斑馬魚(yú)定向篩選在水體化學(xué)風(fēng)險(xiǎn)因子鑒別中的應(yīng)用

王 申 楊方星

(浙江大學(xué)環(huán)境與資源學(xué)院環(huán)境健康研究所, 杭州 310058)

水資源是我們生活的重要組成部分, 工業(yè)、農(nóng)業(yè)以及人們的日常生活都離不開(kāi)水。隨著社會(huì)的發(fā)展和人類(lèi)活動(dòng)的加劇, 地球上的水資源受到了不同程度的污染。影響水體安全的因素可以分為物理因素、化學(xué)因素、生物因素。而化學(xué)因素是研究的熱點(diǎn)內(nèi)容。當(dāng)大量人工合成的化學(xué)物質(zhì)進(jìn)入水體時(shí), 就會(huì)對(duì)水生生物和人類(lèi)的健康產(chǎn)生潛在的威脅[1—7]。據(jù)報(bào)道, 水體污染可以造成魚(yú)類(lèi)甲狀腺干擾效應(yīng)[8], 也會(huì)導(dǎo)致兒童神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育缺陷[1]。

水體的不安全表現(xiàn)為水體對(duì)生物的毒性效應(yīng),而這些毒性效應(yīng)是由水體中存在的風(fēng)險(xiǎn)因子產(chǎn)生的, 保障水體安全, 就是要控制其毒性效應(yīng), 本質(zhì)上就是要控制產(chǎn)生這些毒性效應(yīng)的風(fēng)險(xiǎn)因子。通過(guò)以往的研究, 人們已經(jīng)鑒別出了水體中許多具有毒性效應(yīng)的化合物, 并建立了受監(jiān)控化合物庫(kù)(就是我們通常說(shuō)的各種標(biāo)準(zhǔn)里的監(jiān)測(cè)指標(biāo)), 以此來(lái)評(píng)價(jià)水體的安全性。但是, 僅僅監(jiān)測(cè)這些受監(jiān)控的化合物并不能夠全面地指示水體的安全, 而且常常忽略可能造成風(fēng)險(xiǎn)的潛在物質(zhì)。隨著技術(shù)手段的發(fā)展, 人們能夠檢測(cè)的化合物數(shù)量越來(lái)越多, 濃度也越來(lái)越低, 也發(fā)現(xiàn)了在現(xiàn)有受監(jiān)控化合物庫(kù)之外的一些化合物具有毒性效應(yīng), 能夠影響水體安全。因此, 這些物質(zhì)也逐漸被加入到受監(jiān)控的化合物名單中。隨著監(jiān)控化合物名單變的越來(lái)越大, 分析成本也越來(lái)越高。因此為了全面地反映水體健康風(fēng)險(xiǎn)的真實(shí)情況, 更好的方法是在毒性實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上,對(duì)水體中的化合物進(jìn)行全譜檢測(cè), 盡可能多地篩選水體中的風(fēng)險(xiǎn)因子, 來(lái)指示水的安全。目前全譜檢測(cè)主要的實(shí)現(xiàn)途徑就是基于高分辨質(zhì)譜對(duì)樣品中的已知化合物進(jìn)行定向篩選(Target screening), 對(duì)樣品中的未知化合物進(jìn)行非定向篩選(Non-target screening)[9]。高通量定向篩選是預(yù)先設(shè)定想要研究的大量化合物, 然后探究樣品中是否存在這些化合物, 而非定向篩選是在沒(méi)有預(yù)先設(shè)定化合物的基礎(chǔ)上, 基于儀器得到的譜圖來(lái)推斷樣品中可能存在的化合物[10,11]。非定向篩選由于其缺少化合物的信息, 鑒定物質(zhì)是相對(duì)來(lái)說(shuō)較為困難。

斑馬魚(yú)(Zebrafish,Danio rerio)是毒性研究中常用的一種模式生物。它對(duì)水質(zhì)和食物的要求不高,在25—31℃發(fā)育正常。斑馬魚(yú)因其具有遺傳背景清晰, 體型小, 易于飼養(yǎng)和管理, 發(fā)育速度快, 生殖周期短, 繁殖能力強(qiáng), 胚胎發(fā)育快, 胚胎的透光性好等優(yōu)勢(shì), 被國(guó)際經(jīng)濟(jì)合作組織(Organization for Economic Co-operation and Development, OECD)列為測(cè)試的推薦實(shí)驗(yàn)物種, 在環(huán)境毒理學(xué)中被廣泛應(yīng)用于神經(jīng)毒性[12]、生殖毒性[13]、內(nèi)分泌干擾作用[8,14]等研究。

