馬比木根莖提取物黃酮和三萜含量及其降糖活性

楊艷 高漸飛 王麗 張凡 周瑋

摘要：為探索馬比木根莖中總黃酮和總?cè)坪考捌湟葝u素抵抗降糖活性，對其采用甲醇提取測定根、莖總黃酮和總?cè)坪?，用HepG2細(xì)胞制備胰島素抵抗降糖模型，進(jìn)行了降糖活性的檢測。結(jié)果顯示：根中總黃酮含量（204.75mg/g）高于莖中含量（114mg/g）;總?cè)频暮扛校?45mg/g）低于莖中含量（225.17mg/g）。采用MTT法對HepG2細(xì)胞進(jìn)行活力檢測，排除提取物溶劑及提取物的細(xì)胞毒性，且細(xì)胞活性良好，具有消耗葡萄糖的能力。與陽性藥二甲雙胍進(jìn)行降糖活性對照，根一莖提取物的不同劑量的降糖活性均優(yōu)于陽性藥。根提取物的降糖活性優(yōu)于莖提取物，這與總黃酮的含量結(jié)果一致，說明降糖活性與總黃酮具有正相關(guān)的作用。實驗結(jié)果說明了總黃酮的降糖活性優(yōu)于總?cè)频慕堤腔钚?。這為馬比木資源的再利用提供新的思路和途徑，既開拓了馬比木功效利用的短板，又減少了馬比木資源的過度消耗和浪費(fèi)。

關(guān)鍵詞：馬比木;總黃酮;總?cè)?MTT;降糖活性

中圖分類號：R975 文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A 文章編號：1674-9944（2019）18-0167-04

1引言

馬比木（Notha podytes P2ittosporoides oliv.sleum）為茶茱萸科植物海桐假柴龍樹，分布于貴州、湖北、四川、湖南等地。馬比木植株因其根部含有喜樹堿及喜樹堿的甲氧基衍生物，具有較好的抗腫瘤活性，已經(jīng)成為了抗腫瘤藥物的主要原材料之一。隨著市場對喜樹堿及其衍生物需求量的增長和國家對喜樹植株的重點(diǎn)保護(hù)，馬比木作為喜樹堿新藥源的主要原料來源，越來越受到關(guān)注。如早有大量文獻(xiàn)報道了馬比木中喜樹堿含量測定及其提取工藝等，但其他方面尤其活性研究起步相對稍晚，鮮有報道。

馬比木根（藥商只收購根及主干地面向上不超過30cm）被用于提取喜樹堿，其他部位因含量低而被遺棄，資源利用率較低。為探索拓寬資源利用口徑及提搞馬比木資源利用率的方式，對馬比木根、莖提取物中總黃酮和總?cè)频暮窟M(jìn)行了測定，同時根據(jù)總?cè)坪涂傸S酮具有抗氧化，抗心血管疾病、雌激素樣與抗雌激素樣的作用、降血脂、降血糖、抗疲勞、調(diào)節(jié)免疫力等作用，選擇其中的降血糖作用進(jìn)一步探討，旨為其資源綜合科學(xué)利用提供參考。

2材料與方法

2.1材料

根、莖采于貴州黔東南州麻江縣，經(jīng)鑒定為茶茱萸科海桐假柴龍樹屬植物馬比木;其中根為地下顏色呈金黃色起以下部位，莖為出土主干處往上約50cm。HepG2細(xì)胞購自北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院細(xì)胞庫，人胰島素（批號：19278MSDS）購自美國Sigma公司，DMEM培養(yǎng)基（貨號：11965092）購自Life TeehnoIogies Corpo-ration，胰酶（貨號：05171009）購自CAISSON LABORATORIES.INC，胎牛血清（批號：20170223）浙江天柱生物科技股份有限公司，四甲基偶氮噻唑鹽（MTT，M2128MSDS）購自美國Sigma公司，葡萄糖測定試劑盒一氧化酶法（批號：20171004147）購自上海榮盛生物有限公司，二甲雙胍（貨號：D150959MSDS）購自美國Sigma公司，地塞米松（貨號：D4902MSDS）購自美國Sigma公司，蘆?。ㄅ枺篊27H30016）購自中國藥品生物制品檢定所，齊墩果酸（批號：C30H4803）購自中國藥品生物制品檢定所。

