白藜蘆醇阻斷信號(hào)通路對(duì)鼻咽癌細(xì)胞生長的影響

熊赪，易陽艷

（1.江西省南昌市第一醫(yī)院 耳鼻喉科，江西 南昌 330000；2.南昌大學(xué)第二附屬醫(yī)院 整形美容科，江西 南昌 330000）

核孔復(fù)合物細(xì)胞（human nuclear pore complex cells，NPC）是一種惡性上皮性腫瘤，具有獨(dú)特的種族和地域分布特性[1]。東南亞、中國南部地區(qū)、中東和北非為NPC的高發(fā)區(qū)，年發(fā)病率20.0～50.0例/100 000人；在歐洲和美國，NPC的年發(fā)病率大約為0.5～2.0例/100 000人，男性的發(fā)病率高于女性。全世界每年有大約80 000例新確診的NPC患者，大約50 000例患者因其死亡[2]。白藜蘆醇所具有的多種生理特性對(duì)人體有益，而且白藜蘆醇對(duì)某些類型的腫瘤細(xì)胞具有抗腫瘤作用，但是白藜蘆醇對(duì)NPC生長的影響及其相關(guān)的分子機(jī)制仍不太明了[3]。探討天然產(chǎn)物中的有效成分——白藜蘆醇在NPC中的作用，不僅有助于了解白藜蘆醇在預(yù)防惡性腫瘤中的作用，而且還可用于治療NPC。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞株

高分化的人NPC細(xì)胞株CNE-1（湖北民族學(xué)院附屬民大醫(yī)院保存）；低分化的人NPC細(xì)胞株CNE-2Z（湖北民族學(xué)院附屬民大醫(yī)院保存）。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)CNE-1和CNE-2細(xì)胞株保存在5%二氧化碳CO2，37℃條件下，用含10%小牛血清、100 u/ml青霉素、100 μg/ml鏈霉素的RPMI 1640培養(yǎng)液傳代培養(yǎng)，實(shí)驗(yàn)用細(xì)胞均處于對(duì)數(shù)生長期。在細(xì)胞培養(yǎng)過程中分別用 0、10、25、50、100及200 μmol/L的白藜蘆醇磷酸鹽緩沖液處理CNE-1細(xì)胞和CNE-2細(xì)胞，分別于24和48 h收集細(xì)胞。

1.2.2 細(xì)胞增殖抑制實(shí)驗(yàn)（MTT實(shí)驗(yàn)）取上述培養(yǎng)的對(duì)數(shù)生長期細(xì)胞按每孔5×103于180 μl培養(yǎng)液中接種于96孔板過夜，加入不同濃度的白藜蘆醇，每組設(shè)8個(gè)平行孔。用藥后分別培養(yǎng)24、48及72 h，每孔加入20 μl噻唑藍(lán)（MTT）（5 mg/ml），繼續(xù)培養(yǎng)4 h。移去培養(yǎng)液，每孔加100 μl DMSO溶解，待完全溶解后于酶標(biāo)免疫測定儀測定其吸光度（A）值，測定波長為570 nm，參考波長為450 nm。重復(fù)3次。計(jì)算細(xì)胞增殖抑制率及IC50值，繪制濃度-抑制率曲線。

1.2.3 流式細(xì)胞儀檢測用流式細(xì)胞儀檢測白藜蘆醇誘導(dǎo)NPC細(xì)胞凋亡情況和NPC細(xì)胞周期分布變化。分別收集對(duì)照以及各種濃度白藜蘆醇處理24 h的細(xì)胞，加預(yù)冷70%乙醇固定過夜。次日完全去除乙醇后，將細(xì)胞重懸于40 μl磷酸-枸櫞酸緩沖液中，用50 μg/ml PI（含 100 μg/ml RNaseA，無 DNase）0.5 ml，4℃避光染色30 min，于流式細(xì)胞儀檢測凋亡率。每組均設(shè)3個(gè)復(fù)管，并重復(fù)3次。

1.2.4 白藜蘆醇對(duì)人NPC細(xì)胞生長的影響為了進(jìn)一步驗(yàn)證白藜蘆醇對(duì)NPC的抗腫瘤作用，在裸鼠體內(nèi)做CN2Z細(xì)胞異體移植瘤實(shí)驗(yàn)，并檢測對(duì)照組（10%DMSO處理組）和白藜蘆醇（20 mg/kg，注射1次）處理組裸鼠體內(nèi)的異種移植瘤體積大小。

用遞增濃度（0、10、25、50及100 μmol/L）的白藜蘆醇作用CNE-2Z細(xì)胞24 h后，再用Western blot技術(shù)檢測與細(xì)胞周期調(diào)控有關(guān)的數(shù)種cyclins（cyclin A、B、D及E和CDK/p34蛋白）的蛋白表達(dá)水平。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

數(shù)據(jù)分析采用SPSS 20.0統(tǒng)計(jì)軟件，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，預(yù)先行方差齊性檢驗(yàn)，如方差齊時(shí)采用LSD-t檢驗(yàn)，如方差不齊時(shí)采用Tamhane's T2檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 白藜蘆醇對(duì)人NPC細(xì)胞凋亡、增殖的影響

