結(jié)性、乳化性和凝膠型等[5-6]。因此,MP溶解性是開發(fā)新的配方和肉類產(chǎn)品一個(gè)重要的功能特性。由于肉類蛋白在水或者低離子強(qiáng)度溶液條件下中微溶或不溶解,因此相比于牛奶和植物蛋白等而言,肉類蛋白在食品加工中利用程度相對(duì)較低,產(chǎn)品形式單一,提高肉類蛋白在水或者低離子強(qiáng)度溶液中的溶解度很有必要。

為了提高肉類蛋白的利用程度,開發(fā)其加工潛力,許多研究人員嘗試?yán)貌煌姆椒?如超聲波[7]、蛋白糖基化[8-9]和低鹽洗脫[10]等新技術(shù)來(lái)改善MP的溶解性,但是由于這些方法步驟繁瑣,并且容易引起加工特性劣變,故在工業(yè)生產(chǎn)中受限。高壓均質(zhì)(High pressure homogenization,HPH)是一種新型的食品加工技術(shù),此項(xiàng)技術(shù)已經(jīng)被研究應(yīng)用于生物、醫(yī)藥、食品、化工等行業(yè)。在高壓作用下,流體物料通過(guò)具有特殊內(nèi)部構(gòu)造的均質(zhì)腔,同時(shí)受到高速剪切,高頻震蕩、空穴作用和對(duì)流碰撞等物理作用,從而起到很好的超微化、微乳化、均一化和殺菌的效果[11-13]。理論上,通過(guò)HPH的物理作用能夠打破MP高度交聯(lián)的復(fù)雜結(jié)構(gòu),對(duì)MP進(jìn)行物化改性,能夠?qū)崿F(xiàn)MP的水溶性。已有研究表明,不同次數(shù)和壓力的HPH處理可以對(duì)植物蛋白的蛋白結(jié)構(gòu)[14-17]、理化特性產(chǎn)生不同的影響,從而提高植物蛋白在食品加工中的利用程度[18-20]。在前期研究中[13],發(fā)現(xiàn)對(duì)5 mg/mL的MP懸濁液進(jìn)行103 MPa、2次HPH處理,能夠打破MP高度有序的復(fù)雜結(jié)構(gòu),改變MP的理化特性,從而改善MP的水溶性。蛋白質(zhì)是一種人體營(yíng)養(yǎng)的重要補(bǔ)充來(lái)源,而蛋白濃度是食品加工中的一項(xiàng)重要理化指標(biāo),蛋白濃度的不同會(huì)影響體系中的凝膠特性、溶解性和乳液穩(wěn)定性等加工特性。5 mg/mL濃度的MP水懸液并不能滿足食品加工的需要,同時(shí),當(dāng)MP在水中的濃度提高時(shí),HPH處理對(duì)不同濃度的MP在水中的溶解性的影響以及其調(diào)控規(guī)律還尚不清楚,開展HPH對(duì)不同濃度MP水懸液溶解性的調(diào)控規(guī)律研究很有必要。

在前期研究的基礎(chǔ)上,為了使MP達(dá)到較好的HPH處理效果,本實(shí)驗(yàn)通過(guò)103 MPa壓力下,4次HPH循環(huán)分別對(duì)5、10、15 mg/mL的MP水懸液進(jìn)行處理,對(duì)處理后的MP水懸液溶解性、穩(wěn)定性、粒徑、流變特性、二級(jí)結(jié)構(gòu)和三級(jí)結(jié)構(gòu)的變化進(jìn)行測(cè)定,探究HPH處理對(duì)不同濃度MP理化性質(zhì)及結(jié)構(gòu)的影響和規(guī)律,以期為肉蛋白的在食品中的進(jìn)一步開發(fā)利用提供一定的參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

冷凍雞胸肉 江蘇省南京市蘇果超市;羥甲基氨基甲烷(Tris base)、鹽酸、牛血清蛋白(BSA)、聚乙二醇辛基苯基醚(Triton X-100)、氫氧化鈉、5,5′-二硫代雙(2-硝基苯甲酸)(DTNB)、8-苯胺基-1-萘磺酸(ANS)等(均為分析純) 國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