在本研究中, 我們采集了我國(guó)東部某醫(yī)藥產(chǎn)業(yè)基地河流的水體樣品, 在斑馬魚(yú)暴露測(cè)試的基礎(chǔ)上,利用高通量定向篩選方法對(duì)水樣進(jìn)行分析, 鑒別樣品中的主要化學(xué)因子及其與斑馬魚(yú)暴露實(shí)驗(yàn)的相關(guān)性, 以此揭示影響該河流中水體安全的主要化學(xué)風(fēng)險(xiǎn)因子。

1 材料與方法

1.1 樣品采集

本研究選擇的河流位于我國(guó)東部某省, 該河流所在區(qū)域是當(dāng)?shù)刂匾尼t(yī)藥產(chǎn)業(yè)基地。從上游至下游分別設(shè)置了7個(gè)采樣點(diǎn), 分別代表了源頭(采樣點(diǎn)1)、農(nóng)業(yè)源支流(采樣點(diǎn)2)、農(nóng)業(yè)源匯流(采樣點(diǎn)3)、工業(yè)區(qū)下游(采樣點(diǎn)4)、工業(yè)區(qū)匯流(采樣點(diǎn)5)、生活區(qū)下游(采樣點(diǎn)6)、入河口(采樣點(diǎn)7, 該河流在此匯入另一條較大河流)。具體采樣點(diǎn)地址如圖 1所示。水樣的采集參照GB 12998-91中地表水采樣技術(shù)指導(dǎo)。每個(gè)采樣點(diǎn)取適量河水, 存放在4 L的樣品瓶中, 利用冰袋轉(zhuǎn)移至實(shí)驗(yàn)室并4℃保存,使用時(shí)將其恢復(fù)至室溫。

1.2 斑馬魚(yú)暴露實(shí)驗(yàn)

模式生物培養(yǎng)斑馬魚(yú)購(gòu)自當(dāng)?shù)鼗B(niǎo)市場(chǎng),約4月齡。在暴露實(shí)驗(yàn)前, 斑馬魚(yú)飼養(yǎng)在恒溫(26±1)℃且恒光照(光照: 黑暗為14h:10h)的魚(yú)房中,在除氯水中馴化5d, 每天喂食豐年蟲(chóng)1次, 并及時(shí)清理食物殘?jiān)图S便。

暴露實(shí)驗(yàn)實(shí)驗(yàn)設(shè)置暴露組和對(duì)照組, 對(duì)照組用除氯水, 暴露組分別為7個(gè)采樣點(diǎn)的河水。每組12條斑馬魚(yú), 暴露在2 L的大燒杯中。暴露時(shí)間為8d, 暴露期間, 每天喂食1次, 每2d更換裝置內(nèi)一半的水, 對(duì)照組補(bǔ)充除氯水, 暴露組添加相應(yīng)的河水。

1.3 高通量定向篩選

標(biāo)準(zhǔn)化合物的配制選取生產(chǎn)生活中常用的醫(yī)藥、農(nóng)藥、獸藥、食品添加劑、表面活性劑、工業(yè)原料等248種標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)作為定向篩選的物質(zhì), 其中藥物包括米氮平(Mirtazapine)、氯氮平(Clozapine)、氧氟沙星(Ofloxacin)等; 農(nóng)藥包括苯銹啶(Fenpropidin)、丁苯嗎啉(Fenpropimorph)、阿特拉津(Atrazine)、異丙甲草胺(Metolachlor)等; 獸藥包括恩諾沙星(Enrofloxacin); 食品添加劑包括抑霉唑(Imazalil)、安賽蜜(Acesulfame)等; 表面活性劑包括月桂酰胺丙基甜菜堿(Lauramidopropyl betaine)等; 工業(yè)原料包括對(duì)甲苯酰磷酸酯(Tri-p-cresyl phosphate)等。具體成分如附表 1所示。先將各標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)用純甲醇配制成質(zhì)量濃度為1 mg/mL的混標(biāo)溶液(各標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的濃度均為1 mg/mL), 然后將混標(biāo)溶液用甲醇稀釋成100 ng/mL的工作溶液, 利用UPLC/ESI-Q-TOF-MS對(duì)該標(biāo)樣進(jìn)行分析, 建立定向篩選的分析列表。

