響應(yīng)面優(yōu)化馬比木喜樹堿提取工藝

周瑋 楊艷 張凡 高漸飛

摘要：在現(xiàn)已優(yōu)化出的馬比木喜樹堿提取工藝基礎(chǔ)上，采用同一產(chǎn)地樣品，分別以7個(gè)濃度梯度（40%～100%）的甲醇、乙醇為提取液，實(shí)驗(yàn)篩選出提取率最高的提取液為70%的甲醇;進(jìn)一步比較了目前馬比木喜樹堿提取的4幾種方法，提取效率值顯示浸泡超聲熱回流提取法最優(yōu)。在此基礎(chǔ)上，利用響應(yīng)面法對(duì)提取工藝進(jìn)行了進(jìn)一步優(yōu)化，獲得了最佳提取工藝為：浸泡時(shí)間14.80h.超聲時(shí)間30.70，液料比為60.00，70℃水浴中回流1.5h。在此工藝條件下，喜樹堿含量為2.29%，回歸得到的模型預(yù)測(cè)效果較好。將優(yōu)化工藝用于提取12個(gè)產(chǎn)地的馬比木喜樹堿含量，將其與文獻(xiàn)報(bào)道的相同區(qū)域樣品所測(cè)得最高含量比較，優(yōu)化出的工藝測(cè)得含量是其他工藝的2.4至10倍，大幅度提高了喜樹堿提取率。具有明顯優(yōu)越性。

關(guān)鍵詞：馬比木;喜樹堿;響應(yīng)面優(yōu)化;提取工藝

中圖分類號(hào)：R975 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A 文章編號(hào)：1674-9944（2019）18-0163-05

1引言

茶茱萸科植物馬比木（Nothapodytes Pittosporoides）系海桐假柴龍樹，灌木或小喬木，分布于貴州、湖南、湖北、四川等地。馬比木全草人藥，是一種重要的藥用植物，人藥能祛風(fēng)除濕、理氣散寒，主治風(fēng)寒濕痹、浮腫、疝氣、小兒驚風(fēng)、半身不遂、風(fēng)濕痹痛、跌打損傷以及浮腫等。馬比木植株含有喜樹堿，臨床上主要用于治療消化系統(tǒng)惡性腫瘤，為極具價(jià)值的抗腫瘤藥物資源。且馬比木根中喜樹堿的含量相對(duì)較高，一般都在0.1%～0.6%之間，高于喜樹果中喜樹堿的含量0.118%～O。190%。馬比木含有喜樹堿的發(fā)現(xiàn)，以及較低原料成本和較高的含量，使其成為提取喜樹堿的重要原料，一定程度上緩解了對(duì)喜樹資源的依賴。但馬比木對(duì)生長(zhǎng)環(huán)境要求更為嚴(yán)格，生長(zhǎng)緩慢，產(chǎn)量有限，且目前藥用部位為根，必須對(duì)樹木進(jìn)行砍伐后采挖，極其不可持續(xù)。據(jù)報(bào)道中國(guó)湘西地區(qū)2008～2012年對(duì)外出售的馬比木根達(dá)1000t，無(wú)序的采挖導(dǎo)致該地區(qū)資源日欲瀕危;此時(shí)段貴州東北部（銅仁萬(wàn)山區(qū)、松桃縣、印江縣等）馬比木種植資源也遭受毀滅性采挖，資源安全已受到嚴(yán)重威脅。目前，在無(wú)規(guī)?；灾?，以及沒弄清人工栽植條件下喜樹堿含量的狀況下，提高資源利用效率將是十分重要的途徑，這就需要落實(shí)到喜樹堿提取工藝優(yōu)化上來(lái)。