GM 200粉碎儀 德國(guó)Retsch儀器有限公司;T25勻漿機(jī) 德國(guó)IKA儀器有限公司;Mini Debee超高壓均質(zhì)機(jī) 美國(guó)Bee儀器有限公司;Z5(130 μm)金剛石噴嘴 美國(guó)Genizer儀器有限公司;J26SXP落地式離心機(jī) 美國(guó)Beckman儀器有限公司;Nano ZS 90納米激光粒度儀 英國(guó)馬爾文儀器有限公司;MCR 301流變儀 澳大利亞Anton Paar有限公司;Dimension Icon原子力顯微鏡 美國(guó)Bruker有限公司;Imager Scanner III EU-88 掃描儀 日本Epson公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 肌原纖維蛋白(MP)的提取 根據(jù)Stefansson等[10]的方法稍作修改,采用水洗法提取肌原纖維蛋白。取冷凍雞胸肉在4 ℃下放置12 h解凍,隨后去除其結(jié)締組織和脂質(zhì)。將雞胸肉放入粉碎儀,以3000 r/min的速度處理10 s,用去離子水將肉糜(100 g)混合,洗滌四次,每次洗滌前用勻漿機(jī)均質(zhì)2 min。將每次洗滌后的肉糜與水(1∶100,W/V)混合,靜置10 min,以18000×g轉(zhuǎn)速離心20 min,收集沉淀物,在第三次洗滌后,將離心前的懸濁液用三層紗布過(guò)濾,以去除多余的結(jié)締組織和脂質(zhì)。最后一次洗滌、離心后,沉淀物即為肌原纖維蛋白(MP)。所有操作均在4 ℃條件下進(jìn)行。

1.2.2 高壓均質(zhì)(HPH)處理 用雙縮脲法測(cè)定提取后的MP濃度為60 mg/mL,用去離子水將MP濃度稀釋至5、10、15 mg/mL備用,用勻漿機(jī)在8000 r/min轉(zhuǎn)速下處理6次,每次處理20 s,每次間隔10 s。用配備有Z5型號(hào)噴嘴的超高壓均質(zhì)機(jī)將樣品在4 ℃、103 MPa壓力下進(jìn)行循環(huán)4次HPH處理,以未經(jīng)過(guò)HPH處理的樣品為對(duì)照組。處理后將所有樣品裝入無(wú)菌袋保存,為了防止微生物污染對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果產(chǎn)生影響,添加0.02%的疊氮化鈉(NaN3)作為防腐措施[21],所有樣品于4 ℃冰箱存儲(chǔ)備用。

1.2.3 溶解度的測(cè)定 參考Chen等[13]的方法,并作修改。將經(jīng)過(guò)處理后的樣品在4 ℃條件下,在20000×g轉(zhuǎn)速下離心20 min,離心后收集上清液,用雙縮脲法測(cè)定離心后的上清液蛋白濃度和離心前MP懸濁液蛋白濃度。溶解度以離心后的上清液蛋白質(zhì)濃度相對(duì)于離心前MP懸濁液蛋白濃度的百分比表示,溶解度計(jì)算公式為:

1.2.4 穩(wěn)定性的測(cè)定 將經(jīng)過(guò)HPH處理后的MP水懸液在4 ℃條件下放置9 d,在第0、3、6、9 d分別測(cè)定其溶解度并進(jìn)行記錄,每個(gè)樣品平行測(cè)定3次。

1.2.5 粒徑分布的測(cè)定 根據(jù)Chen等的方法[13],并作修改。使用Nano ZS 90納米激光粒度儀對(duì)MP在水中的粒徑進(jìn)行測(cè)定。將5、10、15 mg/mL的MP水懸液濃度同時(shí)稀釋至0.5 mg/mL,置于1 cm光程石英比色杯中,在25 ℃條件下進(jìn)行測(cè)量,從而得到平均粒度(Z-average)和粒徑分布。