水樣的準(zhǔn)備將水樣過(guò)0.2 μm的水相膜, 進(jìn)入U(xiǎn)PLC/ESI-Q-TOF-MS進(jìn)行分析。

儀器分析條件樣品的分析使用超高效液相色譜-四級(jí)桿-飛行時(shí)間串聯(lián)質(zhì)譜(UPLC/ESI-QTOF-MS, AB Sciex 5600+, 美國(guó))。液相分離色譜柱為ACQUITY UPLC HSS T3, 2.1 mm×150 mm×1.8 μm,柱溫為25℃。進(jìn)樣量為10 μL。色譜分離采用水/甲醇(A: 水, B: 甲醇, 均含0.1%甲酸)二元溶劑洗脫, 洗脫梯度為: 0 90%A, 4min 90%A, 26min 0A, 50min 0A, 51min 90%A, 52min 90%A。流速0.2 mL/min。質(zhì)譜掃描范圍100—1500 amu, ESI正離子模式, 離子源電壓5.5 kv, 離子源溫度600℃。

圖1 各采樣點(diǎn)圖Fig. 1 Map of sampling sites

2 結(jié)果與討論

2.1 斑馬魚(yú)暴露測(cè)試

可以看出, 經(jīng)過(guò)8d的暴露, 各個(gè)取水點(diǎn)的斑馬魚(yú)均有不同程度的死亡情況(表 1), 而對(duì)照組卻全部存活?？偟膩?lái)說(shuō), 下游死亡率較上游高。

表1 斑馬魚(yú)暴露測(cè)試死亡率Tab. 1 Death rates of zebrafish exposed to the river water

2.2 高通量定向篩選列表的建立

首先在軟件中建立含有248種物質(zhì)名稱(chēng)和化學(xué)式的初始列表, 得到符合一級(jí)質(zhì)譜圖的物質(zhì)列表,然后打開(kāi)一種物質(zhì)的色譜圖, 選中該保留時(shí)間下的色譜峰, 觀(guān)察有無(wú)合理的同位素峰分布以及相應(yīng)的[M+H+]+峰, 再打開(kāi)該物質(zhì)的二級(jí)質(zhì)譜圖, 與結(jié)構(gòu)式圖進(jìn)行匹配, 記錄下每種物質(zhì)的匹配率。以異丙甲草胺為例, 過(guò)程如圖 2所示。異丙甲草胺帶一個(gè)單位正電荷的準(zhǔn)分子離子峰的質(zhì)荷比為284.14118, 而儀器在23.165min時(shí)檢測(cè)到一個(gè)質(zhì)荷比為284.14146(相對(duì)質(zhì)量誤差為1 ppm, 即百萬(wàn)分之一)的質(zhì)譜峰(圖 2a)。再打開(kāi)保留時(shí)間為23.165min時(shí)的一級(jí)質(zhì)譜圖, 可以觀(guān)察到明顯的[M+H+]+峰及其相應(yīng)的同位素峰, 還有[M+Na+]+峰及其相應(yīng)的同位素峰。然后打開(kāi)該離子峰的二級(jí)質(zhì)譜圖, 并在chemicalbook網(wǎng)站上查找異丙甲草胺的結(jié)構(gòu)式圖, 在軟件中將二者進(jìn)行關(guān)聯(lián)后, 軟件會(huì)計(jì)算出該結(jié)構(gòu)式可能產(chǎn)生的碎片離子, 并與二級(jí)質(zhì)譜產(chǎn)生的峰相匹配, 結(jié)果顯示匹配率為100%, 具體匹配結(jié)果如圖 2c所示。

將混標(biāo)溶液用甲醇配制成濃度梯度為100、50、10、5、1、0.5和0.1 ng/mL的標(biāo)準(zhǔn)溶液系列,在相同條件下進(jìn)行檢測(cè), 計(jì)算出其標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)方程。在物質(zhì)鑒定完畢后, 記錄每種物質(zhì)的保留時(shí)間, 即得到定向篩選的分析列表。各物質(zhì)在其濃度范圍內(nèi)線(xiàn)性相應(yīng)較好(絕大部分R2＞0.9, 個(gè)別幾種化合物0.85 ＜R2＜ 0.9), 可以用于精確定量。

2.3 水樣的定向篩選

首先打開(kāi)一個(gè)樣品數(shù)據(jù), 然后打開(kāi)建立的定向篩選列表, 軟件會(huì)按照列表中物質(zhì)的一級(jí)離子質(zhì)荷比和相應(yīng)的保留時(shí)間進(jìn)行篩選, 保留MS誤差在10 ppm以?xún)?nèi)的物質(zhì), 然后進(jìn)行同位素峰以及二級(jí)離子驗(yàn)證, 并根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)計(jì)算物質(zhì)的濃度水平。以阿奇霉素為例, 鑒定過(guò)程如圖 3所示。阿奇霉素(Azithromycin)標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)形成的準(zhǔn)分子離子質(zhì)荷比為749.5158, 保留時(shí)間為15.77min (圖 3a), 而軟件在15.79min處檢測(cè)到一個(gè)質(zhì)荷比剛好為的749.5158的離子峰(圖 3b)。該離子峰可能為阿奇霉素形成的準(zhǔn)分子離子峰。然后觀(guān)察到質(zhì)荷比為749.5158的離子峰存在明顯的同位素峰, 其[M+H+]+峰也存在明顯的同位素峰(圖 3c)。接著打開(kāi)該離子峰下的二級(jí)質(zhì)譜圖, 并在chemicalbook網(wǎng)站上查找該物質(zhì)的結(jié)構(gòu)式圖, 在軟件中將二者進(jìn)行關(guān)聯(lián)后, 結(jié)果顯示二級(jí)質(zhì)譜的匹配率為100%, 具體匹配結(jié)果如圖 3d。