2.2儀器與設(shè)備

電子分析天平（北京賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司）、超聲儀（寧波新芝生物科技股份有限公司）、UV-1800紫外可見分光光度計（島津儀器（蘇州）有限公司）、TDL-40C低速臺式離心機(jī)（上海安亭科學(xué)儀器廠）、生物安全潔凈柜（BHC-1300A/B3）蘇州凈化設(shè)備有限公司、CO2培養(yǎng)箱（CCL-170A-8ESC0）杭州諾丁科學(xué)器材有限公司、酶標(biāo)儀（BG-XM496）常州三豐儀器科技有限公司。

2.3方法

2.3.1馬比木根與莖提取液的制備

將馬比木根、莖粉碎過篩，分別精密稱取2g馬比木根、莖粉末，分別置于150mL，具塞三角瓶中，以70%甲醇為溶劑按1;60的料液比，密塞，靜置15h，超聲處理30min，加熱回流1.5h，待溶液冷卻至室溫后，過濾，將濾液減壓濃縮用70%甲醇定容至50mL，備用。

2.3.2對照品溶液的制備

精密稱取總黃酮對照品蘆丁4.2mg于5mL的容量瓶中，加甲醇溶解并定容，配制成濃度為0.84mg/mL的對照品儲備液;精密稱取總?cè)茖φ掌俘R墩果酸5.0mg于5mL的容量瓶中，加甲醇溶解并定容，配制成濃度為1.0mg/mL的對照品儲備液。

2.3.3檢測波長的選擇

（1）總黃酮波長的選擇。取對照品溶液和供試品溶液各1.0mL，分別置于10mL容量瓶中，加入5%亞硝酸鈉0.4mL，放置6min后，加入10%硝酸鋁0.4mL，放置6min后，再加入4%氫氧化鈉4mL，加蒸餾水至刻度線，搖勻，放置15min后，進(jìn)行全波長掃描，在510nm處有最大吸收波長，故選用510nm作為檢測波長。

（2）總?cè)撇ㄩL選擇。取對照品溶液和供試品溶液各1.0mL，于100℃水浴揮干，各加5%香草醛一冰醋酸溶液0.4mL，高氯酸1.8mL，搖勻，置70℃水浴中放置15min，取出，4℃冷卻5min，加冰醋酸5mL，搖勻，使之反應(yīng)，10min后置比色皿中，以冰醋酸為空白溶液，在190～700nm掃描，結(jié)果在584nm處對照品與供試品的吸收均較大，故選用584nm作為檢測波長。

2.3.4提取液中總黃酮和總?cè)频暮繙y定

（1）總黃酮的含量測定。準(zhǔn)確吸取黃酮標(biāo)準(zhǔn)品蘆丁溶液0.2、0.4、0.6、0.8、1.0mL，分別置于10mL容量瓶中，按2.3.3節(jié)的測定方法，在波長510nm下制訂標(biāo)準(zhǔn)曲線。準(zhǔn)確吸取馬比_木根與莖的提取液1.0mL，置于10mL容量瓶，按上述的測定方法測定吸光度值，以標(biāo)準(zhǔn)曲線計算馬比木根與莖中總黃酮的含量。

（2）總?cè)频暮繙y定。準(zhǔn)確吸取三萜標(biāo)準(zhǔn)品齊墩果酸溶液0.2、0.4、0.6、0.8、1.0mL，分別置于10mL容量瓶中，按照2.3.3節(jié)的測定方法，在波長584nm下得出齊墩果酸濃度與吸光度的標(biāo)準(zhǔn)曲線。準(zhǔn)確吸取馬比木根與莖的提取液1_0mL，置于10mL容量瓶，按照2.

