吸煙、F2RL3基因甲基化與穩(wěn)定性冠狀動脈粥樣硬化性心臟病預(yù)后的關(guān)系

劉訪遙，雷長城，唐娟

（南華大學(xué)附屬第二醫(yī)院 心血管內(nèi)科，湖南 衡陽 421001）

吸煙、F2RL3基因甲基化與穩(wěn)定性冠狀動脈粥樣硬化性心臟病預(yù)后的關(guān)系

劉訪遙，雷長城，唐娟

（南華大學(xué)附屬第二醫(yī)院 心血管內(nèi)科，湖南 衡陽 421001）

目的探討F2RL3基因甲基化與穩(wěn)定性冠狀動脈粥樣硬化性心臟?。ê喎Q冠心病）繼發(fā)心血管事件、死亡率的相關(guān)性，及F2RL3基因甲基化與吸煙導(dǎo)致穩(wěn)定性冠心病患者有害作用的關(guān)系。方法募集南華大學(xué)附屬第二醫(yī)院121例經(jīng)歷過急性冠狀動脈綜合征、心肌梗死或冠狀動脈介入治療后接受心血管康復(fù)計劃的住院患者。隨訪超過8年。F2RL3基因位點甲基化特點采用Sequenom基質(zhì)輔助激光解吸電離時間飛行質(zhì)譜分析。F2RL3基因甲基化、吸煙與繼發(fā)性心血管事件、特因和全因死亡率之間的相關(guān)性由估計混雜因素控制危險比的多變量Cox回歸模型分析。結(jié)果隨訪期間，5例患者發(fā)生非致死性心肌梗死，4例患者發(fā)生非致死性腦卒中，6例患者發(fā)生心血管疾病死亡，5例患者因為其他原因死亡。調(diào)整已知預(yù)后因素后，Cox模型分析顯示F2RL3基因甲基化與死亡率密切相關(guān)。與F2RL3基因甲基化四分位數(shù)最高的穩(wěn)定性冠心病患者相比，四分位最低的患者死于心血管疾病、非心血管疾病或其他任何原因的校正危險比（95%CI）分別為2.32（0.97，5.58）、5.16（1.81，14.7）和3.19（1.64，6.21）。兩組患者繼發(fā)性心血管事件無相關(guān)性。將F2RL3納入回歸模型后，吸煙與所有預(yù)后結(jié)果的相關(guān)性減弱。結(jié)論F2RL3甲基化是吸煙有害影響的潛在介導(dǎo)者，并與穩(wěn)定性冠心病死亡率密切相關(guān)。

穩(wěn)定型冠狀動脈粥樣硬化性心臟??；甲基化；F2RL3

吸煙相關(guān)發(fā)病率和死亡率已成為世界性公共衛(wèi)生系統(tǒng)的關(guān)鍵挑戰(zhàn)[1]?？刂莆鼰熑匀皇侵饕胧?，但許多吸煙者戒煙過程中遇到很大困難[2-3]。這種情況下，對與吸煙相關(guān)疾病的潛在發(fā)病機制進行深入研究和對吸煙潛在影響進行更深入理解，從而制定針對吸煙繼發(fā)性疾病的有效預(yù)防措施具有重要臨床意義。其中一個機制是表觀遺傳修飾，例如基因組DNA序列CpG位點甲基化。

最近有研究表明[4-5]未吸煙者和當(dāng)前吸煙者間甲基化程度和特異性明顯存在差異。尤其是F2RL3基因的CpG位點，其在吸煙者中顯示出低甲基化水平。F2RL3基因編碼蛋白酶活化受體4，參與血液凝固等生理過程，也是潛在的藥物靶點[6-7]。因此，了解F2RL3甲基化的個體差異具有重要臨床意義。

