非洲豬瘟病毒p10蛋白和p49蛋白的生物信息學(xué)分析及表位預(yù)測(cè)

摘要：運(yùn)用多種生物信息技術(shù)對(duì)非洲豬瘟病毒（ASFV）Georgia 2007/1株p10蛋白和p49蛋白的理化性質(zhì)、二級(jí)及三級(jí)空間結(jié)構(gòu)、抗原性、抗原決定簇進(jìn)行初步分析，并預(yù)測(cè)其B、T淋巴細(xì)胞優(yōu)勢(shì)表位。結(jié)果表明，p10是親水性蛋白，含有2個(gè)抗原決定簇，該蛋白α-螺旋、β-轉(zhuǎn)角、無(wú)規(guī)則卷曲和延伸鏈的比例為32.05%、11.54%、52.56%和3.85%；p49同樣是親水性蛋白，含有17個(gè)抗原決定簇，其α-螺旋、β-轉(zhuǎn)角、無(wú)規(guī)則卷曲和延伸鏈的比例依次為29.91%、7.53%、55.94%和6.62%。基于以上分析，p10不適合用于ASF疫苗制備的候選蛋白；而p49作為親水性衣殼蛋白，具有一定免疫原性，有望成為疫苗研制的備選蛋白，為ASFV蛋白研究和疫苗研發(fā)提供一定參考。

關(guān)鍵詞：非洲豬瘟；生物信息學(xué)；表位預(yù)測(cè)

中圖分類號(hào)：S855.3 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

文章編號(hào)：1002-1302（2024）15-0195-08

收稿日期：2023-09-05

基金項(xiàng)目：國(guó)家自然科學(xué)基金（編號(hào)：32002292），河南省重大科技專項(xiàng)（編號(hào)：221100110600）。

作者簡(jiǎn)介：孫卓雅（1999—），女，碩士研究生，研究方向?yàn)榉肿用庖吆蛠唵挝灰呙绲?，E-mail：792474123@qq.com；共同第一作者：王夢(mèng)翔（1998—），男，碩士研究生，研究方向?yàn)閬唵挝灰呙绾偷鞍踪|(zhì)譜分析等，E-mail：1834768483@qq.com。

通信作者：吳亞楠，博士，副教授，研究方向?yàn)閯?dòng)物免疫分子的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)及功能解析，E-mail：wlyananjiayou@yeah.net；張改平，中國(guó)工程院院士，博士，教授，研究方向?yàn)閯?dòng)物病毒分子致病機(jī)制和食品安全檢測(cè)，E-mail：zhanggaip@126.com。

非洲豬瘟（African swine fever，ASF）是由非洲豬瘟病毒（African swine fever virus，ASFV）感染豬而引起的一種急性接觸性、廣泛出血性、烈性傳染病，各年齡段的豬均易感。ASF的臨診癥狀很難和豬瘟區(qū)別，根據(jù)毒力和感染途徑不同ASF可表現(xiàn)為最急性型（強(qiáng)毒株）、急性型（中等毒力毒株）、亞急性型和慢性型（弱毒株）；死亡率分別為100%、90%～100%、30%～70%和<30%。有研究測(cè)算，2018年8月至2019年7月中國(guó)非洲豬瘟疫情總經(jīng)濟(jì)損失約占2019年中國(guó)GDP的0.78%，ASF疫情不僅直接沖擊養(yǎng)豬業(yè)，且通過(guò)產(chǎn)業(yè)關(guān)聯(lián)，幾乎波及到所有經(jīng)濟(jì)部門［1］，對(duì)我國(guó)經(jīng)濟(jì)危害極大。

