王紅穎,劉博文,王慶國(guó),馬玉榮,劉 佩
(山東農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院/山東省高校食品加工技術(shù)與質(zhì)量控制重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,山東泰安271018)
鮮切馬鈴薯因新鮮、方便、衛(wèi)生、營(yíng)養(yǎng)等特點(diǎn),廣受消費(fèi)者喜愛(ài)。目前,國(guó)內(nèi)鮮切產(chǎn)品主要以市場(chǎng)消費(fèi)量較大的馬鈴薯絲、薯塊、薯?xiàng)l、薯片等為主。隨著馬鈴薯主糧化政策的推動(dòng)以及居民消費(fèi)方式的轉(zhuǎn)變,鮮切馬鈴薯行業(yè)將會(huì)有長(zhǎng)足發(fā)展;但鮮切馬鈴薯在加工及后期貯藏過(guò)程中極易褐變,褐變很大程度上影響了鮮切馬鈴薯的商品質(zhì)量,縮短其貨架期[1]。控制鮮切馬鈴薯褐變的方法主要包括氣調(diào)、真空包裝、熱水處理等物理措施[2-4],以及化學(xué)抑制劑包括檸檬酸、抗壞血酸、氯化鈣和氨基酸等外源浸泡處理[5-8]。然而鮮切馬鈴薯真空包裝容易產(chǎn)生異味,熱處理溫度過(guò)高、時(shí)間過(guò)長(zhǎng)等均會(huì)造成鮮切馬鈴薯熱損傷[3-4];而化學(xué)試劑因直接接觸馬玲薯絲,產(chǎn)品安全性以及對(duì)產(chǎn)品風(fēng)味的影響往往限制了其廣泛應(yīng)用[9]。因此,尋找安全有效的褐變控制技術(shù)是當(dāng)前鮮切馬鈴薯技術(shù)開(kāi)發(fā)及研究的重點(diǎn)。
酚類底物的酶促氧化是鮮切馬鈴薯褐變的主要原因[10],多酚氧化酶(polyphenol oxidase,PPO)是催化酚類酶促氧化最主要的酶[11],而苯丙氨酸解氨酶(phenylal aninammonialyase,PAL)是酚類化合物合成中的關(guān)鍵酶。熱激處理、1-MCP 處理、γ-射線處理等褐變抑制方法,主要是通過(guò)抑制PPO、PAL 酶活性,抑制鮮切荸薺、馬鈴薯及冬瓜褐變[12-14]。果蔬在鮮切加工過(guò)程中,細(xì)胞膜遭受傷害而損傷,細(xì)胞組織結(jié)構(gòu)受到破壞,局部O2濃度提高,PPO活性上升,引起酶促褐變加強(qiáng)[15-16]。茉莉酸甲酯、硫化氫及熱水處理顯著提高了蓮藕、馬鈴薯及蘋果等果蔬抗氧化酶活性而抑制其鮮切褐變[17-19];抗氧化酶活性的上升往往有利于保護(hù)質(zhì)膜免受氧化損傷、穩(wěn)定細(xì)胞膜完整性,進(jìn)而有利于維持酚類底物及酶的區(qū)隔化分布,顯著降低酚類的酶促褐變[20-21]。
植株受到局部損傷后,傷害刺激信號(hào)會(huì)通過(guò)脫落酸、水楊酸、H2O2、茉莉酸等信號(hào)分子將應(yīng)激信號(hào)從局部傳至整個(gè)植物,最終引發(fā)植物體一系列防御物質(zhì)的代謝及防御酶活性的改變,而防御酶包括超氧化物歧化 酶 (superoxide dismutase,SOD)、過(guò)氧化氫酶(catalase,CAT)和過(guò)氧化物酶(peroxidase,POD)等酶活性的上升可誘導(dǎo)植物產(chǎn)生抗性,進(jìn)而增強(qiáng)植物生長(zhǎng)過(guò)程中抵御傷害、逆境等生物脅迫的能力[22-25]。本研究在鮮切加工前對(duì)馬鈴薯進(jìn)行適當(dāng)?shù)膫幚恚噲D激活馬鈴薯塊莖自身的防御體系,通過(guò)提高其抗氧化防御能力,進(jìn)而抑制鮮切引發(fā)的褐變。