各采樣點(diǎn)檢測(cè)到的物質(zhì)及濃度如表 2所示。在該河流中共鑒別出24種化合物, 但各采樣點(diǎn)檢出的化合物數(shù)量并不一致, 采樣點(diǎn)1—7分別檢出24、24、24、21、21、21和20種化合物。檢出的化合物以藥物為主, 其中包含了17種藥物, 如米氮平、地氯雷他定等。這可能是由于當(dāng)?shù)赜性S多醫(yī)藥企業(yè), 藥物組分通過(guò)污水排放、大氣沉降等各種途徑進(jìn)入河流后殘留在水體中。此外, 檢出化合物的濃度從上游到下游基本呈現(xiàn)出減小的趨勢(shì),可能是由于該河流在向下游流動(dòng)的過(guò)程中, 有多個(gè)小支流匯入, 導(dǎo)致徑流量增大, 從而起到了一定的稀釋作用。

2.4 水體風(fēng)險(xiǎn)因子鑒別

將各個(gè)水樣中所檢出的24種化合物的濃度與暴露實(shí)驗(yàn)中斑馬魚(yú)的死亡率分別進(jìn)行關(guān)聯(lián), 并用origin軟件進(jìn)行線(xiàn)性擬合, 記錄其線(xiàn)性方程y=a+bx中的斜率b, 相關(guān)系數(shù)R2以及顯著性分析P(表 3)。

在定向篩選中鑒定出來(lái)的24個(gè)化合物的濃度與斑馬魚(yú)死亡率均不呈正相關(guān), 因此我們認(rèn)為, 河水中檢出的化合物可能不是造成斑馬魚(yú)死亡的主要原因。此外, 由于缺乏檢出化合物對(duì)斑馬魚(yú)的毒性數(shù)據(jù), 無(wú)法定量評(píng)價(jià)檢出化合物對(duì)斑馬魚(yú)死亡的毒性貢獻(xiàn)。

3 總結(jié)

我國(guó)東部某醫(yī)藥產(chǎn)業(yè)基地河流水樣對(duì)斑馬魚(yú)進(jìn)行暴露實(shí)驗(yàn)后, 斑馬魚(yú)出現(xiàn)有不同程度的死亡。高通量定向篩選鑒定出了水樣中以藥物成分為主的24種化合物, 但這些化合物的濃度水平無(wú)法完全解釋斑馬魚(yú)暴露實(shí)驗(yàn)的結(jié)果。因此, 我們推斷, 鑒定出的藥物組成不是該河流水體健康風(fēng)險(xiǎn)的主要因子。

本研究主要考慮水體中極性有機(jī)污染物對(duì)斑馬魚(yú)的毒性效應(yīng), 并未考慮水體的理化參數(shù), 比如溶解氧等以及其他無(wú)機(jī)污染物, 如重金屬等的毒性貢獻(xiàn)。在接下來(lái)的研究中, 可以考慮對(duì)水樣的理化參數(shù)以及水樣中的金屬離子含量進(jìn)行檢測(cè),也可以利用非定向分析對(duì)樣品中的化合物進(jìn)行解析, 以進(jìn)一步揭示該河流中造成斑馬魚(yú)死亡的主要毒性因素。

圖2 混合標(biāo)樣中異丙甲草胺的鑒定Fig. 2 Identification of metolachlor in standard mixture

圖3 水樣中阿奇霉素的鑒定Fig. 3 Identification of azithromycin in water sample

表2 水體樣品中鑒定出的化合物Tab. 2 Compounds identified in the river water

表3 水樣中檢出的24種化合物濃度與斑馬魚(yú)死亡率的相關(guān)性Tab. 3 The relationship between the concentrations of all compounds detected in the water samples with the death rates of zebrafish in the exposure experiment

續(xù)表 3

附表 1 定向篩選化合物Attached Tab. 1 Compounds involving target screening

續(xù)附表1

續(xù)附表1