本研究報道檢測了最近發(fā)現(xiàn)的F2RL3基因的CpG位點的甲基化程度與已建立的穩(wěn)定性冠狀動脈粥樣硬化性心臟?。ê喎Q冠心病）高發(fā)人群的心血管標(biāo)志物之間的相關(guān)性。此外，本文旨在確定這一位點的甲基化是否與繼發(fā)性心血管疾病事件和死亡率相關(guān)，并且可能是吸煙導(dǎo)致的有害影響的潛在介導(dǎo)者。

1 資料與方法

1.1 研究對象

本前瞻性隊列研究納入2005～2007年121例由于近期急性心血管事件或心血管手術(shù)（急性冠狀動脈綜合征、心肌梗死或冠狀動脈介入）而接受心血管康復(fù)治療的住院患者，年齡30～70歲。患者接受定期隨訪至2015年12月，生存時間是指納入研究開始至研究結(jié)束或在研究期間因任何原因死亡。

1.2 數(shù)據(jù)和樣品采集

住院康復(fù)開始和結(jié)束時通過標(biāo)準化調(diào)查問卷獲得與健康相關(guān)數(shù)據(jù)。住院康復(fù)階段結(jié)束時，采集空腹血標(biāo)本并對血液進行離心分離，冷卻，并儲存在-80℃冰箱備用檢測。而標(biāo)準常規(guī)臨床參數(shù)（γ谷氨酰轉(zhuǎn)移酶、肌酐、空腹血糖、高密度脂蛋白、總膽固醇和三酰甘油的血清水平）從住院檢查資料獲得?？祻?fù)出院后第1、3、4、5、6和8年，通過電子郵件方式聯(lián)系受試者，非死亡性心腦血管事件（心肌梗死和腦卒中）信息通過標(biāo)準化的問卷調(diào)查獲得。

1.3 甲基化評估

基線時，提取受試者全血DNA。檢測F2RL3基因Cg03636183位點CpG甲基化，研究已經(jīng)證實該位點與吸煙行為相關(guān)，并采用Sequenom基質(zhì)輔助激光解吸電離時間飛行質(zhì)譜檢測。樣品首先使用EZ-96 DNA甲基化金試劑盒進行亞硫酸氫鹽轉(zhuǎn)化。隨后，利用先前特定亞硫酸氫鹽的引物對包含cg03636183擴增子和鄰近6個外加CpG位點進行擴增。堿性磷酸酶（SAP）處理后，用Rnase A進行切割，樹脂清洗，PCR產(chǎn)物片段被轉(zhuǎn)移到384 SpectroCHIPs并與通過美國Sequenom公司質(zhì)譜系統(tǒng)連同SpectroACQUIRE v3.3.1.3和MassARRAY EpiTyper V1.0軟件相結(jié)合進行測定。DNA甲基化的標(biāo)準（0%、20%、40%、60%、80%和100%）被用來作為控PCR擴增偏差的對照。

1.4 統(tǒng)計學(xué)方法

采用SPSS 19.0統(tǒng)計學(xué)軟件處理數(shù)據(jù)，非正態(tài)計量資料以中位數(shù)（Q1～Q3）表示，比較采用秩和檢驗，相關(guān)分析采用Spearman法，Kaplan -Meier法繪制生存曲線，比較采用log-rank檢驗，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義，影響因素的分析采用Cox回歸模型。

2 結(jié)果

2.1 一般結(jié)果

共121例患者納入本次研究，隨訪期間，5例患者發(fā)生非致死性心肌梗死，4例患者發(fā)生致死性卒中，6例患者發(fā)生心血管疾病的死亡，5例患者死于其他原因。受試者重要基線特征見表1。半數(shù)以上的受試者年齡在60歲以上，男性占主導(dǎo)地位。大約70%的受試者目前或曾經(jīng)吸煙。

