瀕危藥材明黨參愈傷組織培養(yǎng)條件研究

胡瓊

摘要?[目的]研究培養(yǎng)條件對明黨參愈傷組織生長及多糖積累的影響。[方法]分別采用單因素及正交試驗的方法，以明黨參葉片誘導產(chǎn)生的愈傷組織為材料，從外植體種類、激素種類及濃度、大量母液添加量、光照條件等培養(yǎng)條件比較愈傷組織生長情況及多糖含量。[結(jié)果]葉片外植體、大量母液1倍添加量、0.5 mg/L 2，4-D及暗培養(yǎng)等培養(yǎng)條件較有利于明黨參愈傷組織生長及多糖的合成。[結(jié)論]該研究為培養(yǎng)生產(chǎn)明黨參愈傷組織及多糖提供理論和方法依據(jù)。

關(guān)鍵詞?明黨參;愈傷組織;多糖;培養(yǎng)條件

中圖分類號?S567.23文獻標識碼?A

文章編號?0517-6611（2019）20-0195-04

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2019.20.053

開放科學（資源服務(wù)）標識碼（OSID）：

Study on the Culture Conditions of Callus of Endangered Changium smyrnioides

HU Qiong?（Hangzhou Wanxiang Polytechnic， Hangzhou，Zhejiang 310023）

Abstract?[Objective]The research aimed to study the culture conditions for the callus growth and the accumulation of amylose in Changium smyrnioides.[Method]Using single factor and orthogonal test methods，the callus induced by the leaves of the ginseng was used as the material，the callus growth and polysaccharide content were compared from the explant species， hormone type and concentration， the amount of mother liquor added， and the light conditions.[Result]The culture conditions of leaf explants， large amount of mother liquor 1 times， 0.5 mg/L 2，4-D and dark culture were more favorable for the growth of callus and the synthesis of polysaccharides.[Conclusion]This study provides theoretical and methodological basis for the cultivation of callus and polysaccharides from Changium smyrnioides.

Key words?Changium smyrnioides;Callus;Polysaccharides;Culture conditions

明黨參（Changium smyrnioides）屬于傘形科明黨參屬植物，是我國特有的單種屬植物，分布于濕潤亞熱帶地區(qū)的長江流域東、中部，具有補氣生津、潤肺化痰、平肝和胃、消腫解毒的功效，是我國著名的特產(chǎn)藥用植物之一，以根塊利用為主。多糖是其含有的一種主要活性成分，試驗均發(fā)現(xiàn)明黨參具有增強機體免疫力、提高機體適應力的功效[1-3]。由于明黨參自身的生物學特性、人為的毀林開荒、植株的過度采挖及生境的破碎化、亂砍濫伐和開發(fā)旅游，破壞了明黨參生長的適宜生境，其野生資源破壞嚴重，分布范圍和數(shù)量日益減少。如殷現(xiàn)偉[4]、蔣志剛等[5]對明黨參種群生存過程進行了數(shù)量分析，結(jié)果顯示目前種群表現(xiàn)出衰退趨勢，瀕臨滅絕。

多糖廣泛存在于多種中草藥中，因其能提高機體免疫系統(tǒng)，具有多種生物活性，是理想的免疫增強劑，故是中藥材中最有效的藥用成分之一[6-7]。研究發(fā)現(xiàn)，明黨參尤其是塊根中多糖含量較高[8-10]。在野外或常規(guī)的栽培情況下，明黨參塊根至少需要3～5年才能富集一定的多糖含量，歷時長，產(chǎn)量低。筆者考慮用愈傷組織生產(chǎn)明黨參多糖具有可行性。利用組培方法產(chǎn)生愈傷組織，對愈傷組織生長中的部分影響因素進行試驗，比較其在各種條件下生長和多糖積累的動態(tài)特征，以期為大規(guī)模細胞培養(yǎng)生產(chǎn)明黨參愈傷組織及多糖提供理論和方法依據(jù)。

