5’-尿嘧啶核苷酸與鋅離子相互作用研究

卿琳華 童群義

摘要?[目的]研究尿苷酸與鋅離子之間的相互作用，為研究尿苷酸在生物體內(nèi)的作用方式及配合物的潛在應(yīng)用提供理論基礎(chǔ)。[方法]利用傅里葉紅外光譜、共聚焦拉曼光譜來研究尿苷酸與鋅離子之間的配位方式，并以尿苷酸鋅產(chǎn)率為指標(biāo)來探討不同條件對(duì)它們相互作用的影響。[結(jié)果]不同條件對(duì)尿苷酸與鋅離子相互作用的影響程度不同;紅外光譜中尿苷酸鋅的磷酸基團(tuán)峰位置明顯向高頻移動(dòng)，且C—O伸縮振動(dòng)峰出現(xiàn)輕微的頻移;拉曼圖譜中，尿苷酸鋅的羰基伸縮振動(dòng)峰出現(xiàn)明顯裂分現(xiàn)象，且峰的強(qiáng)度變?nèi)?。[結(jié)論] pH和配合時(shí)間對(duì)尿苷酸鋅產(chǎn)率的影響明顯，而溫度對(duì)其影響較小。鋅離子可以與尿苷酸的磷酸基團(tuán)發(fā)生配位作用，并與堿基上的一個(gè)羰基氧原子發(fā)生相互作用。

關(guān)鍵詞?尿苷酸鋅;配位方式;紅外光譜;拉曼光譜

中圖分類號(hào)?TS201文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼?A

文章編號(hào)?0517-6611（2019）20-0179-03

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2019.20.048

開放科學(xué)（資源服務(wù)）標(biāo)識(shí)碼（OSID）：

The Interaction between Uridine 5?Monophosphate and Zinc Ions

QING Lin?hua， TONG Qun?yi

（Jiangnan University，Wuxi，Jiangsu 214122）

Abstract?[Objective]The interaction between UMP and zinc ions was studied， aiming to provide a theoretical basis for the mode of UMP in biological body and potential application of complexes. [Method]The interaction between UMP and zinc ions was studied by infrared spectroscopy and Raman spectroscopy， and the influences of different conditions on them were investigated， taking the yield of UMP?Zn as target. [Result]Different conditions had different effects on the interaction between UMP and zinc ions. The obvious shifting to higher frequencies of stretching vibration of phosphate group and the slight shifting of C-O can be observed in infrared spectrum data. In Raman spectrum of UMP?Zn， the stretching vibration of C-O was split clearly and its intensity became weaker. [Conclusion]The yield of UMP?Zn could be influenced greatly by pH and reaction time， but temperature had a little effect on the yield. Zinc ion can coordinate with phosphate group of UMP and interact with a carbonyl oxygen atom on the base.

Key words?UMP?Zn;Coordination mode;Infrared spectrum;Raman spectrum

5-尿嘧啶核苷酸（uridine 5-monophosphate，UMP，簡(jiǎn)稱尿苷酸）是核苷酸的一種，由尿嘧啶堿基、核糖和磷酸基團(tuán)組成。尿苷酸在生物體內(nèi)起著極其重要的作用，可參與肝解毒物質(zhì)葡萄糖醛酸的生物合成，在醫(yī)學(xué)領(lǐng)域中可用于治療肝炎、改善冠心病等癥狀，且尿苷酸及其衍生物對(duì)生物體內(nèi)的免疫調(diào)節(jié)和代謝調(diào)控起到尤為重要的作用[1-2]。作為食品添加劑，包括尿苷酸在內(nèi)的核苷酸已被允許添加到嬰幼兒奶粉當(dāng)中，可滿足嬰幼兒對(duì)核苷酸的需要，起到維持免疫系統(tǒng)功能、促進(jìn)腸道成熟等作用[3]。在飼料添加劑領(lǐng)域，核苷酸的復(fù)配使用可發(fā)揮出促進(jìn)血液循環(huán)和新陳代謝、促進(jìn)動(dòng)物生長(zhǎng)發(fā)育、減少酮體脂肪、增強(qiáng)免疫力等功效[4-5]。