筆者希望通過(guò)研究傷處理方式及放置時(shí)間、溫度對(duì)鮮切馬鈴薯褐變的影響,開(kāi)發(fā)安全有效的褐變控制技術(shù),并通過(guò)對(duì)PPO、PAL、總酚及抗氧化相關(guān)指標(biāo)的測(cè)定,進(jìn)一步探討傷處理對(duì)鮮切馬鈴薯褐變抑制的機(jī)理。
實(shí)驗(yàn)所用‘荷蘭15號(hào)’馬鈴薯于2015年6月采收,購(gòu)于萊蕪市楊莊鎮(zhèn)聚富食品有限公司,運(yùn)回山東農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院冷庫(kù)(2~4℃)貯藏。挑選大小一致(200 g 左右,長(zhǎng)度12~14 cm)、形狀均勻、無(wú)病蟲害、無(wú)機(jī)械損傷、無(wú)發(fā)芽綠變的馬鈴薯作為實(shí)驗(yàn)材料。
ML204天平(1/10000),瑞士梅特勒-托利多公司生產(chǎn);S220 pH 計(jì),瑞士梅特勒-托利多公司生產(chǎn);Allegra 64R 高速冷凍離心機(jī),美國(guó) Вeckman 公司;T6 新世紀(jì)紫外分光光度計(jì),北京普析通用儀器有限責(zé)任公司生產(chǎn);恒溫水浴鍋,常州國(guó)華電器有限公司生產(chǎn);CR-400色差計(jì),柯尼卡美能達(dá)公司生產(chǎn);恒溫箱,濟(jì)南科達(dá)爾有限公司生產(chǎn);微型冷庫(kù),濟(jì)南科達(dá)爾實(shí)業(yè)有限公司。
1.3.1 傷處理 馬鈴薯經(jīng)20℃回溫10 h 后進(jìn)行傷處理。第1組采用切傷方式,在馬鈴薯塊莖兩端用切菜刀(刀面110 mm×170 mm)切下1~1.5 cm 厚的薯塊。第2 組采用刮傷方式,在馬鈴薯兩端用刮皮刀刮掉厚約0.5 mm 的表皮。將傷處理后的馬鈴薯于20℃放置18 h,然后進(jìn)行鮮切。每組處理設(shè)3 個(gè)重復(fù),每個(gè)重復(fù)10個(gè)馬鈴薯。對(duì)照組不做傷處理,其他操作相同。
1.3.2 馬鈴薯鮮切加工流程 將傷處理后的馬鈴薯清洗后,用2 mL/L 的次氯酸鈉溶液消毒5 min,然后削皮、切成3~5 mm厚的馬鈴薯片。馬鈴薯片用0.5 mL/L的次氯酸鈉溶液消毒30 s 后用干凈紗布吸干表面水分,裝入聚乙烯袋中(尺寸為175 mm×250 mm,厚度為0.04 mm)并折疊袋口。裝袋時(shí)每袋裝12片(約200 g),每個(gè)重復(fù)9袋,放入2~4℃冷庫(kù)中貯藏。分別在鮮切后0、2、4、6、8天進(jìn)行褐變程度評(píng)定。
1.3.3 傷處理后最佳放置條件篩選 用上述刮傷方式進(jìn)行馬鈴薯傷處理,然后分別在5、20℃下放置12、18、36 h。每組處理設(shè)3個(gè)重復(fù),每個(gè)重復(fù)10個(gè)馬鈴薯。對(duì)照組不做傷處理,其他操作相同。處理結(jié)束后按照馬鈴薯鮮切加工流程進(jìn)行鮮切處理。分別在0、2、4、6、8天進(jìn)行褐變程度評(píng)定。
1.3.4 鮮切馬鈴薯感官評(píng)定及表面顏色測(cè)定