1.2.6 流變特性的測(cè)定 使用MCR30流變儀對(duì)經(jīng)過(guò)HPH處理后的MP水懸液的流動(dòng)特性進(jìn)行測(cè)定[25]。測(cè)量間距0.5 mm,測(cè)量前將樣品在流變儀上平衡30 s,以獲得25 ℃的理想溫度,記錄隨著剪切速率從1 s-1升高到1000 s-1的范圍內(nèi)時(shí)粘度的變化曲線。

1.2.7 表面疏水性的測(cè)定 根據(jù)Zhong等[26]、Cao等[27]的方法并作修改,對(duì)經(jīng)過(guò)HPH處理后的MP在水中表面疏水性的進(jìn)行測(cè)定,使用8-苯胺基-1-萘磺酸(ANS)測(cè)試表面疏水性。向2 mL樣品(去離子水稀釋至1 mg/mL)中加入10 μL 15 mmol/L ANS溶液(0.1 mol/L磷酸鹽緩沖液,pH7.0)。在避光條件下,孵育20 min;使用380 nm的激發(fā)波長(zhǎng)和410～570 nm的發(fā)射波長(zhǎng)在5 nm/s掃描下測(cè)定其熒光強(qiáng)度。表面疏水性表示為熒光強(qiáng)度(任意單位,a.u.)。

1.2.8 活性巰基含量的測(cè)定 根據(jù)Chen等[28]的方法并進(jìn)行修改,測(cè)定MP在水中的活性巰基(SH)含量。將經(jīng)過(guò)HPH處理后的MP水懸液用去離子水稀釋至1 mg/mL,將50 μL DTNB溶液(20 mmol/L磷酸鹽緩沖液,pH8.0)中加入4 mL樣品(1 mg/mL),并在25 ℃條件下孵育20 min,通過(guò)Microplate Reader分光光度計(jì)在412 nm測(cè)定混合物的吸光度。使用13600 M-1·cm-1的摩爾消光系數(shù)計(jì)算巰基的含量,每個(gè)壓力水平重復(fù)試驗(yàn)三次。巰基濃度(μmol/100 mg)的計(jì)算公式為:

式中:A412為吸光度;D為稀釋倍數(shù);C蛋白為肌原纖維蛋白濃度。

1.2.9 圓二色譜(CD)分析 使用Jasco J-715分光偏振計(jì)進(jìn)行圓二色譜(CD)測(cè)定。將經(jīng)過(guò)HPH處理后的MP水懸液稀釋至0.3 mg/mL,隨后轉(zhuǎn)移至0.1 cm光徑的石英皿中。在調(diào)節(jié)溫度下以20 nm/min的掃描速率在200～240 nm的范圍內(nèi)測(cè)量分子橢圓率。使用Jasco J-715旋光偏振計(jì)提供的蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)計(jì)算程序測(cè)定樣品二級(jí)結(jié)構(gòu)的百分比。

1.3 數(shù)據(jù)分析

所有數(shù)據(jù)均重復(fù)實(shí)驗(yàn)3次,數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)使用SAS軟件,單因素方差分析分析組間差異性,P<0.05為顯著差異。采用Origin 2017軟件進(jìn)行繪圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 HPH處理對(duì)不同濃度MP水懸液溶解性的影響

由圖1可知,未經(jīng)過(guò)HPH處理的樣品,溶解度較低(23.49～31.77%),MP在水中的溶解性較差[26],并且不同濃度MP水懸液的溶解度之間沒(méi)有顯著性差異(P<0.05),說(shuō)明濃度的不同對(duì)未經(jīng)HPH處理的MP在水中的溶解性沒(méi)有明顯影響。經(jīng)過(guò)HPH處理后,不同濃度MP水懸液的溶解度均顯著提高(P<0.05),其中濃度為5 mg/mL的MP水懸液溶解性最好,達(dá)到88.39%,這與Chen等[13]的研究結(jié)果相符。物料在經(jīng)過(guò)HPH時(shí),會(huì)受到高速剪切、空穴作用、對(duì)流撞擊等機(jī)械作用,MP蛋白分子結(jié)構(gòu)展開,疏水基團(tuán)更多地暴露出來(lái),導(dǎo)致表面電荷增加,從而提高其溶解性。隨著MP水懸液濃度的增加,觀察到MP水懸液的溶解度顯著降低(P<0.05),說(shuō)明MP水懸液的濃度越高,經(jīng)過(guò)HPH處理后,MP在水中溶解的效果越差,造成這種現(xiàn)象的原因可能是由于當(dāng)高濃度的MP懸濁液通過(guò)HPH作用腔時(shí),由于蛋白質(zhì)密度較大,蛋白質(zhì)在均質(zhì)腔中直接碰撞概率大大提高,容易形成蛋白質(zhì)聚集,影響其溶解性。