表1 穩(wěn)定冠心病患者不同影響因素F2RL3甲基化基線情況 （CpG-4）

2.2 F2RL3甲基化程度與心血管危險標(biāo)志物的相關(guān)性

F2RL3基因甲基化程度與年齡呈正相關(guān)，與性別也具有相關(guān)性。高血壓患者表現(xiàn)出較高的甲基化水平。從不吸煙受試者、目前仍然吸煙受試者及心血管急性事件發(fā)生后戒煙受試者的F2RL3基因甲基化水平明顯不同。調(diào)整年齡、性別、吸煙后，持續(xù)心血管疾病風(fēng)險指標(biāo)相關(guān)性發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)2RL3基因甲基化程度與血清白蛋白Spearman相關(guān)系數(shù)＞0.10，與N末端原B-利尿鈉肽、高敏C反應(yīng)蛋白和白細胞介素6 Spearman相關(guān)系數(shù)＜-0.10。見表2。

2.3 F2RL3甲基化程度與患者預(yù)后相關(guān)性

根據(jù)F2RL3甲基化程度四分位數(shù)分層后，Kaplan-Meier曲線分析4組患者生存事件差異（見附圖）。與F2RL3甲基化最低的兩組患者相比，F(xiàn)2RL3甲基化四分位數(shù)最高的兩組患者預(yù)后更好。隨訪期后期，F(xiàn)2RL3甲基化四分位數(shù)最低組患者全因死亡率增加?？刂茲撛诨祀s變量后，各組患者估計危險比見表3。甲基化四分位數(shù)最低組患者全因死亡率風(fēng)險比甲基化四分位數(shù)最高組患者的3倍。調(diào)整F2RL3甲基化后，持續(xù)吸煙者的危害比明顯下降。見表4、5。

表2 F2RL3甲基化程度與血管危險標(biāo)志物的相關(guān)性分析

附圖 4種結(jié)局的生存曲線分析

表3 F2RL3甲基化程度和穩(wěn)定性冠心病患者預(yù)后的Cox回歸模型分析

表4 經(jīng)年齡和性別調(diào)整后，吸煙和和穩(wěn)定性冠心病患者預(yù)后的COX回歸模型分析

表5 經(jīng)年齡、F2RL3甲基化和性別調(diào)整后，吸煙和和穩(wěn)定性冠心病患者預(yù)后的COX回歸模型分析

3 討論

本研究結(jié)果表明穩(wěn)定性冠心病患者F2RL3基因低甲基化程度與死亡率相關(guān)。甲基化水平僅與幾種目前一致心血管風(fēng)險標(biāo)志物相關(guān)，并且與預(yù)后關(guān)聯(lián)性很大程度上獨立于潛在混雜因素。

F2RL3基因甲基化近來發(fā)現(xiàn)與吸煙行為、心血管發(fā)病率和全因死亡率的發(fā)生風(fēng)險有關(guān)，但對于甲基化程度差異的功能效應(yīng)還沒有證據(jù)顯現(xiàn)[8]。鑒于F2RL3基因產(chǎn)物在血小板活化，內(nèi)膜增生和炎癥過程發(fā)揮作用[9]，因此F2RL3基因甲基化與心血管患者預(yù)后相關(guān)并不令人感到意外。這一相關(guān)性類似于其他風(fēng)險預(yù)測標(biāo)志物如炎癥標(biāo)志物和肥胖相關(guān)變量與心血管患者預(yù)后的相關(guān)性，并且還能延伸至非心血管死亡率。非致死性和致死性心血管事件之間的關(guān)聯(lián)性的不同解釋仍然需要進一步探索。

基于單學(xué)科知識，鑒別出獨立、有效且與已知疾病途徑和標(biāo)志物無內(nèi)在聯(lián)系的風(fēng)險預(yù)測物非常困難[10]。近來研究發(fā)現(xiàn)F2RL3甲基化與吸煙相關(guān)。盡管在Cox多元回歸分析中，F(xiàn)2RL3甲基化作為驗證吸煙行為的標(biāo)志物進行調(diào)整，但在本組心血管基本患者中F2RL3甲基化仍然與預(yù)后相關(guān)。除N末端原B-利尿鈉肽和C-反應(yīng)蛋白2種特別建立，且高度變異變量等危險因子外，本組其他危險因素均與患者預(yù)后無相關(guān)性。C反應(yīng)蛋白是F2RL3編碼蛋白酶活化受體4的下游生理分子，小鼠模型中，C反應(yīng)蛋白活化導(dǎo)致炎癥反應(yīng)[11]。人類和動物研究發(fā)現(xiàn)C-反應(yīng)蛋白至少與冠心臟病的因果關(guān)系被排除[12]，F(xiàn)2RL3甲基化改變血小板生物學(xué)和凝血功能的作用更能解釋F2RL3甲基化與心血管疾病死亡的相關(guān)性[13]。