以0 μmol/L白藜蘆醇組為陰性對(duì)照，濃度為200 μmol/L白藜蘆醇組為陽性對(duì)照組。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，CNE-1細(xì)胞增殖中不同濃度白藜蘆醇比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=13.872，P=0.000），與陰性對(duì)照比較，當(dāng)白藜蘆醇濃度為50、100及200 μmol/L時(shí)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；CNE-2Z細(xì)胞增殖中不同濃度白藜蘆醇相比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=23.547，P=0.000）， 當(dāng) 白 藜 蘆 醇 濃 度 為 25、50、100及200 μmol/L時(shí)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。當(dāng)用白藜蘆醇處理24或48 h后，兩種具有不同分化程度NPC細(xì)胞株的增殖能力均具有隨著白藜蘆醇濃度的增加而降低的趨勢。用相同濃度的白藜蘆醇處理兩種具有不同分化程度的NPC細(xì)胞，隨著白藜蘆醇作用時(shí)間的延長（從24～48 h），對(duì)NPC細(xì)胞增殖的抑制作用均越加明顯（見圖1）。

與同型對(duì)照組及空白對(duì)照組（0 μmol/L白藜蘆醇處理組）比較，隨著白藜蘆醇劑量的增加，白藜蘆醇處理組CNE-2Z細(xì)胞的AnnexinV-FITC單陽性百分率也隨之增高（見圖2）。各組間比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=21.092，P=0.000）。其中0 μmol/L白藜蘆醇處理組中Annexin V-FITC單陽性CNE-2Z細(xì)胞的百分率為（0.2±0.1）%；10 μmol/L白藜蘆醇處理組中Annexin V-FITC單陽性CNE-2Z細(xì)胞的百分率為（6.4±0.3）%；25 μmol/L白藜蘆醇處理組中Annexin V-FITC單陽性CNE-2Z細(xì)胞的百分率為（11.3±0.9）%；50 μmol/L白藜蘆醇處理組中Annexin V-FITC單陽性CNE-2Z細(xì)胞的百分率為（16.7±2.1）%；100 μmol/L白藜蘆醇處理組中Annexin V-FITC單陽性CNE-2Z細(xì)胞的百分率為（41.3±5.6）%。同時(shí)也觀察0 μmol/L白藜蘆醇處理組中PI單陽性CNE-2Z細(xì)胞的百分率為（0.5±0.1）%；10 μmol/L白藜蘆醇處理組中PI單陽性CNE-2Z細(xì)胞的百分率為（3.4±0.2）%；25 μmol/L白藜蘆醇處理組中PI單陽性CNE-2Z細(xì)胞的百分率為（4.3±0.5）%；50 μmol/L白藜蘆醇處理組中PI單陽性CNE-2Z細(xì)胞的百分率為（4.7±0.9）%；100 μmol/L白藜蘆醇處理組中PI單陽性CNE-2Z細(xì)胞的百分率為（1.2±0.3%）。

2.2 白藜蘆醇對(duì)人NPC細(xì)胞細(xì)胞周期的影響

3組細(xì)胞周期比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=15.936，P=0.000），且50 μmol/L白藜蘆醇組與對(duì)照組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。與對(duì)照組比較，用10 μmol/L白藜蘆醇處理后，CNE-1細(xì)胞組的細(xì)胞周期分布未顯示變化；然而用50 μmol/L白藜蘆醇處理后，CNE-1細(xì)胞組G1-期細(xì)胞的百分率有降低，從（72.5±9.4）% 降到（39.1±8.6）%（P＜0.01），S-期細(xì)胞的百分率有升高，從（10.1±3.3）%升高到（39.8±7.2）%，（P＜0.01），但G2/M-期細(xì)胞的百分率無改變。見圖3。

圖1 白藜蘆醇抑制NPC細(xì)胞的增殖

圖2 流式細(xì)胞儀分析的代表性直方圖

研究發(fā)現(xiàn)，不同濃度的白藜蘆醇均能抑制CNE-2Z細(xì)胞中的Cyclin A、B、D、E以及CDK/p34蛋白的表達(dá)水平，白藜蘆醇對(duì)其抑制能力具有較強(qiáng)的濃度依賴性。與對(duì)照組比較，50和100 μmol/L白藜蘆醇處理可抑制該蛋白的表達(dá)。見圖4。

2.3 白藜蘆醇對(duì)人NPC細(xì)胞生長的影響

在使用白藜蘆醇處理的第12和15天，白藜蘆醇處理組裸鼠體內(nèi)的異種移植瘤體積與對(duì)照組比較，有減小，異種移植瘤大小分別從（570.9±43.6）mm3降到（326.3±41.6）mm3，從（682.5±38.4）mm3降到（418.6±53.1）mm3，各組間比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=32.964，P=0.000）。隨著白藜蘆醇處理時(shí)間的延長，白藜蘆醇對(duì)裸鼠體內(nèi)異種移植瘤體積大小的抑制作用愈加明顯，通過與對(duì)照組比較，發(fā)現(xiàn)在白藜蘆醇處理的第18和21天，異種移植瘤大小持續(xù)降低，異種移植瘤體積分別從（785.9±59.2）mm3降到（443.5±58.9）mm3，從（824.4±59.5）mm3降到（496.6±62.4）mm3，各組間比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=41.218，P=0.000）。該數(shù)據(jù)表明，白藜蘆醇可降低裸鼠體內(nèi)異種移植瘤體積的大小，且白藜蘆醇對(duì)裸鼠體內(nèi)異種移植瘤體積大小的影響具有時(shí)間依賴性。見圖5、6。