(1)鮮切馬鈴薯感官評(píng)定標(biāo)準(zhǔn)。每組處理鮮切馬鈴薯由8人按照表1~2的評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)[26]進(jìn)行評(píng)定。
(2)鮮切馬鈴薯表面顏色的測(cè)定。采用CIE L*法測(cè)定鮮切馬鈴薯的表面顏色[26]。色差計(jì)(CR-400,Minolta Co., Osaka)使用前用標(biāo)準(zhǔn)白板(L*=97.06,a*=0.04,b*=2.01)校準(zhǔn)。分別在切片后第0、1、3、5、7 天測(cè)定馬鈴薯切片粗糙表面的色差。測(cè)定時(shí),每個(gè)處理3個(gè)平行,每個(gè)平行取8片馬鈴薯片。
表1 鮮切馬鈴薯褐變程度評(píng)定標(biāo)準(zhǔn)
表2 鮮切馬鈴薯感官評(píng)定標(biāo)準(zhǔn)
1.3.5 PPO、PAL及總酚含量測(cè)定
(1)PPO活性測(cè)定。稱取1 g馬鈴薯樣品和0.05 g聚乙烯吡咯烷酮(PVPP),加入3 mL 0.1 mmol/L磷酸緩沖溶液(pH 6.86),勻漿后4℃、10000 r/min 離心15 min得到粗酶液。PPO活性參考鄰苯二酚法測(cè)定[27]。
(2)PAL 活性的測(cè)定。稱取1 g 馬鈴薯樣品和0.05 g PVPP,加入4 mL 0.1 mmol/L 硼酸緩沖溶液(pH 8.5),勻漿后 4℃、10000 r/min 離心 15 min 得到粗酶液。PAL活性參照苯丙氨酸比色法測(cè)定[28]。
(3)總酚含量測(cè)定。稱取1 g 馬鈴薯樣品,加入4 mL 70%的丙酮,勻漿;避光條件下,浸提3 h 后4℃、10000 r/min 離心15 min 得到待測(cè)上清液??偡雍康臏y(cè)定參考福林酚法測(cè)定[29]。
1.3.6 抗氧化酶活性測(cè)定
(1)POD 活性的測(cè)定。稱取1 g 馬鈴薯樣品和0.05 g PVPP,加入5 mL 0.1 mmol/L 磷酸緩沖溶液(pH 6.0),勻漿后 4℃、10000 r/min 離心 15 min 得到待測(cè)上清液。POD活性測(cè)定參照愈創(chuàng)木酚法測(cè)定[27]。
(2)SOD 活性的測(cè)定。稱取1 g 馬鈴薯樣品和0.05 g PVPP,加入5 mL 0.1 mmol/L 磷酸緩沖溶液(pH 7.8),勻漿后 4℃、10000 r/min 離心 15 min 得到待測(cè)液。SOD活性參照光還原法測(cè)定[30]。
1.3.7 DPPH自由基清除率和MDA含量測(cè)定 稱取1 g馬鈴薯樣品,加入4 mL 95%乙醇,勻漿后過(guò)濾得到待測(cè)濾液。DPPH自由基清除率測(cè)定參考勾明玥等[31]的DPPH測(cè)定方法。
稱取1 g馬鈴薯樣品,加入3 mL 10%三氯乙酸,勻漿后4℃、10000 r/min 離心15 min 得到待測(cè)液。MDA含量參照硫代巴比妥酸煮沸法測(cè)定[32]。
所有樣品均設(shè)3個(gè)重復(fù)。平均值及標(biāo)準(zhǔn)偏差通過(guò)Excel 2010進(jìn)行數(shù)據(jù)整理分析,表示為平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差。單因素方差分析(ANOVA)通過(guò)SPSS 22.0統(tǒng)計(jì)分析軟件計(jì)算。樣品平均值之間的差異通過(guò)鄧肯多重比較進(jìn)行檢驗(yàn)。