3.3節(jié)的測定方法測定吸光度值，以標(biāo)準(zhǔn)曲線計算馬比木根與莖中總?cè)频暮俊?/p>

2.3.5MTT法測試細(xì)胞活力

按照細(xì)胞培養(yǎng)方法培養(yǎng)HepG2細(xì)胞，將處于對數(shù)生長期的細(xì)胞消化后，用高糖DMEM培養(yǎng)基調(diào)整細(xì)胞密度為1×10⁵個·mL^-1，轉(zhuǎn)入96孔板中。37℃5%CO2恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h后，棄去舊培養(yǎng)基加入新配制的高糖DMEM培養(yǎng)基，將細(xì)胞隨機(jī)分為空白組、模型組、溶劑組、樣品組在37℃5%CO2恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h。在不同組別中每孔加入5mg·mL^-MTT溶液20gL，繼續(xù)孵育4h，棄去上清，吸干殘留液，每孔加入DMSO 150uL，37℃5%CO2恒溫培養(yǎng)10min至生成的藍(lán)紫色甲瓚結(jié)晶完全溶解，置于酶標(biāo)儀570nm處測其吸光度值，檢測HepG2細(xì)胞的活力。

2.3.6降糖活性研究

按照2.3.5節(jié)方法制備96孔板，將細(xì)胞隨機(jī)分為空白組、胰島素組、模型組、樣品組和二甲雙胍組。在胰島素組加入10uL的生理鹽水，在模型組、樣品組和二甲雙胍組加入10uL的地塞米松（濃度10～10tool/L）37℃5%CO2恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h;棄去培養(yǎng)基70uL換以60uL新鮮培養(yǎng)基，除空白組和胰島素組（加入70uL培養(yǎng)基）外其他組均加入10uL胰島素（濃度10-8），樣品組再加10uL樣品，37℃5%CO2恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h;將上述細(xì)胞液轉(zhuǎn)移10uL至新的96孔板中，加入葡萄糖氧化酶混合液培養(yǎng)15min，于酶標(biāo)儀505nm處測葡萄糖的吸光度（A），根據(jù)葡萄糖消耗量衡量其降糖活性。以不含細(xì)胞的空白孔為空白對照。

3結(jié)果與分析

3.1標(biāo)準(zhǔn)曲線分析

蘆丁和齊墩果酸標(biāo)準(zhǔn)品溶液分別移取0.2、0.4、0.6、0.8、1.0mL計算出濃度，制備以濃度為橫坐標(biāo)，吸光度為縱坐標(biāo)的標(biāo)準(zhǔn)曲線（圖1～圖2），蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程為：y=1.4614X+0.0499，R=0.9841;齊墩果酸標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程為：y=1.3351X+0.0018，R=0.9935。由圖可知兩種標(biāo)準(zhǔn)物5個不同濃度的點(diǎn)均勻分散在線性回歸方程附近，線性關(guān)系良好，可用于馬比木提取液中總黃酮和總?cè)频暮繙y定。

3.3總黃酮和總?cè)频暮?/p>

馬比木根與莖提取液定容至50mL，移取1mL進(jìn)行總?cè)坪涂傸S酮的含量測定，做3份平行，確保檢測結(jié)果準(zhǔn)確性。測試結(jié)果顯示馬比木根莖提取物中總黃酮和總?cè)坪枯^高，但根和莖中兩類物質(zhì)的含量有所差異，根中總黃酮含量（204.75mg/g）高于莖（114mg/g）;而總?cè)频暮扛校?45mg/g）低于莖中含量（225.17mg/g）表1。