1?材料與方法

1.1?試驗材料?3—5月采自浙江杭州市寶石山和玉皇山多年生明黨參幼嫩葉片和莖段，經(jīng)鑒定為傘形科植物明黨參。

1.2?試驗設(shè)計

1.2.1?愈傷組織培養(yǎng)激素條件初篩。

采用L9（34）正交表進行設(shè)計，共4種因素（2，4-D、NAA、6-BA、KT），各3個水平（表1）。葉片和莖段均采用這9種培養(yǎng)基配方，每項試驗平行做2組，每組接種20瓶外植體，每瓶接種5～7塊外植體，定期觀察外植體的生長狀況，接種15 d后，統(tǒng)計愈傷組織誘導率并進行直觀分析生長勢和愈傷率。愈傷組織誘導率=形成愈傷組織的外植體數(shù)/接種的外植體數(shù)×100%。將初篩后得到的愈傷轉(zhuǎn)接相同培養(yǎng)基30 d后，備用。

1.2.2?愈傷組織培養(yǎng)激素條件再篩。

在初篩的基礎(chǔ)上，圍繞較理想的培養(yǎng)激素種類和濃度進一步篩選。將初篩后得到的轉(zhuǎn)接相同培養(yǎng)基30 d后的愈傷組織其重量進行無菌稱量，后無菌接種到激素組合分別為6-BA-1（6-BA 1.0 mg/L，2，4-D 0.5 mg/L）、6-BA-2（6-BA 1.0 mg/L，2，4-D 1.0 mg/L）、KT-1（KT 1.0 mg/L，2，4-D 0.5 mg/L）、KT-2（KT 1.0 mg/L，2，4-D 1.0 mg/L）4種培養(yǎng)基中，其他的基質(zhì)條件和培養(yǎng)條件都一致，每個處理重復4瓶。培養(yǎng)30 d后稱量各自的愈傷鮮重，計算其前后的平均值，通過平均值的比率大小來了解較優(yōu)的激素組合。

1.2.3?愈傷組織中多糖含量測定方法。

將各處理的愈傷組織在60 ℃下快速烘干至恒重，將其研磨60目過篩后備用。多糖含量測定采用分光光度比色法測定， 在 620 nm 處測定標準其吸光度。通過測量不同處理下吸光度的大小，粗略比較愈傷組織中多糖含量的高低，來分析該因素對多糖積累的影響[11-13]。

1.2.4?培養(yǎng)基中大量元素不同倍數(shù)處理。在其他條件一樣的情況下，將愈傷組織無菌接種到大量元素分別為2倍、1倍、1/2倍的3種培養(yǎng)基中，分別對應D-1、D-2、D-3。通過測量大量元素處理下組織鮮重增長倍數(shù)、多糖含量變化，來分析該因素對活性物質(zhì)積累的影響。愈傷組織培養(yǎng)、稱重及多糖抽提方法同“1.2.2”和“1.2.3”。

1.2.5?不同光照條件處理。

在其他條件一樣的情況下，將愈傷組織無菌接種到同一配方培養(yǎng)基中，以連續(xù)24 h光照（L-1）、12 h/d光暗交替（L-2）及24 h黑暗（L-3）3種光照形式，進行明黨參愈傷組織繼代培養(yǎng)。通過測量不同光照形式下愈傷組織鮮重增長倍數(shù)、多糖含量變化，來分析該因素對活性物質(zhì)積累的影響。愈傷組織培養(yǎng)、稱重及多糖抽提方法同“1.2.2”和“1.2.3”。

2?結(jié)果與分析

2.1?激素種類及濃度影響愈傷生長

明黨參的葉片和莖段在含有不同激素的9種MS培養(yǎng)基上培養(yǎng)8～9 d均可誘導出愈傷組織，且愈傷率一般可達到50%以上，甚至接近100%。2種外植體產(chǎn)生的愈傷組織顏色、質(zhì)地差別并不是很明顯，但長勢有一定的差異，尤其是在繼代培養(yǎng)后。其中來自于葉片的愈傷組織的產(chǎn)量及長勢比較理想（圖1、表2）。