2.1.1 2種傷害方式對(duì)鮮切馬鈴薯褐變程度的影響 分別對(duì)馬鈴薯進(jìn)行2種傷處理,于20℃放置18 h,然后進(jìn)行鮮切,鮮切片在2~4℃冷庫(kù)中貯藏8 天,褐變程度變化見(jiàn)圖1。對(duì)照組馬鈴薯鮮切后隨著貯藏時(shí)間延長(zhǎng),褐變程度逐漸加重;而2 種傷處理均能顯著抑制鮮切馬鈴薯褐變。切傷方式處理的鮮切馬鈴薯貯藏4天后開(kāi)始褐變(圖1A);刮傷方式處理的鮮切馬鈴薯在8天有輕微褐變(圖1В)。鑒于以上結(jié)果,后續(xù)研究選用刮傷方式進(jìn)行馬鈴薯傷處理。
2.1.2 傷處理后放置不同溫度及時(shí)間對(duì)鮮切馬鈴薯褐變的影響 采用刮傷方式對(duì)馬鈴薯進(jìn)行傷處理后,將其于5、20℃分別放置12、18、36 h,再進(jìn)行鮮切,鮮切后貯藏8天期間,其褐變程度如圖2所示。由圖2A可知,傷處理后5℃放置18 h,鮮切馬鈴薯褐變程度低于對(duì)照組,但差異并不顯著。由圖2В 可知,傷處理后20℃放置18、36 h,鮮切馬鈴薯褐變程度均顯著低于對(duì)照組。
采用刮傷方式對(duì)馬鈴薯進(jìn)行傷處理后,將其于20℃下分別放置18、36 h,再進(jìn)行鮮切,進(jìn)一步優(yōu)化并篩選最佳褐變抑制條件,結(jié)果如圖3~4所示:傷處理后于20℃放置18 h,其鮮切馬鈴薯褐變程度顯著低于對(duì)照,且鮮切馬鈴薯低溫貯藏6 天內(nèi)基本無(wú)褐變,8 天僅有輕微褐變發(fā)生,仍具有較好的商品價(jià)值。而傷處理后于20℃放置36 h,其鮮切馬鈴薯4 天內(nèi)褐變程度與對(duì)照無(wú)顯著性差異,4~8天褐變程度顯著低于對(duì)照,在貯藏8 天時(shí)出現(xiàn)中度褐變。綜上所述,采用刮傷方式對(duì)馬鈴薯進(jìn)行傷處理并于20℃下放置18 h能夠顯著抑制鮮切后馬鈴薯褐變。
圖1 2種傷害處理方式對(duì)鮮切馬鈴薯褐變程度的影響
圖2 刮傷方式處理后不同放置溫度及時(shí)間對(duì)鮮切馬鈴薯褐變程度的影響
圖3 刮傷方式處理后20℃放置18、36 h對(duì)鮮切馬鈴薯貯藏8天褐變的影響
圖4 刮傷方式處理后20℃放置18、36 h對(duì)鮮切馬鈴薯褐變程度的影響
由2.1結(jié)果可知,采用刮傷方式(即在馬鈴薯兩端用刮皮刀刮掉厚約0.5 mm的表皮)對(duì)馬鈴薯進(jìn)行傷處理,并于20℃放置18 h,然后再實(shí)施鮮切,能夠顯著抑制鮮切馬鈴薯褐變,延長(zhǎng)貨架期。后續(xù)研究將進(jìn)一步針對(duì)于傷處理后20℃放置18 h,探討其對(duì)馬鈴薯鮮切褐變的抑制機(jī)理。
2.2.1 傷處理對(duì)鮮切馬鈴薯感官品質(zhì)的影響 傷處理后20℃放置18 h 對(duì)鮮切馬鈴薯總體感觀質(zhì)量、褐變度及L*值的影響見(jiàn)圖5。鮮切馬鈴薯表面顏色L*值與表面褐變存在顯著的相關(guān)性[33]。由圖5A~В 可知,隨著貯藏時(shí)間延長(zhǎng),鮮切馬鈴薯的褐變程度逐漸上升而L*值逐漸下降;整個(gè)貯藏期間,處理組鮮切馬鈴薯L*值顯著高于對(duì)照,而褐變程度顯著低于對(duì)照。由圖5C 可知,鮮切馬鈴薯總體感官質(zhì)量隨貯藏時(shí)間延長(zhǎng)逐漸下降,對(duì)照組鮮切馬鈴薯總體感官質(zhì)量1天就迅速降低,3天已完全失去商品價(jià)值;傷處理組的鮮切馬鈴薯總體感官質(zhì)量下降較為緩慢,鮮切7天仍具有商品價(jià)值,與對(duì)照相比延長(zhǎng)貨架期可達(dá)4天。