鋅元素是生物體必需的微量元素，可直接參與核酸的合成、細(xì)胞分化和增殖等生化過程，更是300多種酶和功能蛋白的重要組成部分，在維持蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)和功能方面發(fā)揮重要作用。缺鋅會(huì)導(dǎo)致生長(zhǎng)遲緩、味覺異常、免疫力降低、嗜睡等病癥的發(fā)生[6]，而體內(nèi)鋅含量過多可能會(huì)導(dǎo)致腸胃炎、胰腺受損、免疫力降低，甚至貧血。

生物體內(nèi)的核苷酸通常與金屬離子結(jié)合而參與到生物活動(dòng)過程中[7]，且核苷酸的磷酸基團(tuán)、戊糖部分或者雜環(huán)堿基上的氮原子和氧原子均是金屬離子可能的結(jié)合位點(diǎn)[8-10]，對(duì)金屬和核苷酸的研究對(duì)于理解金屬與核酸相互作用以及核苷酸的生物學(xué)意義十分重要。筆者主要利用紅外和拉曼

光譜來分析尿苷酸與鋅離子之間的配合方式，并探討不同條件對(duì)尿苷酸與鋅離子相互作用的影響，以期為研究尿苷酸在生物體內(nèi)的作用方式及配合物的潛在應(yīng)用提供理論基礎(chǔ)。

1?材料與方法

1.1?材料

1.1.1?原材料。5-尿苷酸、5-尿苷酸二鈉，由杭州美亞藥業(yè)股份有限公司提供。

1.1.2

主要試劑。無水氯化鋅，江蘇博美達(dá)生命科學(xué)有限公司;氫氧化鈉、鹽酸、乙二胺四乙酸二鈉（EDTA）、二甲酚橙、無水乙醇、冰乙酸、乙酸鈉、溴化鉀，均購(gòu)于國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

1.1.3

主要儀器。HH-2k8恒溫水浴鍋（鞏義市予華儀器有限公司）;R205B旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器（上海申順科技有限公司）;RJ-LD-50G低速離心機(jī)（無錫市瑞江分析儀器有限公司）;RT-10加熱磁力攪拌器（廣州儀科實(shí)驗(yàn)室技術(shù)有限公司）;SHZ-95B循環(huán)水真空泵（鞏義市予華儀器有限公司）;EL20實(shí)驗(yàn)室pH計(jì)（梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司）;AB104-N電子分析天平（梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司）;DZF真空干燥箱（上?？坪銓?shí)業(yè)發(fā)展有限公司）;IS10傅里葉紅外光譜儀（美國(guó)Nicolet公司）;LabRAM HR Evolution顯微共聚焦拉曼光譜儀（法國(guó)HORIBAI Jobin Yvon S.A.S.公司）;TGA2熱重分析儀（梅特勒-托利多儀器有限公司）。

1.2?方法

1.2.1

尿苷酸與鋅離子配合過程的影響因素研究。

1.2.1.1

配合反應(yīng)過程。稱取一定量的5-尿苷酸二鈉，用去離子水溶解，調(diào)pH，再加入相同物質(zhì)的量的氯化鋅，恒溫?cái)嚢璺磻?yīng)一段時(shí)間，再將溶液轉(zhuǎn)移到蒸餾瓶中進(jìn)行旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮，取濃縮液加入10倍體積左右的無水乙醇浸提，析出白色固體，靜置，低速離心、過濾，收集沉淀，分別用去離子水和乙醇洗滌，干燥即得1∶1型配合產(chǎn)物尿苷酸鋅（UMP-Zn）。