2.2?不同激素組合對愈傷組織及其多糖合成的影響

從表3和圖2可看出，4種不同激素組合均能使初代愈傷組織擴繁，新鮮愈傷組織顏色、長勢及多糖含量差異不明顯。其中 6-BA-1（6-BA 1 mg/L，2，4-D 0.5 mg/L）組合相對理想。

2.3?培養(yǎng)基中大量元素對愈傷組織及其多糖合成的影響

觀察不同大量元素處理中愈傷組織生長結(jié)果（圖3、表4）發(fā)現(xiàn)，色澤方面D-2處理比較理想，色微黃;生長狀態(tài)及生長勢方面D-1處理狀態(tài)均較好;鮮重變化量比率D-2則明顯優(yōu)于另2個處理。綜上結(jié)果，大量元素添加量為D-2處理即1x時，對愈傷組織生長有顯著促進作用，愈傷組織生長較理想。

由圖4可知，3種處理中D-2多糖的OD值最高，高于D-1和D- 對多糖合成有促進作用。愈傷組織培養(yǎng)中大量元素添加量為MS 培養(yǎng)基的1倍（1x）時比較適合多糖的積累。

2.4?不同光照條件處理對愈傷組織及其多糖合成的影響

圖5顯示，色澤方面L-1處理微黑褐，目測生長量、全絮狀最差，顆粒狀最明顯;L-2處理色澤也是微黑褐色，愈傷生長率80%，但長勢一般;L-3處理色澤最好，色微黃，愈傷生長率80%，且長勢較好，全絮狀明顯。愈傷鮮重變化量比率區(qū)別較明顯，L-3>L-2>L-1（表5）。3種處理中L-3處理的多糖OD值遠高于L-1和L-2（圖6）。故愈傷組織培養(yǎng)中暗培養(yǎng)比較適合多糖的積累。

3?討論與結(jié)論

3.1?明黨參最優(yōu)外植體的選擇

江曙等[14]試驗認為利用明黨參的根、葉柄、葉片均可誘導出愈傷組織，且來自于葉柄的愈傷組織長勢最好。該試驗發(fā)現(xiàn)葉片愈傷誘導的效果最為理想。該結(jié)果與其他研究結(jié)果有所出入。筆者認為可能與明黨參的種類、原材料采集的時間、激素的種類等有一定的關(guān)系。該種外植體來源廣、可采集量大，故可作為大批量生產(chǎn)愈傷組織的外植體首選。這對明黨參野生資源的保護利用具有重要意義。

3.2?培養(yǎng)基成分對明黨參愈傷組織的影響

在其他條件一致的情況下，加入2，4-D 0.5 mg/L與2，4-D 1.0 mg/L的效果差別不顯著。試驗也發(fā)現(xiàn)，6BA-1與KT-1的愈傷質(zhì)地有較明顯的區(qū)別，分屬于疏松型和緊密型。彭昕等[15]在中藥材三葉青愈傷組織研究中發(fā)現(xiàn)疏松型和緊密型2種類型的愈傷質(zhì)量有較大的差異。故該方面可作為后續(xù)研究的方向。

上官新晨等[16]研究發(fā)現(xiàn)，高鹽的培養(yǎng)基較適合愈傷組織的生長，低鹽的培養(yǎng)基較適合次生代謝產(chǎn)物的積累。與該試驗中基礎(chǔ)母液的大量元素含量對明黨參愈傷生長和多糖積累影響基本相符。大量元素在常規(guī)1倍的情況下愈傷組織的長勢及增長率要高于1/2倍添加量，而多糖積累情況剛好相反。

3.3?光照條件對明黨參愈傷組織的影響

研究表明，光照可影響細胞的生長和次生代謝物的積累，影響效果因植物種類不同而不同[17-18]。齊琳琳等[19]發(fā)現(xiàn)三七愈傷組織在不同光強下每天光照12 h的愈傷組織，皂苷含量均低于黑暗培養(yǎng)的愈傷組織，猜測光照引起愈傷組織表面變綠及細胞分化，是抑制愈傷組織中皂苷合成與積累的主要原因。該研究表明 24 h/d黑暗最有利于明黨參愈傷組織的生長，這可能與明黨參適生于較蔭環(huán)境有關(guān);且黑暗有利愈傷組織的生長不利分化，也不抑制多糖的形成，這可能與多糖合成條件有關(guān)。

