同種異體脂肪干細(xì)胞聯(lián)合自體富血小板血漿凝膠修復(fù)大鼠皮膚軟組織創(chuàng)面的臨床效果

陳杏綺 羅志軍 殷安柱 田 舉 王和庚

傷口愈合是一種相互協(xié)調(diào)的動(dòng)態(tài)組織修復(fù)過程，涉及多種細(xì)胞、生長因子、細(xì)胞因子等的相互作用，如何在微創(chuàng)或無創(chuàng)情況下促進(jìn)傷口再生修復(fù)是目前醫(yī)學(xué)領(lǐng)域研究的重點(diǎn)課題之一。脂肪干細(xì)胞（ADSCs）和富血小板血漿（PRP）是現(xiàn)階段修復(fù)皮膚創(chuàng)面損傷的常用治療技術(shù)，前者對(duì)真皮細(xì)胞外基質(zhì)膠原的合成有著明顯的刺激作用，可加快皮膚創(chuàng)面愈合速度；后者常用于抑制血管病變、促進(jìn)組織修復(fù)和減輕炎癥反應(yīng)方面，同樣有利于皮膚創(chuàng)面愈合[1-4]。然而現(xiàn)階段這兩種材料聯(lián)合應(yīng)用于創(chuàng)面愈合的臨床研究較為少見[5]。本研究就同種異體ADSCs聯(lián)合自體富血小板血漿凝膠對(duì)大鼠皮膚軟組織創(chuàng)面的修復(fù)效果進(jìn)行分析。現(xiàn)報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 材料

40只SD大鼠，體重220～270 kg，購自中山市人民醫(yī)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，自由進(jìn)食進(jìn)水，室溫和濕度分別控制在20～24 ℃和60%～80%。麻醉藥物為戊巴比妥鈉，檢測(cè)儀器包括全自動(dòng)生化分析儀、真空采血管、巴氏管。

1.2 方法

動(dòng)物模型建立和分組：術(shù)前3 d將大鼠背部鼠毛剔除，麻醉方式為40 mg/kg戊巴比妥鈉腹腔注射，于大鼠背部行3 cm×3 cm全層皮膚缺損創(chuàng)面。將40只SD大鼠隨機(jī)分為A組、B組、C組與D組，每組10只。

處理：A組創(chuàng)緣局部注射異體ADSCs懸液聯(lián)合自體PRP，B組創(chuàng)緣局部注射異體ADSCs懸液，C組創(chuàng)緣局部注射自體PRP，D組采用0.9%氯化鈉注射液靜脈注射方式。（各組均在經(jīng)碘仿與乙醇消毒后，對(duì)背部皮膚進(jìn)行切除，形成創(chuàng)面，之后進(jìn)行藥物注射，1次/d，共治療14 d。）

ADSCs原代細(xì)胞分離、培養(yǎng)與傳代：對(duì)大鼠腹部脂肪組織進(jìn)行體外分離培養(yǎng)，達(dá)到某種程度后實(shí)施培養(yǎng)擴(kuò)增，取第3代ADSCs進(jìn)行誘導(dǎo)分化實(shí)驗(yàn)對(duì)系間充質(zhì)干細(xì)胞予以鑒別，適當(dāng)擴(kuò)充第3代ADSCs數(shù)量，為實(shí)驗(yàn)開展做好準(zhǔn)備。

自體大鼠PRP分離、提取和保存：用含有ACD-A抗凝劑的真空采血管抽取7 ml靜脈血，以1 500 r/min離心20 min，將上層血漿及鄰近界面1 mm處的紅細(xì)胞用巴氏管吸取至其他離心管中，以2 000 r/min離心10 min；底部薄層的白膜樣物質(zhì)為血小板沉積層，上方為血漿層，將大部分血漿吸取后，留下約0.5 ml血漿及血細(xì)胞成分；靜置30 min后，輕晃離心管，直至紅細(xì)胞與血小板在血漿中重懸，將得到的 PRP置于4 ℃冰箱中保存。

1.3 觀察指標(biāo)

比較 4組大鼠創(chuàng)傷面面積、創(chuàng)面愈合時(shí)間、微血管計(jì)數(shù)CD31細(xì)胞陽性表達(dá)率、Ⅰ型膠原蛋白含量和創(chuàng)面組織的轉(zhuǎn)化生長因子-β1（TGF-β1）表達(dá)情況。分別在治療3 d、7 d和14 d后，在大鼠創(chuàng)面表面覆蓋透明薄膜，記錄創(chuàng)面面積，根據(jù)美國國立衛(wèi)生院研制出的Image J醫(yī)學(xué)圖像分析軟件進(jìn)行創(chuàng)面面積的計(jì)算[6]。CD31+、Ⅰ型膠原蛋白含量分別采用蘇木精-伊紅染色法（HE染色）和天狼星紅染色法檢測(cè)，采用逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)（RT-PCR）檢測(cè) TGF-β1表達(dá)情況。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 4組創(chuàng)面面積比較