圖1 HPH處理對(duì)不同濃度水懸液中MP溶解性的影響Fig.1 Effect of HPH treatment on MP solubilityin water suspensions with different concentrations注:不同上標(biāo)字母表示同一指標(biāo)存在顯著性差異(P<0.05);C-5:Control,5 mg/mL;C-10:Control,10 mg/mL;C-15:Control,15 mg/mL;5:HPH處理,5 mg/mL;10:HPH處理,10 mg/mL;15:HPH處理,15 mg/mL。圖3、圖7同。

2.2 HPH處理對(duì)不同濃度MP水懸液穩(wěn)定性的影響

將經(jīng)過(guò)HPH處理后的MP水懸液進(jìn)行為期9 d的儲(chǔ)藏,每隔3 d測(cè)定樣品溶解度,得到不同濃度MP水懸液溶解度的變化如圖2所示。由圖2可知,未經(jīng)過(guò)HPH處理的MP水懸液在貯藏期間一直保持著較低的溶解度,隨著貯藏時(shí)間的延長(zhǎng),沒(méi)有顯著性變化(P>0.05)。經(jīng)過(guò)HPH處理后,不同濃度MP水懸液的溶解度均顯著提高(P<0.05)。處理濃度為5 mg/mL的MP水懸液溶解度顯著高于其他處理濃度(P<0.05),在0～6 d時(shí)溶解度無(wú)顯著性變化(P>0.05),在6～9 d時(shí)顯著降低(P<0.05),在第9 d時(shí),5 mg/mL的溶解度為79.08%;處理濃度為10 mg/mL的MP水懸液溶解度在第0～9 d時(shí)顯著下降(P<0.05),處理濃度為15 mg/mL的MP水懸液在第3 d時(shí)的溶解度與0 d時(shí)相比顯著下降(P<0.05),3～6 d無(wú)顯著性變化(P>0.05),在第9 d時(shí)顯著低于第3 d(P<0.05)。研究表明,處理濃度為5 mg/mL的MP水懸液經(jīng)過(guò)103 MPa、2次HPH的處理后溶液的均一性得到顯著改善,同時(shí)在14 d的貯藏過(guò)程中幾乎不會(huì)產(chǎn)生蛋白質(zhì)沉淀現(xiàn)象[13,27-28],與本研究結(jié)果一致,這是由于當(dāng)?shù)鞍诐舛容^低時(shí),水懸液的流動(dòng)性更強(qiáng),可以用更快的速度通過(guò)HPH均質(zhì)閥,破碎更為完全,顆粒分布更加均勻,從而提高其穩(wěn)定性。但是,當(dāng)MP的濃度增加時(shí),MP水懸液中的蛋白質(zhì)密度也隨之增加,物料通過(guò)HPH均質(zhì)腔時(shí),剪切、碰碰撞等機(jī)械作用對(duì)蛋白質(zhì)分子的破壞不完全,導(dǎo)致蛋白質(zhì)分子在水懸液中分散不均勻,從而在貯藏過(guò)程中聚集、沉淀,使MP水懸液穩(wěn)定性下降[14,29-30]。

圖2 HPH處理對(duì)不同濃度MP水懸液穩(wěn)定性的影響Fig.2 Effect of HPH treatment on stability ofMP water suspension with different concentrations注:不同上標(biāo)字母表示同一指標(biāo)存在顯著性差異(P<0.05)。