1.2.1.2

影響因素研究。分別設(shè)置不同的pH（2.0、2.5、3.0、3.5、4.0、4.5）、溫度（20、40、60、80 ℃）和配合時(shí)間（15、30、45、60、75、90、120 min），以尿苷酸鋅的產(chǎn)率為指標(biāo)，探討不同條件對(duì)尿苷酸與鋅離子相互作用的影響。

1.2.2

尿苷酸鋅產(chǎn)率的測(cè)定。水溶液中尿苷酸與鋅離子作用一段時(shí)間后，取一定體積的反應(yīng)液加乙醇進(jìn)行浸提，靜置析出沉淀，離心分離，醇洗沉淀2～3次。將沉淀轉(zhuǎn)移至錐形瓶中，加入30 mL去離子水和15 mL乙酸-乙酸鈉緩沖溶液（pH 5.5），再滴加2滴二甲酚橙指示劑（2 g/L），溶液呈紫紅色，用0.01 mol/L的EDTA溶液滴定，溶液顏色變?yōu)榱咙S色即為終點(diǎn)，記錄消耗的EDTA體積，計(jì)算尿苷酸鋅配合物的實(shí)際生成量，平行重復(fù)3次試驗(yàn)。

尿苷酸鋅的理論生成量由尿苷酸和鋅離子的投入量計(jì)算得到，按下式計(jì)算產(chǎn)率：

產(chǎn)率=cVn理論×100%

式中，c為EDTA溶液的濃度（mol/L）;V為消耗的EDTA體積（L）;n理論為尿苷酸鋅的理論生成量（mol）。

1.2.3

尿苷酸鋅固體的鋅含量測(cè)定。精確稱取尿苷酸鋅固體，置于250 mL錐形瓶中，測(cè)定方法同“1.2.2”，記錄消耗的EDTA體積，測(cè)定尿苷酸鋅固體的鋅含量，平行重復(fù)3次試驗(yàn)，鋅含量計(jì)算公式為：

鋅的質(zhì)量分?jǐn)?shù)=cMVm×100%

式中，c為EDTA溶液的濃度（mol/L）;m為尿苷酸鋅固體質(zhì)量（g）;M為鋅的摩爾質(zhì)量（g/mol）;V為消耗的EDTA體積（L）。

1.2.4?尿苷酸與鋅離子配合方式的光譜研究。

1.2.4.1

傅里葉紅外光譜分析。用溴化鉀（KBr）壓片法分別測(cè)定400～4 000 cm-1內(nèi)尿苷酸和尿苷酸鋅固體的紅外光譜。

1.2.4.2?共聚焦拉曼光譜分析。分別測(cè)定尿苷酸和尿苷酸鋅固體的拉曼光譜，測(cè)定條件為激發(fā)波長(zhǎng)532 nm，光柵刻線600線/mm，掃描范圍200～2 000 cm-?光譜信號(hào)采集積分時(shí)間5 s，共焦孔徑150 μm，50倍長(zhǎng)焦距鏡頭。

1.2.5?熱重分析。稱取3 mg左右的尿苷酸鋅固體，置于瓷坩堝中，測(cè)定失重曲線，測(cè)定條件為溫度30～600 ℃，升溫速率為10 ℃/min，氮?dú)獗Ｗo(hù)。

2?結(jié)果與分析

2.1?尿苷酸與鋅離子相互作用的影響因素研究

2.1.1?pH。在不同pH溶液中尿苷酸的解離程度不同，因此試驗(yàn)過程中酸度對(duì)配合反應(yīng)的影響很大。pH較低時(shí)，體系中的氫離子會(huì)與金屬離子爭(zhēng)奪供電基團(tuán);pH較高時(shí)，體系中的氫氧根離子會(huì)與核苷酸配體爭(zhēng)奪金屬離子，這都會(huì)影響配合反應(yīng)的進(jìn)行。探究pH對(duì)配合反應(yīng)的影響非常重要。由圖1可知，當(dāng)pH在2.0～3.5時(shí)，隨著pH的升高，配合物產(chǎn)率逐漸增加，說明尿苷酸與鋅離子的相互作用隨著pH的升高而增強(qiáng);當(dāng)pH為 3.5時(shí)產(chǎn)率最大，為48.58%;而pH>3.5之后，配合物產(chǎn)率呈現(xiàn)逐漸降低的趨勢(shì)，這可能是pH影響尿苷酸的解離造成的。

