乳酸菌干預(yù)對(duì)帕金森病大鼠α-突觸核蛋白表達(dá)的影響

張萍 邵靚 蔡新勇 肖斌 梅松被

[摘要]目的 探討乳酸菌干預(yù)對(duì)帕金森病大鼠α-突觸核蛋白（α-synuclein）表達(dá)的影響。方法 選取50只SD實(shí)驗(yàn)鼠作為研究對(duì)象，建立帕金森病動(dòng)物模型，隨機(jī)分為對(duì)照組和觀察組，每組各25只。對(duì)照組采用生理鹽水干預(yù)，觀察組采用乳酸菌干預(yù)，觀察兩組α-synuclein表達(dá)，檢測(cè)炎癥因子白介素-6（IL-6），白介素-1β（IL-1β），腫瘤壞死因子-α（TNF-α）的表達(dá)情況。結(jié)果 觀察組α-synuclein表達(dá)水平低于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。干預(yù)前，兩組血清IL-6、IL-1β、TNF-α比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）;干預(yù)2周后，兩組IL-6、IL-1β，TNF-α均低于干預(yù)前，且觀察組均低于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。結(jié)論 乳酸菌的應(yīng)用，可以降低大鼠α-synuclein的水平，抑制其表達(dá)，但是否能促進(jìn)其逆向由腸至腦傳遞中，仍需進(jìn)一步探討。

[關(guān)鍵詞]乳酸菌;大鼠α-突觸核蛋白;逆向由腸至腦傳遞

[中圖分類號(hào)] R742.5? ? ? ? ? [文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼] A? ? ? ? ? [文章編號(hào)] 1674-4721（2019）9（c）-0035-03

[Abstract] Objective To investigate the effect of lactobacillus intervention on the expression of α-synuclein in rats with Parkinson′s disease. Methods A total of 50 SD rats were selected as subjects to establish an animal model of Parkinson′s disease， and randomly divided into control group and observation group， 25 rats in each group. The control group was treated with normal saline， while the observation group was treated with lactic acid bacteria. The expression of α-synuclein， interleukin-6 （IL-6）， interleukin-1β （IL-1β）， and tumor necrosis factor-α （TNF-α） in the two groups were observed. Results The expression level of α-synuclein in the observation group was lower than that in the control group， with statistically difference （P<0.05）. Before intervention， serum IL-6， IL-1β， TNF-α in the control group and the observation group showed no significant difference （P>0.05）. At 2 weeks after intervention， IL-6， IL-1β， TNF-α were lower in both groups than before intervention and the observation group was lower than the control group， the differences were statistically significant （P<0.05）. Conclusion The application of lactic acid bacteria can reduce the level of α-synuclein in rats and inhibit its expression， but whether it can promote its reverse transmission from the intestine to the brain still needs to be further explored.

[Key words] Lactobacillus; Rat α-synuclein; Reverse transmission from intestine to brain

帕金森?。≒D）又稱震顫麻痹，是常見的神經(jīng)退行性疾病，主要病理表現(xiàn)為中腦多巴胺能神經(jīng)元缺失[1]。該病突出的病理改變是中腦黑質(zhì)多巴胺能神經(jīng)元的變性死亡、紋狀體多巴胺含量顯著性減少及黑質(zhì)殘存神經(jīng)元胞質(zhì)內(nèi)出現(xiàn)嗜酸性包涵體（主要成分為α-synuclein蛋白）[2]。然而，其發(fā)病機(jī)制眾說(shuō)紛紜，遺傳因素、環(huán)境因素、年齡老化、氧化應(yīng)激等均可能參與PD多巴胺能神經(jīng)元的變性死亡過(guò)程[3]。本研究以乳酸菌干預(yù)宿主微生物誘導(dǎo)的腸源性PD大鼠模型為基礎(chǔ)，從腸-腦軸上證實(shí)乳酸菌通過(guò)激活巨噬細(xì)胞維持腸道微生物穩(wěn)態(tài)，減少腸源性α-synuclein蛋白的病理表達(dá)及逆向傳遞，探討乳酸菌在腸-腦-PD中的保護(hù)機(jī)制，以期為PD起源及其發(fā)病機(jī)制提供更多的證據(jù)，為PD預(yù)防及治療提供理論基礎(chǔ)和新的策略。

