微量MIC法和羅氏比例法對結(jié)核分枝桿菌藥敏檢測比對及一致性觀察分析

王 慧，齊 鵬，劉 昕，馬瑩聰，朱琳瑩

(吉林省疾病預(yù)防控制中心，吉林 長春130000)

結(jié)核病是由于感染結(jié)合分枝桿菌而引發(fā)的慢性傳染病，治療方法為都藥物聯(lián)合短程化療，近年來，抗結(jié)核藥物耐藥性結(jié)核分支桿菌出現(xiàn)，且鋼釩傳播，使得控制結(jié)核病存在一定難度。當前，全球結(jié)核疫情控制的一個最大障礙為結(jié)耐藥結(jié)核病。有關(guān)研究數(shù)據(jù)表明[1]，廣泛耐藥結(jié)核病具有傳染期常、痰菌轉(zhuǎn)陰慢等特點，其診斷與治療過程較為復(fù)雜，所需治療費用較高，且具有較多不良反應(yīng)[2]。本文將以200株結(jié)核分枝桿菌菌株為對象，探究微量液體培養(yǎng)基最低抑菌濃度(微量MIC法)和羅氏比例法對結(jié)核分枝桿菌藥敏檢測情況。

1 資料與方法

1.1 一般資料

本研究涉及對象為結(jié)核分枝桿菌菌株200株，研究時間為2018年1月-2018年12月，所有菌株均經(jīng)結(jié)核藥物抗敏性熟練度測試，由國家結(jié)核病實驗室提供。

1.2 方法

1.2.1設(shè)備：固體培養(yǎng)基，微量MIC商品化微孔板。

1.2.2藥敏試驗方法：(1)微量MIC法:使用羅氏培養(yǎng)結(jié)核分枝桿菌菌株2-3周，應(yīng)用無菌生理鹽水(濃度為0.5%)進行溶解與稀釋，取標準麥氏比濁管進行比濁，制作為1 mg/ml菌懸液，并吸取0.2 ml菌懸液，添加至培養(yǎng)液內(nèi)，在充分混合以后，作為工作菌液。使用無菌吸管將工作菌液吸出0.5 ml，并在各個孔板中滴入，蓋上蓋子，將藥敏板在自封袋中放入，調(diào)整溫度為37℃進行孵育，在6天以后對質(zhì)控孔進行觀察，若質(zhì)控孔有白色顆粒沉淀出現(xiàn)，添加顯色劑A與顯色劑B ，分別12 μl與25μl，調(diào)整溫度為37℃進行孵育1-2天。藥敏板中藥物終濃度如表1所示。(2)羅氏比例法：使用接種環(huán)取新鮮菌落(1-2周)，放入磨菌瓶中，添加生理鹽水，經(jīng)過震蕩與靜置以后，取上部菌液，并和麥氏比濁管進行比濁，制作為1 mg/ml的菌懸液，經(jīng)過100倍稀釋，直至10-2mg/ml，隨后再稀釋，直至10-4mg/ml，獲得兩種濃度工作菌液，使用22SWG標準接種環(huán)選取不同濃度工作菌液接種，直至含藥培養(yǎng)基的斜面。藥敏板中藥物終濃度如表1所示。

表1 藥物終濃度(μg/ml)

1.2.3結(jié)果判定：(1)微量MIC法：調(diào)整溫度為36℃進行孵育，添加顯色劑A與顯色劑B，在培養(yǎng)1-2天以后，質(zhì)控孔為紅色，與其他藥敏孔相比，藍色則為敏感，紅色則為耐藥。若H孔為紅色，L孔為藍色，則需要重復(fù)試驗。(2)羅氏比例法：調(diào)整溫度為36℃時，在4周以后，計算耐藥的百分比，若為1%以上即為耐藥，高度稀釋度的空白對照培養(yǎng)基的菌落低于20個，需要重復(fù)試驗。

1.3 統(tǒng)計學方法

本研究應(yīng)用SAS統(tǒng)計學軟件，以羅氏比例法作為金標準，檢測結(jié)果一致性使用Kappa檢驗方法，若Kappa值超過0.75，表示兩種方法一致性良好；若Kappa在0.4-0.75之間，表示兩種方法存在一般的一致性；若Kappa值低于0.4，表示具有不佳的一致性。

2 結(jié)果

2.1 兩種方法耐藥性分析

微量MIC法的異煙肼、利福平、乙胺丁醇、二卡那霉素、氧氟沙星、卷曲霉素藥物耐藥性檢出率與羅氏比例法相比，組間差異呈P>0.05，具有可比性。如表2。

表2 兩種方法耐藥性分析(n/n%)

2.2 兩組檢驗方法相比結(jié)果分析

以羅氏比例法作為金標準，在異煙肼、利福平、二卡那霉素耐藥性檢出具有較高的特異度與靈敏度，且兩種檢驗方法一致性良好；卷曲霉素的靈敏度較低，且兩種檢驗方法一致性不佳。如表3。

表3 兩組檢驗方法相比結(jié)果分析

3 討論

耐藥結(jié)核病發(fā)生與流程成為防治結(jié)核病工作領(lǐng)域關(guān)注焦點與難點。當前，全球結(jié)核病發(fā)病率逐漸增高，且抗結(jié)核藥物大量使用[3]，這就使得耐多藥菌株不但擴散，被視為結(jié)核病控制的重大問題，特別是亞洲發(fā)展中國家。因此，快速、準確的抗結(jié)核藥物藥敏試驗可有效篩查出廣泛耐藥結(jié)核病，并確定廣泛耐藥結(jié)核病，有助于預(yù)防進一步加重耐藥性，為疾病的治療提供參考依據(jù)[4]。

本次研究中，運用微量MIC法對結(jié)核菌株異煙肼、利福平、乙胺丁醇、二卡那霉素、氧氟沙星、卷曲霉素等藥物敏感性進行試驗，結(jié)果可見，以羅氏比例法作為金標準，在異煙肼、利福平、二卡那霉素耐藥性檢出具有較高的特異度與靈敏度，且兩種檢驗方法一致性良好；卷曲霉素的靈敏度較低，且兩種檢驗方法一致性不佳。其中特異度多為85%以上，靈敏度部分也高達90%。其中CMP一致性較差的原因可能為商品化微孔板中藥物濃度值較低[5]。本次研究結(jié)果顯示，微量MIC法的異煙肼、利福平、乙胺丁醇、二卡那霉素、氧氟沙星、卷曲霉素藥物耐藥性檢出率與羅氏比例法相比，組間差異呈P>0.05，具有可比性。與吳昌琴學者研究結(jié)果保持一致，均證實了微量MIC法應(yīng)用于結(jié)核分歧桿菌的藥敏檢測中具有重要意義。由此可見，微量MIC法、比例法在結(jié)核分枝桿菌的藥敏檢測中，除了CPM以外，均具有良好一致性，對結(jié)合患者的藥敏試驗提供廉價、快速有效的方法。

綜上所述，微量MIC法與羅氏比例法均可用于結(jié)核分枝桿菌的藥敏檢驗中，在異煙肼、利福平、乙胺丁醇、二卡那霉素、氧氟沙星的藥敏檢驗具有較高的一致性，而卷曲霉素一致性不佳。