治療3 d后，各組大鼠創(chuàng)面面積均有所減小，A組創(chuàng)面面積明顯小于 D組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；治療7 d后，A、B、C組大鼠創(chuàng)面面積均明顯縮小，與D組大鼠創(chuàng)面面積比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；治療14 d后，A組大鼠創(chuàng)面面積小于其他各組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），B、C兩組的創(chuàng)面面積比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。見表1。

表1 4組大鼠創(chuàng)面面積比較(cm2,±s)

表1 4組大鼠創(chuàng)面面積比較(cm2,±s)

注：與D組比較，aP＜0.05；與A組比較，bP＜0.05

組別 動(dòng)物數(shù) 3 d后 7 d后 14 d后A組 10 2.68±0.21a 1.12±0.16a 0.08±0.02 B 組 10 2.95±0.18 1.51±0.18a 0.24±0.05b C 組 10 2.98±0.24 1.64±0.20a 0.30±0.06b D組 10 3.45±0.14 2.69±0.25 0.61±0.15b F值 26.623 112.133 70.669 P值 0.000 0.000 0.000

2.2 4組創(chuàng)面完全愈合時(shí)間比較

A、B、C組大鼠創(chuàng)面愈合時(shí)間均明顯短于D組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；B、C兩組大鼠創(chuàng)面愈合時(shí)間比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。見表2。

表2 4組大鼠創(chuàng)面完全愈合時(shí)間比較(d,±s)

表2 4組大鼠創(chuàng)面完全愈合時(shí)間比較(d,±s)

注：與D組比較，aP＜0.05

組別 動(dòng)物數(shù) 創(chuàng)面愈合時(shí)間A組 10 17.95±1.43a B組 10 18.26±1.54a C組 10 18.86±1.32a D組 10 23.15±1.28 F值 30.199 P值 0.000

2.3 4組微血管計(jì)數(shù)CD31細(xì)胞陽性表達(dá)率比較

治療前，4組大鼠的微血管計(jì)數(shù)CD31細(xì)胞陽性表達(dá)率比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；治療后，各組大鼠微血管計(jì)數(shù) CD31細(xì)胞陽性表達(dá)率均明顯上升，A組大鼠微血管計(jì)數(shù)CD31細(xì)胞陽性表達(dá)率明顯高于B、C、D組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。見表3、圖1。

2.4 4組Ⅰ型膠原蛋白和創(chuàng)面組織的TGF-β1表達(dá)率比較

4組大鼠接受治療前的Ⅰ型膠原蛋白含量和創(chuàng)面組織的 TGF-β1表達(dá)率比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；治療7 d和治療14 d后，4組的Ⅰ型膠原蛋白含量和創(chuàng)面組織的TGF-β1表達(dá)率比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。見表4。

表3 4組大鼠微血管計(jì)數(shù)CD31細(xì)胞陽性表達(dá)率比較(%,±s)

表3 4組大鼠微血管計(jì)數(shù)CD31細(xì)胞陽性表達(dá)率比較(%,±s)

注：與A組比較，aP＜0.05

組別 動(dòng)物數(shù) 治療前 治療14 d后A組 10 40.28±3.24 82.35±3.28 B組 10 39.75±0.15 69.45±4.75a C組 10 40.42±3.18 67.86±5.12a D組 10 39.92±3.27 59.72±4.35a F值 0.094 44.693 P值 0.963 0.000

3 討論

現(xiàn)階段針對(duì)皮膚軟組織創(chuàng)面的修復(fù)技術(shù)，包括植皮、皮瓣等，存在供皮區(qū)、供瓣區(qū)選擇及局部破壞，移植區(qū)皮片、皮瓣成活情況不穩(wěn)定等局限性。現(xiàn)有皮膚缺損創(chuàng)面外科修復(fù)方案存在一定缺陷，傳統(tǒng)換藥方式治療創(chuàng)面起效慢，恢復(fù)周期長，傷口不易愈合，新技術(shù)修復(fù)效果尚未形成定論[7-9]。為探討治療該皮膚創(chuàng)面的有效治療方案，一些醫(yī)院采用組建大鼠模型的方式對(duì)該疾病的治療展開探討[10]。