ASFV基因組大小為170～190 kb，編碼超過(guò)200種蛋白質(zhì)，其中，超過(guò)50種為結(jié)構(gòu)蛋白，其中，p10蛋白是由K78R基因編碼的一個(gè)親核結(jié)構(gòu)蛋白，位于ASFV最內(nèi)側(cè)的擬核內(nèi)，具有核定位信號(hào)。已有研究表明，p10能與單鏈或雙鏈DNA結(jié)合，推測(cè)其可能在含DNA類核的組裝中發(fā)揮作用。同時(shí)，有體外試驗(yàn)證明當(dāng)ASFV感染細(xì)胞時(shí)，p10在宿主細(xì)胞核中聚集，即p10具有穿過(guò)核孔的能力［2］。p49蛋白是由B438L編碼的衣殼蛋白，在感染后晚期表達(dá)，是病毒粒子感染必需結(jié)構(gòu)蛋白，當(dāng)缺乏p49時(shí)病毒所形成的病毒顆粒雖具有管狀結(jié)構(gòu)，但二十面體對(duì)稱性喪失，通過(guò)免疫電鏡對(duì)完整的病毒體或病毒顆粒進(jìn)行觀察，發(fā)現(xiàn)p49位于衣殼頂點(diǎn)附近，表明該蛋白在構(gòu)建或穩(wěn)定病毒顆粒二十面體頂點(diǎn)過(guò)程中起重要作用［3］。鑒于上述重要性，有必要對(duì)此2種蛋白的結(jié)構(gòu)和功能進(jìn)行解析，但目前國(guó)內(nèi)外對(duì)ASFV蛋白和抗原表位的研究主要集中在p30［4］、p72［5］、p54［6］、CD2v［7］、K205R［8］等，對(duì)p10蛋白和p49蛋白的相關(guān)研究較少。本研究選擇了2種研究相對(duì)較少但功能很重要的結(jié)構(gòu)蛋白p10和p49作為分析對(duì)象，通過(guò)氨基酸序列比對(duì)發(fā)現(xiàn)，由圖1、圖2可知，p10和p49在不同毒株中均十分保守，按照我國(guó)流行病學(xué)中心的相關(guān)監(jiān)測(cè)，目前國(guó)內(nèi)流行的非洲豬瘟病毒屬基因Ⅱ型，所以選擇了同源性約為99.95% Georgia 2007/1株（GenBank No.MK128995）［9］。傳統(tǒng)抗原表位篩選工作量大、成本費(fèi)用高，生物信息學(xué)技術(shù)可很好地避免這些問(wèn)題，并已被廣泛使用。本研究利用生物信息學(xué)技術(shù)對(duì)p10和p49蛋白進(jìn)行了相關(guān)分析并預(yù)測(cè)了優(yōu)勢(shì)表位，以期為此2種蛋白結(jié)構(gòu)與功能的深入研究、ASFV相關(guān)診斷及疫苗產(chǎn)品的研制奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

從NCBI蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫(kù)（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/）中檢索Georgia/2007株p10和p49蛋白的氨基酸序列。

1.2 方法

1.2.1 理化性質(zhì)分析

ProtParam tool（https：//web.expasy.org/protparam/）用于蛋白質(zhì)的物理化學(xué)性質(zhì)分析，包括：氨基酸數(shù)量、氨基酸組成、原子組成、分子式、分子量、理論等電點(diǎn)、消光系數(shù)、估計(jì)半衰期、不穩(wěn)定性指數(shù)、脂肪族指數(shù)和親水性均值等。蛋白質(zhì)的不穩(wěn)定性指數(shù)間接表明了蛋白質(zhì)的穩(wěn)定性，如果計(jì)算得到的蛋白質(zhì)不穩(wěn)定指數(shù)<40，則認(rèn)為是穩(wěn)定蛋白，>40則認(rèn)為是不穩(wěn)定蛋白。

使用Expasy（https：//web.expasy.org/protscale/）中的protscale工具預(yù)測(cè)p10和p49的親水性［10］。

1.2.2 二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)

使用SOPMA（https：//npsa-prabi.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl？page=npsa%20_sopma.html）［11］和DNASTAR軟件預(yù)測(cè)p10和p49蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)［12］。

1.2.3 三級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)

使用Phyre 2服務(wù)器（http：//www.sbg.bio.ic.ac.uk/phyre2/html/page.cgi？id=index）［13］預(yù)測(cè)p10和p49蛋白的三級(jí)結(jié)構(gòu)，該服務(wù)器通過(guò)使用多模板建模和簡(jiǎn)化的從頭折疊模擬生成蛋白質(zhì)序列的全長(zhǎng)3D模型。

1.2.4 抗原性分析

為分析p10和p49蛋白的潛在抗原性，本試驗(yàn)使用在線預(yù)測(cè)服務(wù)器VaxiJen v2.0（http：//www.ddg-pharmfac.net/vaxijen/VaxiJen/VaxiJen.html）來(lái)預(yù)測(cè)蛋白的抗原性［14］。根據(jù)服務(wù)器應(yīng)用參數(shù)的標(biāo)識(shí)，對(duì)抗原保護(hù)性預(yù)測(cè)結(jié)果≥0.4為可能潛在的保護(hù)性抗原（病毒模式的閾值為0.4）。