2.2.2 傷處理對(duì)鮮切馬鈴薯PPO、PAL和總酚含量的影響 傷處理對(duì)鮮切馬鈴薯PPO、PAL和總酚含量的影響如圖6所示。鮮切前,傷處理組馬鈴薯PPO、PAL酶活力及總酚含量與對(duì)照相比略有升高,但差異不顯著;而鮮切后,傷處理組PPO、PAL 酶活力、總酚含量均顯著低于對(duì)照組。
綜上所述,傷處理后20℃放置18 h 可以顯著降低鮮切過(guò)程PPO、PAL酶活及總酚含量,提高鮮切馬鈴薯的總體感觀質(zhì)量、抑制鮮切馬鈴薯表面褐變,延長(zhǎng)貨架期。
2.2.3 傷處理對(duì)鮮切馬鈴薯抗氧化體系的影響 傷處理后20℃放置18 h對(duì)鮮切馬鈴薯POD、SOD酶活,DPPH清除率及MDA 含量的影響如圖7 所示。傷處理顯著增加了POD、SOD 酶活力及DPPH 清除率,顯著減緩了MDA 含量的上升,有力地提高了鮮切馬鈴薯抗氧化防護(hù)體系。
實(shí)驗(yàn)分別探討了傷處理方式、傷處理后放置的溫度、時(shí)間等條件對(duì)鮮切馬鈴薯褐變的影響,結(jié)果表明2種傷處理方式(切傷和刮傷)均能顯著抑制鮮切馬鈴薯褐變,且傷處理后于20℃放置18 h能夠顯著抑制鮮切馬鈴薯褐變,具有較好的總體感官質(zhì)量和表面顏色,延長(zhǎng)貨架期4天。傷處理通過(guò)抑制PPO、PAL酶活力,減少褐變底物總酚的積累,提高貯藏期間抗氧化酶POD、SOD 酶活力,增加DPPH 自由基清除能力并降低鮮切馬鈴薯MDA含量,從而顯著抑制鮮切馬鈴薯褐變。
圖5 傷處理對(duì)鮮切馬鈴薯褐變程度、表面顏色L*值及總體感官質(zhì)量的影響
圖6 傷處理對(duì)鮮切馬鈴薯PPO活性、PAL及總酚含量的影響
傷處理是在馬鈴薯進(jìn)行鮮切前,給予馬鈴薯一定的傷處理,這種方式能夠有效地抑制鮮切馬鈴薯褐變,且安全、省力,不需要耗費(fèi)能源、添加外源化學(xué)試劑等,該技術(shù)方法沒(méi)有藥劑殘留,對(duì)鮮切馬鈴薯的風(fēng)味及安全性無(wú)不良影響,為抑制鮮切馬鈴薯加工及貯藏期間的褐變問(wèn)題提供了一種新的技術(shù)方法。
PPO 和PAL 是影響鮮切產(chǎn)品褐變的關(guān)鍵酶,其活性的增加往往會(huì)促進(jìn)酶促褐變[34-35]。王擎等[36]研究發(fā)現(xiàn),曲酸處理通過(guò)抑制PPO 和PAL 酶活性,減輕了鮮切馬鈴薯及蓮藕的褐變。馮巖巖等[37]關(guān)于NO處理抑制鮮切牛蒡褐變的研究表明,PPO 及PAL酶活性的顯著降低是褐變減輕的重要原因。本研究中傷處理降低了鮮切馬鈴薯PPO、PAL 的酶活力從而減少總酚的酶促氧化,顯著抑制了褐變的發(fā)生。
圖7 傷處理對(duì)鮮切馬鈴薯POD活性、SOD活性、DPPH自由基清除率及MDA含量的影響
POD 和SOD是植物防御酶體系的重要成員,在清除活性氧及其他過(guò)氧化物自由基,保護(hù)細(xì)胞免受氧自由基毒害等方面發(fā)揮著重要作用[38]。機(jī)械傷害易誘導(dǎo)植物SOD、POD、CAT等抗氧化防護(hù)酶活性的上升,而抗氧化防護(hù)酶活性的提高有利于抑制鮮切果蔬褐變[39]。姜愛(ài)麗等[40]研究發(fā)現(xiàn)機(jī)械傷誘導(dǎo)了大蒜中SOD、POD 和CAT 抗氧化酶活性的升高,提高了DPPH 自由基清除能力。