干細(xì)胞存在于多種成熟組織中，對(duì)組織創(chuàng)傷有著明顯的修復(fù)作用，將其從脂肪組織中進(jìn)行分離的技術(shù)已有數(shù)十年歷史，近年來已應(yīng)用于臨床中。ADSCs是從脂肪組織中分離而來，為具有多項(xiàng)分化潛能的干細(xì)胞，體外可繼續(xù)穩(wěn)定增殖，死亡率極低，具有良好的自我復(fù)制與多向分化能力，是人體組織器官的重要組成部分。在條件允許情況下，ADSCs可分化為骨細(xì)胞、軟骨細(xì)胞等間質(zhì)類細(xì)胞[11-12]。臨床研究發(fā)現(xiàn)，ADSCs在皮膚創(chuàng)面修復(fù)過程中能夠?yàn)檠艿纳商峁┥L因子，也可促進(jìn)抗凋亡細(xì)胞因子生成，加快創(chuàng)面愈合速度[13-14]。ADSCs還能夠調(diào)節(jié)局部細(xì)胞對(duì)創(chuàng)傷的反應(yīng)，增強(qiáng)組織修復(fù)，促進(jìn)創(chuàng)面愈合。PRP是離心全血后得到的血小板濃縮物，其中富含血小板、血漿和生長因子，各種生長因子間有著良好的協(xié)同作用，可彌補(bǔ)單一生長因子刺激創(chuàng)面修復(fù)不佳的缺點(diǎn)，在促進(jìn)新生血管再生過程中發(fā)揮著重要作用[15]。PRP中含有大量膠原蛋白，可收縮創(chuàng)面，刺激軟組織再生，促進(jìn)傷口早期閉合和防止感染。TGF-β在細(xì)胞增殖、分化和外基質(zhì)分泌中發(fā)揮著重要作用，也可促進(jìn)生物體免疫調(diào)節(jié)、胚胎發(fā)育、血管形成和創(chuàng)傷愈合的重建。同種異體ADSCs聯(lián)合自體PRP可在治療前期提高TGF-β表達(dá)，促進(jìn)創(chuàng)面愈合，治療后期表達(dá)率的下降可使瘢痕組織形成風(fēng)險(xiǎn)下降[16-19]。

表4 4組大鼠Ⅰ型膠原蛋白含量和創(chuàng)面組織的TGF-β1表達(dá)率比較(±s)

表4 4組大鼠Ⅰ型膠原蛋白含量和創(chuàng)面組織的TGF-β1表達(dá)率比較(±s)

Ⅰ型膠原蛋白(μg/L) TGF-β1表達(dá)率(%)組別 動(dòng)物數(shù) 治療前 治療7 d 治療14 d 治療前 治療7 d 治療14 d A 組 10 0.28±0.05 1.21±0.14 2.35±0.42 60.48±2.15 81.62±3.24 61.28±1.54 B 組 10 0.30±0.05 0.85±0.09 1.72±0.35 61.21±2.52 73.58±3.25 63.12±2.32 C 組 10 0.29±0.06 0.81±0.15 1.64±0.28 60.96±2.78 71.60±2.14 63.98±2.84 D 組 10 0.32±0.04 0.56±0.08 1.24±0.16 61.75±2.44 65.25±1.65 64.78±2.58 F值 1.144 50.665 20.931 0.454 72.225 4.015 P值 0.345 0.000 0.000 0.716 0.000 0.015

異體 ADSCs取自多種同類型大鼠，與同體ADSCs比較，其免疫性低，可誘導(dǎo)免疫耐受，在促進(jìn)移植動(dòng)物存活和血管化過程中，不會(huì)引發(fā)明顯的免疫排斥反應(yīng)[20-21]。

聯(lián)合應(yīng)用異體ADSCs和自體PRP可充分發(fā)揮兩者各自的優(yōu)勢(shì)，既利于新生血管再生，也可加快膠原蛋白分泌，提高組織中的Ⅰ型膠原蛋白含量；自體PRP的存在可促進(jìn)異體ADSCs增殖、分化、成脂能力，更好地促進(jìn)創(chuàng)面愈合；但PRP在促進(jìn)創(chuàng)面愈合中的應(yīng)用價(jià)值仍需展開進(jìn)一步深入研究[22-24]。

本研究結(jié)果顯示，4組大鼠接受治療前的創(chuàng)傷面面積比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，4組大鼠治療3 d后、7 d后和14 d后創(chuàng)面面積和創(chuàng)面完全愈合時(shí)間比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；治療后，各組大鼠微血管計(jì)數(shù)CD31細(xì)胞陽性表達(dá)率均明顯上升，A組大鼠微血管計(jì)數(shù)CD31細(xì)胞陽性表達(dá)率明顯高于B、C、D組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；治療7 d和治療14 d后，4組的Ⅰ型膠原蛋白含量和創(chuàng)面組織的 TGF-β1表達(dá)率比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

綜上所述，同種異體ADSCs聯(lián)合自體PRP治療大鼠創(chuàng)面損傷，既可迅速縮減創(chuàng)傷面面積，縮短創(chuàng)面愈合時(shí)間，也在提高創(chuàng)傷大鼠的微血管計(jì)數(shù)CD31細(xì)胞陽性表達(dá)率、Ⅰ型膠原蛋白含量，改善創(chuàng)面組織的TGF-β1表達(dá)率方面發(fā)揮著重要作用，需要更深入的研究，為該技術(shù)在臨床的應(yīng)用中奠定基礎(chǔ)，提高人性皮膚創(chuàng)傷疾病的治療效果。