1.2.5 抗原決定簇預(yù)測(cè)

使用Predicting antigenic peptides（http：//imed.med.ucm.es/Tools/antigenic.pl）預(yù)測(cè)p10和p49蛋白潛在的抗原決定簇［13］。

1.2.6 優(yōu)勢(shì)B細(xì)胞線性表位的預(yù)測(cè)

利用ABCpred（https：//webs.iiitd.edu.in/raghava/abcpred/ABC_submission.html）服務(wù)器來(lái)預(yù)測(cè)p10和p49蛋白的B細(xì)胞線性表位。ABCpred服務(wù)器基于人工神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)（ANN）［15］進(jìn)行預(yù)測(cè)，本研究將2種蛋白的氨基酸序列提交到服務(wù)器，從得分>0.5的多肽序列中，挑選出具有免疫原性的候選表位。

1.2.7 細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞（CTL）表位的預(yù)測(cè) CTL表位需要經(jīng)抗原呈遞細(xì)胞處理，與MHC Ⅰ類

分子結(jié)合后才能遞呈給T細(xì)胞進(jìn)行識(shí)別［16］。使用NetMHCpan4.1（https：//services.healthtech.dtu.dk/services/NetMHCpan-4.1/）服務(wù)器預(yù)測(cè)多肽與MHCⅠ類分子之間的結(jié)合能力。根據(jù)綜合評(píng)分和蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)，篩選出p10和p49蛋白中可能結(jié)合特定MHC-Ⅰ類分子的多肽序列［17］。

1.2.8 輔助性T淋巴細(xì)胞（HTL）表位的預(yù)測(cè)

使用NetMHCpan 4.1服務(wù)器預(yù)測(cè)能與MHC-Ⅱ類分子結(jié)合的多肽表位，根據(jù)抗原表位的%Rank_EL分?jǐn)?shù)及干擾素-γ（IFN-γ）的釋放來(lái)選擇多肽序列，其中%Rank_EL預(yù)測(cè)結(jié)合評(píng)分的等級(jí)［18］。

2 結(jié)果與分析

2.1 理化性質(zhì)分析

由ProtParam軟件分析結(jié)果（表1）可知，p10共有78個(gè)氨基酸，分子量為8.43 ku，理論等電點(diǎn)為10.98，共有3個(gè)帶負(fù)電的殘基，18個(gè)帶正電的殘基。蛋白由1 195個(gè)原子組成，化學(xué)成分為 C354H608N116O113S4。計(jì)算的不穩(wěn)定系數(shù)為53.66，表明該蛋白為不穩(wěn)定蛋白。體外半衰期預(yù)測(cè)為30 h，在體內(nèi)、酵母和大腸桿菌的半衰期預(yù)測(cè)分別大于 20 h 和 10 h。蛋白的脂肪指數(shù)為43.85，蛋白結(jié)構(gòu)的親水性平均系數(shù)為-1.086。由Expasy中protscale工具預(yù)測(cè)結(jié)果（圖3）可知，該蛋白具有親水性。

由表2可知，p49蛋白共有438個(gè)氨基酸，分子量為49.4 ku，理論等電點(diǎn)為9.22，共有39個(gè)帶負(fù)電殘基，51個(gè)帶正電殘基。蛋白由6 889個(gè)原子組成，化學(xué)成分為C2 193H3 402N620O663S11。計(jì)算的不穩(wěn)定系數(shù)為54.25，表明該蛋白為不穩(wěn)定蛋白。體外半衰期預(yù)測(cè)為30 h，在體內(nèi)、酵母和大腸桿菌的半衰期預(yù)測(cè)分別大于20 h和10 h。蛋白的脂肪指數(shù)為69.47，蛋白結(jié)構(gòu)的親水性平均系數(shù)為-0.749。由Expasy中protscale工具預(yù)測(cè)結(jié)果（圖4）可知，該結(jié)構(gòu)具有親水性。

2.2 p10和p49蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)