綜上所述，葉片、大量元素常規(guī)1倍培養(yǎng)基、2，4-D 0.5 mg/L激素及暗培養(yǎng)等方式生產(chǎn)明黨參多糖，不僅可以大大地縮短生產(chǎn)周期，而且細胞培養(yǎng)物中的多糖含量也明顯增高，具有較大的可行性。該研究對于緩解珍稀瀕危藥用植物資源的短缺矛盾具有重要的理論意義和應用價值，有助于實現(xiàn)中藥資源的可持續(xù)發(fā)展。

參考文獻

[1] 單人驊，佘孟蘭.中國植物志[M].北京：科學出版社，1979：122-124.

[2] 傅立國.中國植物紅皮書——稀有瀕危植物[M].北京：科學出版社，1991：532-535.

[3] 吳澤鵬.明黨參的活性成分分析[J].亞太傳統(tǒng)醫(yī)藥，2010，6（3）：32-33.

[4] 殷現(xiàn)偉.瀕危植物明黨參與對照植物的生理生態(tài)學研究[D].杭州：浙江大學，2003.

[5] 蔣志剛，葛頌.探索長江流域物種瀕危機制與保護對策[J].生物多樣性，2005，13（5）：367-375.

[6] 肖建輝.江西蟲草多糖含量的快速檢測方法研究[J].中藥材，2008，31（5）：689-692.

[7] 鄧澤元，劉娟.余迎利，等.決明子水溶性多糖提取的研究[J].食品科學，2002，23（1）：72-75.

[8] 任東春，錢士輝，楊念云，等.明黨參化學成分研究[J].中藥材，2008，31（1）：47-49.

[9] 白鋼鋼，袁斐，毛坤軍，等.明黨參根皮化學成分研究[J].中藥材，2014，45（12）：1673-1676.

[10] 余鵬，呂鵬，王慧忠.滁州市瑯琊山明黨參可溶性多糖分析[J].滁州學院學報，2012，14（5）：53-55.

[11] 劉云.當歸多糖含量的提取及含量測定[J].現(xiàn)代中藥研究與實踐， 2003，17（1）： 49，53.

[12] 杜清， 秦民堅， 郭巧生.明黨參多糖提取工藝研究[J].現(xiàn)代中藥研究與實踐， 2005，19（4）： 51-53.

[13] 郭巧生，王長林，厲彥森，等.明黨參干物質(zhì)積累及多糖含量的動態(tài)研究[J].中國中藥雜志，2007，32（1）： 24-26.

[14] 江曙，段金廒，陳建偉，等.明黨參愈傷組織誘導及其細胞懸浮培養(yǎng)的研究[J].中國中藥雜志，2009，34（9）：1078-1081.

[15] 彭昕，張劍，何軍邀，等.三葉青松散型和致密型愈傷組織懸浮培養(yǎng)及黃酮積累的比較研究[J].中草藥，2012，43（3）：577-580.

[16]上官新晨，郭春蘭，楊武英，等.培養(yǎng)基及培養(yǎng)條件對青錢柳愈傷組織生長和黃酮含量的影響[J].福建農(nóng)林大學學報（ 自然科學版），2006，35（6）：588-592.

[17] 朱紅威，邵菊芳，李慶，等.不同培養(yǎng)條件對銀杏愈傷組織生長及黃酮含量的影響[J].食品科學，2007，28（11）：102-105.

[18] 彭昕，林言娜，何軍邀，等.培養(yǎng)條件對三葉青愈傷組織生長及總黃酮含量的影響[J].藥物生物技術(shù)，2012，19（2）：138-141.

[19] 齊琳琳， 李剛， 劉志偉， 等. 培養(yǎng)條件對三七愈傷組織生長和皂苷積累的影響[J].廣西植物， 2017，37（8）：1035-1042.