2.1.2?溫度。在化學(xué)反應(yīng)中，溫度也會(huì)影響反應(yīng)的進(jìn)行程度。由于尿苷酸與鋅離子之間的配合反應(yīng)為吸熱反應(yīng)，所以溫度的升高一般會(huì)促進(jìn)配合反應(yīng)的進(jìn)行。由圖2可知，尿苷酸與鋅離子的配合反應(yīng)在常溫下即可發(fā)生，20 ℃時(shí)配合物產(chǎn)率為43.65%。當(dāng)溫度在20～60 ℃內(nèi)，隨著溫度的升高，配合物產(chǎn)率增大，說明尿苷酸與鋅離子之間的相互作用增強(qiáng)。而當(dāng)溫度升高至80 ℃時(shí)，配合物產(chǎn)率略有降低，這可能因?yàn)檩^高的溫度會(huì)對(duì)尿苷酸分子的結(jié)構(gòu)造成一定程度的破壞，使得配合物產(chǎn)率無增加趨勢(shì)。

2.1.3

配合時(shí)間。尿苷酸與鋅離子配合時(shí)間的長(zhǎng)短直接關(guān)系到配位反應(yīng)是否完全。由圖3可知，隨著配合時(shí)間的增加，尿苷酸鋅的產(chǎn)率先呈現(xiàn)增加趨勢(shì)后基本持平。在15 min時(shí)配合物產(chǎn)率為44.27%，說明尿苷酸與鋅離子之間的配合反應(yīng)較快。在15～60 min內(nèi)，尿苷酸鋅的產(chǎn)率逐漸增大，60 min時(shí)產(chǎn)率達(dá)51.12%（增加6.85百分點(diǎn)）。此后，繼續(xù)增加配合反應(yīng)時(shí)間，配合物產(chǎn)率基本不變。

2.2?尿苷酸鋅的鋅含量和結(jié)晶水的含量測(cè)定

尿苷酸鋅的熱重曲線如圖4所示，尿苷酸鋅的鋅含量和結(jié)晶水含量分別為15.36%和8.61%。在尿苷酸鋅的熱重曲線中，存在2個(gè)失重平臺(tái)。第1個(gè)失重平臺(tái)的溫度在110 ℃，失去的是結(jié)晶水;在第2個(gè)失重平臺(tái)中，尿苷酸鋅質(zhì)量呈現(xiàn)快速下降的趨勢(shì)，這是因?yàn)槟蜍账徜\發(fā)生了熱分解。

2.3?尿苷酸與鋅離子相互作用的光譜研究

傅里葉紅外光譜儀和拉曼光譜儀具有精度高、速度快、分辨率高等優(yōu)點(diǎn)，它們都是用于分析物質(zhì)結(jié)構(gòu)的重要儀器，兩者相輔相成，聯(lián)用時(shí)可以更好地分析分子的振動(dòng)狀態(tài)，反映出物質(zhì)分子結(jié)構(gòu)的信息。尿苷酸分子在配位前后，其振動(dòng)光譜會(huì)出現(xiàn)一定程度的改變，出現(xiàn)峰的頻移、強(qiáng)度改變等現(xiàn)象?？梢酝ㄟ^比較配位前后尿苷酸和尿苷酸鋅配合物的紅外、拉曼光譜信息來研究尿苷酸與鋅離子的相互作用。尿苷酸和尿苷酸鋅配合物的紅外、拉曼光譜圖分別如圖5、6所示。