1材料與方法

1.1一般材料

1.1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物? SD大鼠50只，8周齡，雌雄各半，由南昌大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物科學(xué)部提供（實(shí)驗(yàn)動(dòng)物合格證號(hào)：SCXK-2009-2001）。建立PD動(dòng)物模型后，隨機(jī)將全部SD大鼠分為對(duì)照組和觀察組，每組各25只。

1.1.2主要試劑? 多克隆抗體（Upstate公司）;兔抗突觸素多克隆抗體（Santa Cruz公司）;兔抗乳酸脫氫酶（LDH）多克隆抗體（Rockland公司）;鼠抗人α-SYN單克隆抗體（本室制備）;兔抗酪氨酸羥化酶（TH）多克隆抗體（Chemicon公司）。

1.1.3造模過(guò)程? 以不同給藥方法建立PD動(dòng)物模型：①顱內(nèi)直接誘導(dǎo)PD模型：予魚藤酮（河北天順生物工程有限公司，PD 20092307），4 μg/μl，DMSO溶劑，緩慢注入2 μl，立體定向注射制備單側(cè)PD模型以立體定向方式注射到黑質(zhì)致密部（坐標(biāo)：前囟3.08 mm、中線旁1.1 mm、硬膜下4.0 mm），用三棱針進(jìn)行標(biāo)記，用牙科鉆小心鉆透顱骨，按確定坐標(biāo)將微量注射器緩慢進(jìn)針到預(yù)定深度。②腸道微生物誘導(dǎo)PD模型：微生物組飼養(yǎng)2周后連續(xù)給予1 g/L氨芐青霉素1周后再連續(xù)1周注射PD宿主糞便提取物培養(yǎng)的細(xì)菌5×108 cfu入大鼠十二指腸及胃中。③直接病理性α-synuclein腸道誘導(dǎo)PD模型;以pET 3a為載體轉(zhuǎn)染編碼α-synuclein蛋白的質(zhì)粒進(jìn)入大腸桿菌，在LB培養(yǎng)基上繁殖大腸桿菌直到細(xì)菌密度為0.8。用0.5 mM濃度的異丙基硫代半乳糖苷（IPTG）誘導(dǎo)病理性α-synuclein蛋白表達(dá)。根據(jù)Staffan Holmqvist文獻(xiàn)描述方法提取α-synuclein蛋白。將含有α-synuclein蛋白的提取液，注射入大鼠十二指腸及胃中。④腸道魚藤酮誘導(dǎo)PD模型：連續(xù)四周注射魚滕酮3 mg/（kg·d）入大鼠十二指腸及胃中。

1.2方法

觀察組采用乳酸菌（山西省偏關(guān)縣申夏乳酸有限公司，國(guó)藥準(zhǔn)字H10980293）干預(yù)，連續(xù)2周給予5 ml含5×108 cfu的乳酸干酪菌的飲用水。對(duì)照組采用生理鹽水干預(yù)，給予同樣劑量的生理鹽水灌胃。

1.3觀察指標(biāo)

Western blot觀察組織中α-synuclein表達(dá)情況：TH染色觀察中腦黑質(zhì)區(qū)、紋狀體區(qū)及腸上皮神經(jīng)元：TH是多巴胺合成的限速酶，在黑質(zhì)區(qū)主要分布于多巴胺能神經(jīng)元中，多巴胺能神經(jīng)元主要投射到紋狀體區(qū)，TH染色采取普通免疫和熒光免疫后觀察多巴胺能神經(jīng)元的分布情況。

抽取實(shí)驗(yàn)鼠3 ml靜脈血，行抗凝處理，并于1500 r/min環(huán)境下離心處理15 min，靜置10 min后取血清，保存于-20℃的冰箱中，及時(shí)送檢。采用酶聯(lián)免疫吸附法（ELISA）檢測(cè)各炎癥因子水平，包括白介素6（interleukin-6，IL-6），白介素1β（interleukin-1β，IL-1β），腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor，TNF-α）等。

