DNS法測定金針菇粗多糖含量的研究

秦瑞鑫 孫玉帥 朱奕彤 穆秀燕 張玉苗

摘要：為測定金針菇中總的粗多糖含量，采用熱水提取法提取了金針菇多糖，通過二硝基水楊酸顯色法，以葡萄糖為對照，測定了還原糖和總糖的含量，二者差值即為總的粗多糖含量。結(jié)果表明：金針菇中粗多糖含量為0.05mg/mL;DNS法的重復(fù)性、穩(wěn)定性、加樣回收均較好，提高了試驗的準(zhǔn)確度和效率。DNS法操作簡單，所受干擾較少，適合于快速測定金針菇樣品中總的粗多糖含量。

中圖分類號：R284.2 文獻標(biāo)識碼：A 文章編號：1674-9944（2019）18-0173-03

1引言

金針菇（Flammulinavelutiper）又名冬菇，隸屬白菇科、金線菌屬，是一種食藥兩用菌，廣泛分布于世界各地。金針菇味道鮮美，富含蛋白質(zhì)和多種活性營養(yǎng)物質(zhì)。其中，精氨酸和賴氨酸含量較高，有利于促進兒童智力發(fā)育，因此金針菇也被稱為“益智菇。

金針菇多糖作為其主要活性營養(yǎng)物質(zhì)之一，具有抗氧化、抗腫瘤、抑菌、抗衰老等多種功效，被廣泛應(yīng)用于醫(yī)藥和食品加工等領(lǐng)域。目前，廣大研究者對于金針菇多糖的研究主要集中在分離純化、結(jié)構(gòu)探析、相關(guān)產(chǎn)品開發(fā)等方面。金針菇粗多糖的提取及快速測定是開展相關(guān)研究工作的基礎(chǔ)。目前，常用的金針菇多糖提取方法有單一酶法、超聲波法、微波法。但上述方法對設(shè)備要求較高，酶易失活等缺點很難應(yīng)用到實際食用菌多糖工業(yè)生產(chǎn)中。熱水提取法操作簡單、成本較低、靈活性強，為解決上述問題提供了途徑。

目前，常用于多糖測定的傳統(tǒng)方法有苯酚一硫酸法和蒽銅一硫酸法，但上述方法無法排除還原糖對測得結(jié)果的影響，且濃硫酸具有強腐蝕性，應(yīng)用極為不便。DNS法利用在偏堿性條件下，還原糖和總糖分別與3，5一二硝基水楊酸發(fā)生顯色反應(yīng)，從而可以準(zhǔn)確、快速測定出還原糖與總糖的含量，二者差值即為多糖含量。DNS法目前已廣泛應(yīng)用于多糖含量的測定。但DNS法快速測定金針菇多糖的報道較少，為此，本試驗采用熱水提取法和DNS法來測定金針菇中多糖含量，為金針菇多糖的相進一步開發(fā)利用提供參考。

2材料與方法

2.1材料與試劑

金針菇子實體、蒸餾水、無水乙醇、氯仿、酒石酸鉀鈉、苯酚、3，5～二硝基水楊酸、鹽酸、氫氧化鈉，試劑均為分析純。

2.2儀器與設(shè)備

電子天平、電熱恒溫干燥箱、離心機、植物組織研磨機、紫外分光光度計、恒溫水浴箱。

2.3方法

2.3.1標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

將葡萄糖放置于干燥箱中，105℃干燥至恒重，用天平準(zhǔn)確稱取100mg置于燒杯中，加入少量蒸餾水溶解，定容至100mL，充分混勻，即可得濃度為1mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)葡萄糖溶液。用移液槍準(zhǔn)確吸取0.2mL、0.4 mL、O·6mL、0.8mL、1.0mL、1.2mL的標(biāo)準(zhǔn)葡萄糖溶液分別放置于25mL容量瓶中，加蒸餾水至刻度線，充分搖勻。分別移取1mL于6支潔凈試管中，加入去離子水1mL，DNS試劑2mL。搖勻后置于沸水浴加熱5min。取出后迅速冷卻至室溫，另取一潔凈試管，加入蒸餾水，做空白對照。

將以上溶液移人比色皿，設(shè)定紫外分光光度計的波長為490nm，測得吸光值。以葡萄糖質(zhì)量X為橫軸，吸光度y為縱軸繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