由圖5可知，SOPMA分析蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)，p10蛋白中25個(gè)氨基酸組成α-螺旋，占總氨基酸的32.05%，3個(gè)氨基酸構(gòu)成延長(zhǎng)鏈，占總氨基酸的3.85%，9個(gè)氨基酸構(gòu)成β-轉(zhuǎn)角，占總氨基酸的

11.54%，41個(gè)氨基酸構(gòu)成無(wú)規(guī)則卷曲，占總氨基酸的52.56%。由圖6可知，p49蛋白中131個(gè)氨基酸組成α-螺旋，占總氨基酸的29.91%，29個(gè)氨基酸構(gòu)成延長(zhǎng)鏈，占總氨基酸的6.62%，33個(gè)氨基酸構(gòu)成β-轉(zhuǎn)角，占總氨基酸的7.53%，245個(gè)氨基酸構(gòu)成無(wú)規(guī)則卷曲，占總氨基酸的55.94%。

DNASTAR分析使用了Gramier-Robson、Chou-Fasman、Kyte-Doolittle、Eisenberg、Karplus-Schulz、Jameson-wolf和Emini方法預(yù)測(cè)結(jié)果。由圖7可知，p10蛋白的β-折疊分布在第3～9、16～19、20～26、27～32、33～37、49～52、55～58、60～62、68～74位氨基酸片段，無(wú)規(guī)則卷曲在第5～37、52～55、60～76位氨基酸片段。由圖8可知，p49蛋白的β-折疊分布在第6～18、32～42、72～78、163～172、179～194、235～250、342～352、390～405、418～427位氨基酸片段，無(wú)規(guī)則卷曲在第15～30、51～63、87～100、128～133、138～173、179～203、240～260、267～280、320～326、356～367、373～382、387～410和415～427位氨基酸片段。

2.3 p10和p49蛋白三級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)

通過(guò)Phyre 2預(yù)測(cè)，由圖9、圖10可知p10和p49的三級(jí)結(jié)構(gòu)。

2.4 p10和p49蛋白的抗原性分析

VaxiJenV預(yù)測(cè)p10蛋白的抗原指數(shù)為0.323 9，閾值為0.4，說(shuō)明p10蛋白抗原性不強(qiáng)；p49的抗原指數(shù)為0.452 4，指示p49蛋白有一定的抗原性。

2.5 p10和p49抗原決定簇預(yù)測(cè)

Predicting antigenic peptides預(yù)測(cè)結(jié)果顯示，p10蛋白的平均抗原傾向是0.972 6，具有較好的抗原性，具有2個(gè)抗原決定簇，所在區(qū)域分別位于第 44～50、52～61位氨基酸；p49蛋白的平均抗原傾向是1.019 7，具有良好的抗原性，具有17個(gè)抗原決定簇，分別位于第4～12、45～51、62～68、90～96、121～127、132～139、143～156、174～183、205～230、238～246、249～255、258～271、287～331、338～348、350～359、407～414、426～434位氨基酸。

2.6 p10和p49蛋白優(yōu)勢(shì)B淋巴細(xì)胞表位預(yù)測(cè)

線性B細(xì)胞表位的預(yù)測(cè)是基于ABCpred服務(wù)器，此服務(wù)器鑒定的B細(xì)胞表位預(yù)測(cè)值范圍為 0.51～1.00 多肽序列的分值越高 其是B細(xì)胞抗

原決定簇的可能性越大，預(yù)測(cè)結(jié)果顯示，p10蛋白B細(xì)胞抗原表位共有6個(gè)，分別為第2～19、52～67、38～53、46～61、29～44、20～35、61～76、11～26位氨基酸；p49蛋白有26個(gè)，分別為第41～56、273～288、19～34、415～430、397～412、355～350、231～246、252～267、206～221位氨基酸等。根據(jù)抗原決定簇位點(diǎn)的預(yù)測(cè)結(jié)果和二級(jí)結(jié)構(gòu)β-轉(zhuǎn)角和無(wú)規(guī)卷曲為參考，由表3可知優(yōu)勢(shì)B淋巴細(xì)胞表位。

2.7 p10和p49蛋白優(yōu)勢(shì)細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞（CTL）表位的預(yù)測(cè)

T細(xì)胞表位是由NetMHCpan 4.1服務(wù)器進(jìn)行預(yù)測(cè)，結(jié)果綜合評(píng)分及抗原決定簇位點(diǎn)預(yù)測(cè)結(jié)果和蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)的β-螺旋和無(wú)規(guī)卷曲，篩選出優(yōu)勢(shì)CTL細(xì)胞表位。由表4可知，共得到p10有3條優(yōu)勢(shì)表位，p49有5條優(yōu)勢(shì)表位。