1.4統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

使用SPSS 21.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件處理數(shù)據(jù)，計(jì)量資料采用（x±s）表示，組間比較采用t檢驗(yàn)，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2結(jié)果

2.1兩組α-synuclein表達(dá)水平的比較

干預(yù)2周后，觀察組的α-synuclein表達(dá)水平低于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）（圖1）。

2.2兩組各炎性反應(yīng)指標(biāo)的比較

干預(yù)前，兩組的血清IL-1β、IL-6、TNF-α炎性指標(biāo)比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）;干預(yù)后兩組的血清IL-1β、IL-6、TNFα-均低于干預(yù)前，且觀察組均低于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）（表1）。

3討論

乳酸菌是一種對(duì)宿主有益的活性微生物，是定植于人體腸道、生殖系統(tǒng)內(nèi)，能產(chǎn)生確切健康功效從而改善宿主微生態(tài)平衡、發(fā)揮有益作用[4]。首先，乳酸菌產(chǎn)生的乳酸等有機(jī)酸能顯著降低環(huán)境pH值和氧化還原電位（Eh）值，使腸內(nèi)處于酸性環(huán)境，對(duì)于致病菌如痢疾桿菌、傷寒桿菌、副傷寒桿菌、彎曲桿菌、葡萄球菌等有拮抗作用[5]。其次，產(chǎn)生的過(guò)氧化氫能激活牛乳中的“過(guò)氧化氫酶-硫氰酸”系統(tǒng)，抑制和殺滅革蘭陰性菌、過(guò)氧化氫酶陽(yáng)性細(xì)菌如假單胞菌屬、大腸桿菌類和沙門菌屬等[6]。而且，產(chǎn)生類似細(xì)菌素的細(xì)小蛋白質(zhì)或肽類（抗菌肽），如各種乳酸桿菌素和雙歧菌素，對(duì)葡萄球菌、梭狀芽孢桿菌及沙門菌和志賀菌有拮抗作用[7]。但最重要的是乳酸桿菌能顯著激活巨噬細(xì)胞的吞噬作用，定植在腸道，相當(dāng)于天然自動(dòng)免疫，殺滅腸道有害微生物[8-9]。

乳酸菌刺激巨噬細(xì)胞、誘導(dǎo)產(chǎn)生干擾素、促進(jìn)細(xì)胞分裂及促進(jìn)細(xì)胞免疫等，增強(qiáng)機(jī)體的非特異性和特異性免疫反應(yīng)，提高腸道抗菌能力，維持腸道微生物穩(wěn)態(tài)[10-11]?？诜樗峋?，對(duì)腸道巨噬細(xì)胞的半乳糖甙酶活性、巨噬細(xì)胞的吞噬活性等有顯著的激活和促進(jìn)作用[12]。當(dāng)異物侵入機(jī)體時(shí)，免疫細(xì)胞被乳酸菌激活，增強(qiáng)了宿主腸道對(duì)異物產(chǎn)生抵抗的作用[13-14]。然而，乳酸菌是否能通過(guò)減少宿主腸道微生物誘導(dǎo)的腸源性病理性α-synuclein蛋白表達(dá)，抑制病理性α-synuclein蛋白腸-腦逆向傳遞，進(jìn)而減少PD的發(fā)生，還未有明確結(jié)論[15]。本研究結(jié)果顯示，在實(shí)施乳酸菌治療后，大鼠的α-synuclein表達(dá)水平有了明顯降低，且作用強(qiáng)于生理鹽水，提示乳酸菌在大鼠α-synuclein逆向由腸至腦傳遞作用中，是通過(guò)降低其水平實(shí)現(xiàn)的。另外在IL-1β、IL-6、TNF-α等炎癥因子指標(biāo)，乳酸菌組均低于生理鹽水組，提示了乳酸菌在抑制炎癥反應(yīng)方面的效果。