紅外光譜是通過官能團(tuán)的振動(dòng)信息來分析物質(zhì)結(jié)構(gòu)的一種常用方法。與尿苷酸的紅外圖譜（圖5a）相比，在尿苷酸鋅配合物的紅外光譜圖中（圖5b），尿苷酸分子的主要特征峰均被保留下來，說明在配合物中尿苷酸分子的結(jié)構(gòu)沒有發(fā)生明顯變化。由于核糖C—O的伸縮振動(dòng)峰和磷酸基團(tuán)反對(duì)稱伸縮振動(dòng)峰由原來的1 124、1 085 cm-1高頻移至1 174、1 100 cm-1;且磷酸基團(tuán)的對(duì)稱伸縮峰也由原來的980、936 cm-1高頻移至1 017、992 cm-1。磷酸基團(tuán)的高頻移動(dòng)表明鋅離子與磷酸基團(tuán)發(fā)生了配位作用，產(chǎn)生誘導(dǎo)效應(yīng)[11-12]，使得磷酸基團(tuán)的電子云密度增加。此外，羰基伸縮振動(dòng)峰出現(xiàn)輕微的變化，峰位置往高頻方向稍稍移動(dòng)，位于1 693、1 670 cm-?且出現(xiàn)肩峰，這可能是因?yàn)闅滏I作用或者鋅離子與尿苷酸堿基發(fā)生相互作用。

紅外和拉曼光譜圖通常能夠互補(bǔ)，這是因?yàn)閮烧哒駝?dòng)產(chǎn)生的機(jī)理不同。由于磷酸基團(tuán)的極性較強(qiáng)，在拉曼圖譜中的峰強(qiáng)度很弱。在尿苷酸的拉曼譜圖中（圖6a），主要有3個(gè)較強(qiáng)的吸收峰，791 cm-1處的峰歸屬于尿嘧啶環(huán)平面內(nèi)呼吸振動(dòng)，位于1 360 cm-1處的峰為C—N鍵的平面內(nèi)伸縮振動(dòng)和C—H鍵的平面內(nèi)搖擺振動(dòng)，位于1 676 cm-1處的峰為堿基上羰基的伸縮振動(dòng)峰[13-14]。此外，987 cm-1和1 406 cm-1處的峰歸屬為C—N、C—C鍵的伸縮振動(dòng)峰和N—H、C—H的彎曲振動(dòng)峰[15]。在尿苷酸鋅的拉曼圖譜中（圖6b），主要峰位置仍被保留下來，峰位置無明顯變化。而羰基伸縮振動(dòng)峰出現(xiàn)裂分現(xiàn)象，分別位于1 657、1 678 cm-?且強(qiáng)度稍稍變?nèi)?，這可能是因?yàn)殇\離子和尿苷酸堿基上的1個(gè)羰基氧原子之間發(fā)生了相互作用，導(dǎo)致2個(gè)羰基的電子云密度不同。

3?結(jié)論與討論

（1）探討了尿苷酸與鋅離子配合過程中，不同條件對(duì)尿苷酸與鋅離子相互作用的影響，pH、溫度和配合時(shí)間對(duì)其產(chǎn)率的影響程度不同。pH和配合時(shí)間對(duì)尿苷酸鋅產(chǎn)率的影響明顯，而溫度對(duì)其影響不明顯。

（2）結(jié)合紅外光譜和拉曼光譜來分析尿苷酸與鋅離子之間的配合方式，發(fā)現(xiàn)尿苷酸鋅的磷酸基團(tuán)伸縮振動(dòng)峰向高頻移動(dòng)，且羰基伸縮振動(dòng)峰發(fā)生裂分，這是因?yàn)殇\離子與磷酸基團(tuán)發(fā)生了配位作用，并與尿苷酸堿基上的一個(gè)羰基氧原子發(fā)生相互作用。

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