2.3 HPH處理對(duì)不同濃度MP水懸液粒徑的影響

HPH處理對(duì)不同濃度MP水懸液粒徑的影響如圖3和圖4所示。由圖3可知,與經(jīng)過(guò)HPH處理的樣品相比,未經(jīng)處理的樣品具有更大的粒徑[16]。MP水懸液濃度越高,粒徑越大,說(shuō)明溶液中蛋白的粒徑大小隨著MP水懸液濃度的提高而顯著增加(P<0.05)。經(jīng)過(guò)HPH處理后,各處理組MP水懸液的粒徑顯著降低(P<0.05),其中5 mg/mL的MP水懸液粒徑最低(263.4 nm)。與之相比,經(jīng)過(guò)處理后的10、15 mg/mL MP水懸液具有較大的粒徑(P<0.05),分別達(dá)到366.3、400.7 nm,并且兩者之間沒(méi)有顯著性差異(P>0.05)。由圖4可知,隨著MP水懸液濃度的提高,粒徑分布峰有向大粒徑分布的趨勢(shì),10、15 mg/mL的MP水懸液之間沒(méi)有明顯的區(qū)別。未經(jīng)過(guò)HPH處理時(shí),MP懸濁液中可能還存在一些高度有序狀態(tài)的肌原纖維蛋白,導(dǎo)致粒徑較大。MP懸濁液通過(guò)HPH均質(zhì)腔,受到一系列剪切力、空穴作用、碰撞作用等機(jī)械力,蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)被破壞成更小的片段,導(dǎo)致粒徑減小。隨著MP濃度的增加,蛋白質(zhì)在HPH均質(zhì)腔中的相互作用加強(qiáng),可能導(dǎo)致均質(zhì)腔內(nèi)部壓力上升,同時(shí)據(jù)研究報(bào)道,當(dāng)壓力增加時(shí),HPH處理比較容易使蛋白質(zhì)產(chǎn)生聚集[19,31-32]。故高濃度的蛋白可能會(huì)影響HPH均質(zhì)腔中壓力的作用效果,從而影響其粒度特性。

圖3 HPH處理對(duì)不同濃度水懸液中MP的Z-平均粒徑的影響Fig.3 Effect of HPH treatment on Z-average particle size ofMP in water suspensions with different concentrations

圖4 HPH處理對(duì)不同濃度MP水懸液粒徑分布的影響Fig.4 Effect of the HPH treatment on particle size distributionof MP water suspension with different concentrations

2.4 HPH處理對(duì)不同濃度MP水懸液流變特性的影響

MP水懸液的表觀粘度如圖5所示。結(jié)果表明,隨著剪切速率的增加,所有處理組的表觀粘度下降,呈現(xiàn)假塑性流體特征。經(jīng)過(guò)HPH處理后,不同濃度樣品的粘度都較未處理之前有所下降,這與Chen等[13]和鐘俊楨等[20]的研究結(jié)果相符。5 mg/mL的處理組具有最低的粘度,與未處理之前相比,表觀粘度下降最為明顯;而15 mg/mL的處理組經(jīng)過(guò)HPH處理后粘度變化幅度不大,同時(shí)隨著剪切速率的增加,表觀粘度逐漸與未處理的樣品接近。研究表明,蛋白分散體的流動(dòng)行為可以受顆粒尺寸和尺寸分布以及顆粒形狀和顆粒變形性的影響[33-35],在未處理的樣品中具有高粘度、完整的肌原纖維蛋白片段,其中大的蛋白顆粒與大分子相互糾纏,增加了溶液流動(dòng)的阻力[13]。在本研究中,5 mg/mL的MP水懸液經(jīng)過(guò)HPH處理后粒徑最小,說(shuō)明大部分蛋白結(jié)構(gòu)都被破壞,具有較小的蛋白顆粒,所以表觀粘度較低,流動(dòng)性較好。然而,在較高濃度(10、15 mg/mL)的MP水懸液中還存在著許多較大的、未被破壞的完整的肌原纖維蛋白片段以及蛋白質(zhì)聚集體,這會(huì)導(dǎo)致粒徑的增加以及顆粒尺寸的分布不均,從而影響其流動(dòng)能力。

圖5 HPH處理對(duì)不同濃度MP水懸液流變特性的影響Fig.5 Effect of HPH treatment on rheological properties ofMP water suspension with different concentrations