2.3.2金針菇粗多糖的提取

對所購置的金針菇進行洗凈、晾干，在55℃條件下對金針菇進行干燥至恒重，放入研缽中粉碎后放入組織研磨機進行研磨，過40目篩子，對已篩取的粉末裝袋。

準(zhǔn)確稱取20.00g粉末置于550mL圓底燒瓶中，加入200mL蒸餾水，二者混合均勻后，煮沸1h，此過程中用玻璃棒攪拌3～4次，后經(jīng)40目篩子。將留在篩子上的糊狀物重新放入蒸餾燒瓶中，加入100mI。水。重復(fù)上述步驟3次。合并蒸煮液并蒸餾濃縮至原來的1/3體積。

將上述得到的濃縮液上機離心，4000r/min，離心兩次，每次時間為5min，棄沉淀。向所得溶液中加入15mL 80%的乙醇，相同條件離心兩次，65℃條件下將沉淀烘干，得粗多糖，后研磨至粉末，保存?zhèn)溆谩?/p>

2.3.3金針菇粗多糖含量的測定

（1）金針菇粗多糖溶液的制備：精確稱取200mg粗多糖粉末，用少量蒸餾水溶解后置于100mL容量瓶中，加水至刻度線，搖勻，即得。

（2）還原糖溶液的制備：準(zhǔn)確量取上述溶液5mI，置于10mL容量瓶中，加酚酞指示液一滴，再加入15%氫氧化鈉溶液直至溶液至微紅色，加純水定容至刻度，充分搖勻，即得此溶液。

（3）總糖溶液的制備：準(zhǔn)確量取供試溶液1mL置于潔凈試管中，加入蒸餾水1mL和7mol/L鹽酸溶液2mL，沸水浴加熱5min后常溫冷卻，加入一滴酚酞指示液，再加入15%氫氧化鈉溶液，直至溶液出現(xiàn)微紅色，轉(zhuǎn)移至25mL容量瓶中，定容搖勻，即可。

（4）空白溶液的制備：取2.5mL水加2mL DNS溶液，混勻，沸水浴中加熱5min，待其冷卻至室溫，轉(zhuǎn)移至25mL容量瓶中，用蒸餾水定容至刻度線。

（5）顯色和比色：吸取上述溶液1mL至試管中，加入蒸餾水1mL，DNS試劑2mL，充分混勻后置于沸水浴中5min。取出后迅速冷卻至室溫，加入蒸餾水定容至25mL。以空白溶液作對照，于490nm處測定溶液的吸光值。

3結(jié)果與分析

3.1標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立

由圖1可以得出，葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線的回歸方程為：y=5.26X-0.0382，R²=0.9997，表明在0.02～0.12mg范圍內(nèi)，葡萄糖質(zhì)量與吸光度之間呈現(xiàn)出良好的線性關(guān)系。

3.2粗多糖含量測定

準(zhǔn)確量取金針菇粗多糖溶液5份，制備還原糖溶液以及總糖溶液各5份，按照2.3.3節(jié)中“顯色和比色”進行處理，依據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線，結(jié)果為還原糖平均含量為0.054mg，RSD=1.25%，總糖平均含量為0.104mg，RSD=2.74%;重復(fù)性良好（表1）。因此，依據(jù)“粗多糖含量=總糖含量一還原糖含量”即得粗多糖含量為0.05mg。

3.3穩(wěn)定性試驗

準(zhǔn)確量取金針菇粗多糖溶液5份，制備還原糖溶液以及總糖溶液，分別在制備后O、0.5h、1h、1.5h、2h測定吸光度，按照2.3.3節(jié)中“顯色與比色”進行處理，結(jié)果為還原性糖RSD=0.61%，總糖RSD=0.40%，說明在2h內(nèi)穩(wěn)定性良好（見表2）。

3.4加樣回收試驗

準(zhǔn)確量取金針菇粗多糖溶液5份，制備還原糖溶液以及總糖溶液，測定吸光度;結(jié)果為還原糖的平均回收率為99.68%，RSD=1.05%，;總糖的平均回收率為100.34%，RSD=1.30%（表3）。

4結(jié)語

本試驗中利用3，5一二硝基水楊酸在偏堿性條件下分別與還原糖及多糖水解產(chǎn)生的還原糖發(fā)生顯色反應(yīng)，并在一定濃度范圍內(nèi)，還原糖濃度和溶液顏色呈現(xiàn)正相關(guān)，通過比色法測定總糖和還原糖的含量，利用二者的差值間接求得金針菇多糖含量。DNS法可避免金針菇中原本存在的還原糖對本試驗所產(chǎn)生的干擾。另外，從本試驗結(jié)果來看DNS法的重復(fù)性，穩(wěn)定性，加樣回收均較好，提高了試驗的準(zhǔn)確度和效率。因此，DNS法和熱水提取法相結(jié)合可作為快速測定金針菇多糖的方法。