裸鼠體內(nèi)取出的異種移植瘤的分析。HE染色結(jié)果顯示，在對(duì)照組的切片中，可以看到較多的細(xì)胞成分，且細(xì)胞核較大、細(xì)胞大小較不均一、細(xì)胞排列比較紊亂。與對(duì)照組相比較，白藜蘆醇治療后的腫瘤組織內(nèi)細(xì)胞成分減少，而具有更多的膠原結(jié)構(gòu)，細(xì)胞大小比較均一且細(xì)胞排列比較整齊有序。見圖7。

圖3 白藜蘆醇對(duì)人CNE-1細(xì)胞的細(xì)胞周期進(jìn)程的影響

圖4 白藜蘆醇對(duì)CNE-2Z細(xì)胞中與細(xì)胞周期進(jìn)程相關(guān)基因的蛋白表達(dá)水平的影響

圖5 白藜蘆處理3周后，腫瘤生長具有代表性的圖片

圖6 白藜蘆醇對(duì)裸鼠中NPC 移植瘤的影響

圖7 裸鼠體內(nèi)異體移植瘤切片 （HE×400）

3 討論

白藜蘆醇是存在于多種食用、藥用植物中的一種多酚類化合物，近年發(fā)現(xiàn)白藜蘆醇有抗癌活性，對(duì)癌的起始、促進(jìn)和發(fā)展3個(gè)階段均起作用[4]。在對(duì)其抗癌機(jī)制的研究中發(fā)現(xiàn)，白藜蘆醇可通過誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡來抑制其增殖，從而達(dá)到抗癌目的，目前對(duì)白藜蘆醇的抗癌作用研究也有大量的報(bào)道[5]。高倩等[6]發(fā)現(xiàn)，白藜蘆醇可劑量和時(shí)間依賴性地抑制肝細(xì)胞瘤細(xì)胞株H22生長增殖，其IC50值為6.75 mg/L，用普通顯微鏡和電子顯微鏡觀察均發(fā)現(xiàn)藥物處理組出現(xiàn)典型凋亡小體，因而白藜蘆醇可經(jīng)凋亡途徑抑制H22細(xì)胞生長增殖。WITTE等用白藜蘆醇處理人前列腺癌細(xì)胞株DU145通過核小體含量檢測證實(shí)有凋亡發(fā)生[7]。

本研究中通過對(duì)白藜蘆醇阻斷信號(hào)通路對(duì)鼻咽癌細(xì)胞生長的影響，結(jié)果與文獻(xiàn)報(bào)道基本一致，顯示白藜蘆醇對(duì)鼻咽癌細(xì)胞的生長有抑制作用[8-9]。在對(duì)白藜蘆醇對(duì)人NPC細(xì)胞凋亡、增殖影響的體外研究時(shí)，當(dāng)用白藜蘆醇處理24或48 h后，兩種具有不同分化程度的NPC細(xì)胞株的增殖能力均具有隨著白藜蘆醇濃度的增加而降低。用相同濃度的白藜蘆醇處理兩種具有不同分化程度的NPC細(xì)胞后，隨著白藜蘆醇作用時(shí)間的延長（從24～48 h），其對(duì)兩種NPC細(xì)胞增殖的抑制作用越加明顯[10-11]。在白藜蘆醇對(duì)人NPC細(xì)胞細(xì)胞周期影響的體外研究中顯示，白藜蘆醇對(duì)人NPC細(xì)胞的細(xì)胞周期進(jìn)程的影響，并揭示出可能通過下調(diào)各種Cyclins和CDKs的表達(dá)而影響NPC細(xì)胞周期進(jìn)程[12]。本研究還證實(shí)，白藜蘆醇可降低裸鼠體內(nèi)異種移植瘤體積的大小，且白藜蘆醇對(duì)裸鼠體內(nèi)異種移植瘤體積大小的影響具有時(shí)間依賴性[13]。

綜上所述：①白藜蘆醇不僅以時(shí)間和劑量依賴的方式降低NPC細(xì)胞的增殖，還可的方式增加NPC細(xì)胞的凋亡；②體外研究結(jié)果表明，白藜蘆醇可能是通過干擾Akt/p70S6K信號(hào)通路而發(fā)揮有效的抗增殖和促凋亡作用；③裸鼠CNE-2Z細(xì)胞異種移植瘤模型的研究結(jié)果表明，白藜蘆醇可抑制NPC移植瘤的生長；④白藜蘆醇有望成為防治人NPC的有效藥物。

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