2.5 HPH處理對(duì)不同濃度MP水懸液表面疏水性的影響

MP水懸液表面疏水性的變化如圖6所示。未經(jīng)HPH處理的樣品之間的表面疏水性沒(méi)有明顯區(qū)別,疏水基團(tuán)含量較少。經(jīng)過(guò)HPH處理后,不同濃度的MP水懸液的表面疏水基團(tuán)明顯增加,其中處理后的15 mg/mL樣品表面疏水基團(tuán)明顯少于5、10 mg/mL的樣品,并且5、10 mg/mL樣品之間差別不明顯。在HPH處理之前,疏水基團(tuán)大多數(shù)緊密包埋在球狀區(qū)域內(nèi),與熒光探針的接觸受到抑制[32,36],導(dǎo)致疏水含量較低。在HPH處理的過(guò)程中,MP受到高靜壓、剪切力、碰撞等機(jī)械力作用,蛋白質(zhì)發(fā)生去折疊現(xiàn)象,部分二硫鍵的產(chǎn)生被抑制,促進(jìn)了蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的展開,疏水基團(tuán)暴露并且相互作用,從而導(dǎo)致表面疏水性的提高[29,31,37]。隨著濃度增加到15 mg/mL時(shí),可能由于HPH處理過(guò)程中高濃度蛋白溶液中蛋白質(zhì)更易發(fā)生聚集[37],使粒徑增大,同時(shí)這種聚集阻止了疏水基團(tuán)的暴露,導(dǎo)致與5、10 mg/mL的樣品相比,疏水性較低。但是由圖3的結(jié)果發(fā)現(xiàn),10、15 mg/mL的平均粒徑?jīng)]有顯著差異,這可能是因?yàn)闈舛忍岣邥r(shí),大部分疏水基團(tuán)都包埋在了蛋白質(zhì)分子之間,使疏水性較低。而5 mg/mL的樣品由于其粒徑較小,水懸液內(nèi)部的顆粒分散更加均勻,HPH處理的強(qiáng)剪切力對(duì)蛋白質(zhì)內(nèi)部隱藏的疏水基團(tuán)進(jìn)行切割,更多的疏水基團(tuán)暴露出來(lái),導(dǎo)致疏水性增加明顯[32,41],蛋白質(zhì)表面電荷發(fā)生改變,使水化作用增強(qiáng),從而提高其溶解性[18,39]。

圖6 HPH處理對(duì)不同濃度MP水懸液表面疏水性的影響Fig.6 Effect of HPH treatment on surface hydrophobicity ofMP water suspension with different concentrations

2.6 HPH處理對(duì)不同濃度MP水懸液活性巰基含量的影響

巰基是MP中重要的功能基團(tuán),其含量變化反映了MP蛋白結(jié)構(gòu)的改變[18]。MP水懸液的活性巰基含量變化如圖7所示。經(jīng)過(guò)HPH處理后,不同濃度MP水懸液的活性巰基含量均顯著性增加(P<0.05),其中,5 mg/mL處理組的活性巰基含量(11.73 μmol/100 mg)顯著低于其他處理組(P<0.05),并且處理組的巰基含量隨著MP濃度的增加而增加。有研究表明,HPH處理時(shí)產(chǎn)生的劇烈機(jī)械作用會(huì)造成蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的改變以及蛋白質(zhì)的變性[40],同時(shí),蛋白質(zhì)分子展開后可能會(huì)誘導(dǎo)巰基以及疏水基團(tuán)從蛋白質(zhì)分子內(nèi)部暴露出來(lái),使活性巰基含量增加。當(dāng)MP水懸液濃度較低時(shí),蛋白質(zhì)展開變得松散,蛋白質(zhì)的表面積與體積之比增加,表面電荷分布增強(qiáng),水化作用增強(qiáng),因此增加了蛋白質(zhì)的溶解性[41];同時(shí),由于蛋白顆粒新形成的界面在熱力學(xué)上不穩(wěn)定,導(dǎo)致巰基基團(tuán)發(fā)生重折疊,使其包埋在蛋白質(zhì)分子內(nèi)部,隨后二硫鍵的斷裂和巰基的氧化、包埋形成對(duì)立面,使巰基的氧化和包埋占主導(dǎo)[22],所以MP濃度較低時(shí),活性巰基含量較少。