綜上所述，乳酸菌具有多種功效，定植在腸道，相當(dāng)于天然自動(dòng)免疫。當(dāng)異物侵入機(jī)體時(shí)，免疫細(xì)胞被乳酸菌激活，增強(qiáng)了宿主腸道對(duì)異物產(chǎn)生抵抗的作用。本研究結(jié)果提示，乳酸菌可以通過(guò)減少宿主腸道微生物誘導(dǎo)的腸源性病理性α-synuclein蛋白表達(dá)，抑制病理性α-synuclein蛋白-腸-腦逆向傳遞，進(jìn)而減少PD的發(fā)生。

[參考文獻(xiàn)]

[1]楊斌，楊巍巍，李昕，等.α-突觸核蛋白和硝基化α-突觸核蛋白在不同年齡段食蟹猴結(jié)腸中的表達(dá)[J].首都醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào)，2014，35（2）：214-218.

[2]Delamarre A，Meissner WG.Epidemiology，environmental risk factors and genetics of Parkinson′s disease[J].Presse Med， 2017，46（2Pt1）：175-181.

[3]Tysnes OB，Storstein A.Epidemiology of Parkinson′s disease[J].J Neural Transm （Vienna），2017，124（8）：901-905.

[4]何婧，黃燕，杜果，等.慢性腦低灌注致模型大鼠學(xué)習(xí)記憶受損及海馬α-突觸核蛋白變化[J].中國(guó)組織工程研究，2018，22（20）：3230-3236.

[5]Lee JM，Derkinderen P，Kordower JH，et al.The search for a peripheral biopsy indicator of α-synuclein pathology for Parkinson disease[J].J Neuropathol Exp Neurol，2017，76（1）：2-15.

[6]黃寧?kù)o，Wei JN，李文濤.止顫湯參與帕金森病大鼠自噬途徑中P62調(diào)節(jié)α-突觸核蛋白的研究[J].中西醫(yī)結(jié)合心腦血管病雜志，2017，15（21）：2689-2692.

[7]Stokholm MG，Danielsen EH，Hamilton-Dutoit SJ，et al.Pathological α-synuclein in gastrointestinal tissues from prodromal Parkinson disease patients[J].Ann Neurol，2016，79：940-949.

[8]許文年.左旋多巴對(duì)帕金森病大鼠海馬區(qū)酪氨酸羥化酶及α-突觸核蛋白表達(dá)的影響[J].中國(guó)老年學(xué)雜志，2016， 36（7）：1556-1558.

[9]Kab S，Spinosi J，Chaperon L，et al.Agricultural activities and the incidence of Parkinson′s disease in the general French population[J].Eur J Epidemiol，2017，32（3）：203-216.

[10]陳施吾，王剛.帕金森病與腸道菌群關(guān)系的研究進(jìn)展[J].內(nèi)科理論與實(shí)踐，2018，13（5）：61-64.

[11]趙振向，李曄，劉怡琳，等.帕金森病腸道起源的研究進(jìn)展[J].山東醫(yī)藥，2017，57（12）：107-109.

[12]Sampson TR，Debelius JW，Thron T，et al.Gut microbiota regulate motor deficits and neuroinflammation in a model of Parkinson′s disease[J].Cell，2016，167（6）：1469-1480.

[13]畢樹立，劉斌，高海英.左旋多巴對(duì)帕金森病模型大鼠結(jié)腸酪氨酸羥化酶和ɑ-突觸核蛋白表達(dá)的影響[J].疑難病雜志，2014，12（10）：1047-1050.

[14]胡景霞，白波.腦-腸-微生物群軸與帕金森病[J].濟(jì)寧醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào)，2016，39（2）：77-81.

[15]Hill-Burns EM，Debelius JW，Morton JT，et al.Parkinson′s disease and Parkinson′s disease medications have distinct signatures of the gut microbiome[J].Mov Disord，2017，32（5）：739-749.

（收稿日期：2019-04-24? 本文編輯：崔建中）