劉艷等[41]研究發(fā)現(xiàn),機(jī)械傷害能誘導(dǎo)豌豆葉片的防御反應(yīng),提高抗氧化酶類活性,降低膜脂過(guò)氧化水平,減輕活性氧損傷。蘇晶等[42]研究表明,機(jī)械傷可以誘導(dǎo)采后蘋果防御酶POD 活性增加。較高的抗氧化活性可以清除活性氧自由基,防止膜脂過(guò)氧化,同時(shí)植物組織中有較高的還原勢(shì),可以將氧化形成的醌類物質(zhì)還原或轉(zhuǎn)化,避免醌與氨基酸、蛋白質(zhì)等進(jìn)一步的聚合反應(yīng),從而顯著抑制褐變[40]。DPPH 自由基清除率常用于評(píng)價(jià)非酶類抗氧化活性[43],其上升有利于抑制酶促褐變[44]。MDA是膜脂過(guò)氧化產(chǎn)物,其含量的增加意味著膜脂過(guò)氧化程度的增強(qiáng);果蔬M(jìn)DA含量降低,往往有利于膜脂穩(wěn)定,而膜完整性的保持可以維持酚和底物的區(qū)隔化分布,避免兩者接觸從而抑制褐變[45-46]。
而對(duì)馬鈴薯進(jìn)行傷處理并于20℃放置18 h,顯著增加了SOD、POD 酶活性,提高了鮮切馬鈴薯DPPH自由基清除能力,降低自由基對(duì)細(xì)胞膜的氧化損傷,抑制了MDA 含量的升高,有利于維持組織內(nèi)氧化還原穩(wěn)態(tài),進(jìn)而抑制鮮切馬鈴薯褐變。
植株受到機(jī)械損傷后會(huì)有一套完整的防御系統(tǒng)來(lái)應(yīng)對(duì)損傷刺激,應(yīng)激信號(hào)通過(guò)信號(hào)分子誘導(dǎo)植物抗性反應(yīng)。植物受到機(jī)械傷害后,在數(shù)分鐘或數(shù)小時(shí)內(nèi)便會(huì)發(fā)生傷信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo),激活防御反應(yīng)體系。在植物誘導(dǎo)自身抗性反應(yīng)的過(guò)程中,信號(hào)分子發(fā)揮重要作用。信號(hào)分子的傳遞和級(jí)聯(lián)放大作用將應(yīng)激信號(hào)從局部傳至整個(gè)植物,最終導(dǎo)致一系列防御基因的表達(dá)、防御物質(zhì)的代謝及防御酶活性等發(fā)生改變,誘導(dǎo)植物產(chǎn)生抗性[42];參與傷害反應(yīng)的信號(hào)分子主要有水楊酸、乙烯、H2O2、茉莉酸(jasmonic acid,JA)等[47-50]。如JA是植物體內(nèi)重要的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)物質(zhì),當(dāng)植物受到脅迫時(shí),細(xì)胞內(nèi)JA 含量快速升高,可以啟動(dòng)JA 應(yīng)答基因的表達(dá),提高植物對(duì)機(jī)械損傷和病蟲害的抗性[49]。劉佳妮等[51]研究發(fā)現(xiàn),蛾取食傷害會(huì)激活馬鈴薯塊莖JA介導(dǎo)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑,誘導(dǎo)防御酶POD、CAT 酶基因表達(dá)量上升。本研究后續(xù)可以通過(guò)對(duì)信號(hào)分子如JA 類物質(zhì)含量的測(cè)定及相關(guān)基因表達(dá)的分析,進(jìn)一步探討傷處理抑制鮮切馬鈴薯褐變的分子機(jī)制。