圖7 HPH處理對(duì)不同濃度MP水懸液活性巰基含量的影響Fig.7 Effect of HPH treatment on active sulfhydryl content ofMP water suspension with different concentrations

2.7 圓二色譜(CD)分析

HPH處理對(duì)不同濃度MP水懸液的二級(jí)結(jié)構(gòu)影響如表1所示。由表1可知,經(jīng)過(guò)HPH處理后,所有處理組均呈現(xiàn)α-螺旋降低,β-折疊、β-轉(zhuǎn)角和無(wú)規(guī)卷曲結(jié)構(gòu)增加的現(xiàn)象,5 mg/mL樣品的α-螺旋降低最為明顯。據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道,HPH處理會(huì)誘導(dǎo)蛋白質(zhì)部分結(jié)構(gòu)的展開,且對(duì)結(jié)構(gòu)改變起主導(dǎo)作用[17]。肌原纖維蛋白中α-螺旋的缺失可能導(dǎo)致分子間相互作用的變化,從而破壞蛋白組裝過(guò)程,導(dǎo)致MP在水中的溶解度增加[25]。在本研究中,當(dāng)?shù)鞍诐舛葹? mg/mL時(shí),蛋白質(zhì)之間的作用力較小,從而導(dǎo)致其結(jié)構(gòu)更易于展開,使溶解度增加。隨著濃度的提升,蛋白在HPH處理過(guò)程中受到的壓力可能也會(huì)隨之提高,而據(jù)研究表明[38],均質(zhì)壓力提升會(huì)導(dǎo)致蛋白質(zhì)之間相互作用加強(qiáng),同時(shí)在疏水作用下,一部分蛋白質(zhì)重新聚集、組裝,α-螺旋也會(huì)隨之增加。同時(shí)β-轉(zhuǎn)角被認(rèn)為是蛋白分子排列有序的產(chǎn)物[38],說(shuō)明經(jīng)過(guò)HPH處理后,MP在水中的均勻性以及蛋白構(gòu)象穩(wěn)定性有所提升,而本研究中,經(jīng)過(guò)HPH處理后所有樣品的β-轉(zhuǎn)角都有明顯提升,與相關(guān)研究結(jié)果一致。

表1 圓二色譜分析MP水懸液的二級(jí)結(jié)構(gòu)組成Fig.1 Analysis of the secondary structural compositions ofMP water suspension by circular dichroism

3 結(jié)論

本文通過(guò)HPH處理不同濃度MP水懸液,并對(duì)其理化特性以及蛋白結(jié)構(gòu)進(jìn)行測(cè)定,發(fā)現(xiàn)在一定的濃度范圍內(nèi)(5～15 mg/mL),HPH處理可以顯著提高不同濃度MP在水中的溶解性(最高達(dá)到88.39%),并且隨著濃度的增加,溶解效果呈現(xiàn)下降趨勢(shì);處理后的樣品在4 ℃條件下放置9 d后仍然能保持最高79.08%的溶解度,具有較好的穩(wěn)定性。同時(shí),經(jīng)過(guò)HPH處理的MP水懸液的分散性、流動(dòng)能力等理化特性得到顯著提升,蛋白二、三級(jí)結(jié)構(gòu)被破壞,處理效果隨著MP濃度的升高而下降。5 mg/mL的MP水懸液經(jīng)過(guò)HPH處理后具有更好的水溶性,當(dāng)濃度提高時(shí),與5 mg/mL相比,10、15 mg/mL的MP水懸液的粒徑有增大的趨勢(shì),造成樣品流動(dòng)能力下降,同時(shí)疏水性下降,活性巰基含量上升,α-螺旋結(jié)構(gòu)增加,這可能與高濃度MP在HPH處理時(shí)容易產(chǎn)生蛋白質(zhì)的聚集有關(guān)。因此,HPH處理對(duì)MP在水中溶解性的改善效果隨著MP濃度的提高而降低,為新型低鹽肉制品的開發(fā)提供了新的思路,但是要實(shí)現(xiàn)較高濃度的MP在水中的溶解,還仍需進(jìn)一步研究。