3.3細(xì)胞活躍度的影響

采用MTT法對不同組別HepG2細(xì)胞活力的考察，其吸光度值與細(xì)胞活力成正比。在空白組，溶劑組，樣品組和模型組分別加入MTT試劑，溫度37℃5%CO：恒溫培養(yǎng)4h，加入DMSO 150gL以后會出現(xiàn)藍(lán)色的沉淀，說明該細(xì)胞是有活力的，若加入DMSO以后無顏色變化，則說明細(xì)胞沒有活力，將不會消耗糖，從而數(shù)據(jù)沒有參考價值。如圖3所示：與空白組相比，模型組對細(xì)胞沒有明顯的抑制，細(xì)胞活力良好。對于樣品組（根和莖提取液）來說，樣品加入96空板中的濃度為1mg/mL，0.2mg/mL，0.04mg/mL，高劑量的樣品組對細(xì)胞活力有明顯的抑制作用，中劑量組和低劑量組對細(xì)胞沒有抑制作用。對于溶劑組來說，當(dāng)溶劑的含量為10%時，具有細(xì)胞毒性，當(dāng)溶劑的含量為1%，0.1%時，不具有細(xì)胞毒性。說明溶劑DMSO在濃度范圍大于10%內(nèi)具有細(xì)胞毒性。鑒于高劑量的提取物濃度或者高含量的溶劑具有HepG2細(xì)胞毒性或者對HepG2細(xì)胞具有明顯的抑制作用，調(diào)整溶劑和確定提取物的濃度。

3.4提取物對細(xì)胞模型的影響

根據(jù)3.3節(jié)細(xì)胞活力的檢測結(jié)果調(diào)整馬比木根與莖提取物的濃度為0.2mg/mL，0.04mg/mL，溶劑DMSO的含量在1%以下，進(jìn)行提取物的降糖活性檢測。與空白組相比較，模型組中葡萄糖含量低于空白組顯著高于胰島素組;說明胰島素抵抗模型造模成功;由圖4可知，兩個劑量組不管是提取物還是溶劑對細(xì)胞沒有明顯的抑制作用，細(xì)胞活力度良好，具有消耗葡萄糖的能力，進(jìn)而葡萄糖的含量明顯降低。從而可得出馬比木根、莖提取物具有明顯的胰島素抵抗的降糖作用。馬比木根、莖兩部分提取物中劑量降糖活性高于低劑量，說明在一定范圍內(nèi)提取物的降糖活性呈劑量依懶性。根提取物的降糖活性高于莖提取物（圖4）。馬比木根中總黃酮的含量高于莖中，這與降糖作用結(jié)果一致;卻與三萜含量大小關(guān)系相反。這一定程度說明黃酮的降糖作用高于三萜，但其降糖機(jī)制有待進(jìn)一步研究。

4結(jié)論與討論

本研究測定了馬比木中總黃酮和總?cè)频暮?，發(fā)現(xiàn)其在馬比木中的含量相當(dāng)可觀，但是也有所差別，在馬比木不同的部位總黃酮和總?cè)频暮坎煌?，總黃酮在根中的含量高于莖中，總?cè)频暮吭诟械暮康陀谇o中。降糖模型中，樣品組的細(xì)胞活力低于空白組不僅是溶劑DMSO的毒性，還有馬比木提取物中有抗癌物質(zhì)的存在，對癌細(xì)胞有殺傷作用，所以，樣品組中細(xì)胞活力度低于空白組。馬比木根莖提取物具有較好的降糖活性，其活性優(yōu)于陽性藥二甲雙胍。由于總黃酮和總?cè)圃隈R比木不同部位的含量不同，兩個部位的降糖活性也有所差別：總體來說根提取物的降糖活性優(yōu)于莖提取物的降糖活性，這與總黃酮的含量高低呈正相關(guān)，從而說明總黃酮的降糖活性優(yōu)于總?cè)频慕堤腔钚浴８锌傸S酮的含量幾乎是莖中的兩倍，但降糖活性無此線性關(guān)系，說明總?cè)埔簿哂幸欢ǖ慕堤腔钚?，卻無總黃酮的活性好。提取物中參與降糖活性的具體成分尚不明確有待進(jìn)一步的研究。本研究對馬比木的活動提供了補(bǔ)充，也為其資源的利用提供了新的思路。