2.8 p10和p49蛋白的輔助性T淋巴細(xì)胞（HTL）表位的預(yù)測(cè)

HTL（13位氨基酸）表位則是先由NetMHCpan 4.1服務(wù)器預(yù)測(cè)，初步得到序列，然后將這些序列輸入至IFNepitope服務(wù)器中，最終選出IFN-γ陽(yáng)性誘導(dǎo)的序列。由表5可知，共得到3條p10優(yōu)勢(shì)表位，6條p49優(yōu)勢(shì)表位。

3 討論與結(jié)論

自2018年8月我國(guó)首次出現(xiàn)ASF以來(lái)，疫情快速蔓延至內(nèi)陸各省份。鑒于我國(guó)野豬和軟蜱的分布廣泛，更易形成ASF的自然疫源地［19］；加之目前我國(guó)的生豬養(yǎng)殖方式多樣化、養(yǎng)殖密度高、從業(yè)人員生物安全意識(shí)淡薄，導(dǎo)致我國(guó)ASF防控形勢(shì)十分嚴(yán)峻［20］。由于ASFV的復(fù)雜性，且目前對(duì)于ASFV與宿主相互作用的研究還存在一定局限性，所以疫苗的研發(fā)仍處于初始階段。當(dāng)前，防控和根除ASF的方法僅限于早期診斷、檢疫和消滅疫點(diǎn)疫區(qū)內(nèi)易感動(dòng)物，因此對(duì)高效、安全且可廣泛使用的疫苗需求非常急迫。所以深入了解ASFV的生命周期，預(yù)測(cè)各個(gè)蛋白的結(jié)構(gòu)，將會(huì)增加疫苗開(kāi)發(fā)的成功率，有助于有效預(yù)防ASFV的感染。本研究通過(guò)在線工具預(yù)測(cè)蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)且篩選出優(yōu)勢(shì)B細(xì)胞抗原表位和優(yōu)勢(shì)T細(xì)胞抗原表位，可用作靶向藥物、表位疫苗研制的篩選對(duì)象［21］。有學(xué)者運(yùn)用生物信息學(xué)方法，設(shè)計(jì)出了一種可治療牛結(jié)節(jié)疹的亞單位疫苗［22］；俱雄等通過(guò)生物信息學(xué)軟件對(duì)大腸桿菌外膜蛋白OmpC進(jìn)行結(jié)構(gòu)和表位分析，重組拼接獲得OmpC蛋白表位多肽［23］，這些研究均表明生物信息學(xué)目前已廣泛運(yùn)用于各種表位疫苗的設(shè)計(jì)。

本研究運(yùn)用多種生物信息學(xué)方法，對(duì)Georgia 2007/1株p10蛋白和p49蛋白的理化性質(zhì)、二級(jí)結(jié)構(gòu)、三級(jí)結(jié)構(gòu)、抗原性、抗原表位進(jìn)行預(yù)測(cè)。預(yù)測(cè)發(fā)現(xiàn)，p10蛋白為親水不穩(wěn)定蛋白，含有2個(gè)抗原決定簇，預(yù)測(cè)出的抗原指數(shù)為0.323 9，閾值為0.4，說(shuō)明p10的抗原性不強(qiáng)，氨基酸中占比重較多的是無(wú)規(guī)卷曲和α-螺旋；p49蛋白的預(yù)測(cè)結(jié)果為親水不穩(wěn)定蛋白，含有17個(gè)抗原決定簇，預(yù)測(cè)出的抗原指數(shù)為0.452 4，說(shuō)明p49蛋白具有一定的抗原性，二級(jí)結(jié)構(gòu)中占總氨基酸比重較多的是β-轉(zhuǎn)角和無(wú)規(guī)則卷曲。β-轉(zhuǎn)角和無(wú)規(guī)則卷曲能夠突出于蛋白的表面，表面可及性較強(qiáng)，容易形成抗原表位［11］，以上說(shuō)明p49蛋白具有免疫原性，且極有可能存在潛在優(yōu)勢(shì)抗原表位，可以作為ASFV疫苗研發(fā)的候選蛋白。

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