多學(xué)科研究方法探討F2RL3甲基化與心血管疾病死亡的相關(guān)性十分重要。任何情況下，對F2RL3甲基進行校正后，持續(xù)吸煙與各種死亡結(jié)果的相關(guān)性減弱，提示F2RL3甲基化是吸煙有害影響的潛在介導(dǎo)者。無論對何種因果關(guān)系進行考察，F(xiàn)2RL3甲基化都是與吸煙有關(guān)的風(fēng)險預(yù)測標(biāo)志物，臨床結(jié)果顯示，與已驗證的吸煙行為標(biāo)志物相比，F(xiàn)2RL3甲基化表現(xiàn)出更為緊密的相關(guān)性。這可能是由于F2RL3甲基化更接近于病理生理進程，或者是由于F2RL3甲基化能夠準確反映過去和現(xiàn)在的吸煙暴露強度，或者是這2種機制的組合。

總之，本研究結(jié)果支持F2RL3 CpG位點甲基化差異與臨床的相關(guān)性。F2RL3甲基化是吸煙有害影響的潛在介導(dǎo)者，并與穩(wěn)定性冠心病死亡率密切相關(guān)。

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Correlations of smoking andF2RL3gene methylation with prognosis of stable coronary heart disease

Fang-yao Liu, Chang-cheng Lei, Juan Tang
(Department of Cardiology, the Second Aff i liated Hospital, University of South China,Hengyang, Hunan 421001, China)

ObjectiveTo determine whether methylation ofF2RL3gene is associated with secondary cardiovascular events and mortality of stable coronary heart disease and with the harmful effect of smoking.MethodsA total of 121 inpatients participating cardiovascular rehabilitation programmes after experiencing acute coronary syndrome, myocardial infarction or coronary intervention were recruited in our hospital. Active followup was conducted over 8 years. Methylation ofF2RL3gene was characterized by Sequenom matrix-assisted laser desorption ionization time-of-flight mass spectrometry. Associations of methylation ofF2RL3gene and smoking with secondary cardiovascular events, and speci fi c-cause and all-cause mortality were examined by multiple Cox’s regression model through estimating confounder-controlled hazard ratios.ResultsDuring the follow-up, 5 patients suffered from non-fatal myocardial infarction, 4 had non-fatal strokes, 6 died of cardiovascular diseases, and 5 died due to other causes. After controlling established prognostic factors, Cox’s regression analysis revealedF2RL3methylation was closely associated with mortality. Adjusted hazard ratios (95% CI) for death from cardiovascular, non-cardiovascular, and any other cause were 2.32 (0.97, 5.58), 5.16 (1.81, 14.7), and 3.19 (1.64, 6.21) in the subjects with the lowest quartile of methylation ofF2RL3gene in comparison to those with the highest quartile.There was no association between the secondary cardiovascular event outcomes of the two groups. The strong associations of smoking with all outcomes were markedly weakened whenF2RL3was included in the regression models.ConclusionsThe results seem to indicate methylation ofF2RL3is a potential mediator of the detrimental impact of smoking and is strongly related to mortality of patients with stable coronary heart disease.

stable coronary heart disease; epigenetic methylation;F2RL3

10.3969/j.issn.1005-8982.2018.01.018

1005-8982（2018）01-0092-07

2017-03-20

R541.4

A

（張西倩 編輯）