國(guó)內(nèi)對(duì)馬比木中喜樹堿提取分離和含量測(cè)定的研究已有報(bào)道。提取方法可總結(jié)如下：①浸泡，超聲提取;②浸泡，熱回流提取;③直接熱回流提取;④室溫浸泡提取提取;⑤堿法提取;⑥酸法提取;提取溶劑為甲醇、乙醇，還有酸、堿、樹脂等。鄭涓等以重慶黔江的馬比木根為樣品，甲醇為溶劑，采用浸泡，熱回流提取;通過單因素及正交試驗(yàn)，確定最優(yōu)提取工藝為提取溶劑70%的甲醇，溫度為70℃，提取時(shí)間1.5h;根中喜樹堿的提取率0.16%。白永花等以湖南省鳳凰縣為樣品，同時(shí)采用乙醇（80%）熱回流提取法、乙醇（80%）室溫浸泡提取法、甲醇（95%）熱回流提取法、堿法提取、酸法提取，得出用80%乙醇溶液室溫浸泡提取3次，每次24 h，前12h每隔1小時(shí)超聲1次（功率260w，頻率40 kHz，每次5min）提取率最高，為0.944%。但上述結(jié)果，由于樣品產(chǎn)地及取樣時(shí)間不同[馬比木不同產(chǎn)地及季節(jié)喜樹堿含量不同，且用的提取方法和使用的提取溶劑、濃度不同，其結(jié)果間可比性差，難以判定究竟哪種提取工藝更有優(yōu)越性。此外，當(dāng)前提取工藝的研究中，浸泡、超聲等都有利于喜樹堿的細(xì)胞穿透、浸出，但沒有一個(gè)優(yōu)化的條件。為此，本文采用同一樣品，用7個(gè)濃度級(jí)（40%、50%、60%、70%、80%、90%、100%）的甲醇、乙醇作為提取溶劑、采取文獻(xiàn)報(bào)道過的提取方法（工藝條件）進(jìn)行提取效率比較，確定最佳提取溶劑、濃度以及提取工藝。在此基礎(chǔ)上，進(jìn)一步探究料液比、浸泡和超聲時(shí)間對(duì)提取喜樹堿的效果的影響，通過響應(yīng)面探尋馬比木中喜樹堿提取更有效的工藝和技術(shù)，為提升馬比木資源利用效率及獲得更大經(jīng)濟(jì)收益提供科技支撐。

2材料與方法

2.1儀器與材料

Agilent分析型高效液相色譜儀;BS210S型電子天平;XFB-500高速中藥粉碎機(jī);DK-98-11型水浴鍋;喜樹堿（對(duì)照品），純度為98%以上;提取時(shí)所用甲醇、乙醇、分析純，HPLC所用甲醇、乙腈為色譜純，水為娃哈哈純凈水。

馬比木測(cè)試樣品分別于2016年12月，2017年1月、2月、3采自貴州省松桃縣、萬(wàn)山區(qū)、江口縣、播洲區(qū)、麻江縣，湖南省吉首市、古丈縣、鳳凰縣、永順縣、保靖縣，其GPS坐標(biāo)見表5。其中貴州省5個(gè)產(chǎn)地樣品由貴州省山地資源研究所采集鑒定;湖南省7個(gè)產(chǎn)地樣品由吉首大學(xué)醫(yī)學(xué)院呂江明教授采集鑒定。工藝優(yōu)化樣品來(lái)源12個(gè)樣品之一（樣品11，來(lái)源湖南省鳳凰縣吉信鎮(zhèn)萬(wàn)溶江村）。

2.2提取方法

將采集來(lái)的馬比木根晾干，粉碎過60目篩，備用。在鄭涓等口優(yōu)化出的提取工藝基礎(chǔ)上，用不同濃度梯度的甲醇和乙醇進(jìn)行喜樹堿的提取，確定最佳濃度的提取溶劑，然后采用以下4種方法，對(duì)馬比木根中喜樹堿進(jìn)行提取。

2.2.1溶劑的選擇（浸泡超聲提取法）

將粉碎好的樣品統(tǒng)一稱取1g，按照料液比1：60加入不同濃度的甲醇和乙醇，濃度分別為90%、80%、70%、60%、50%、40%。室溫浸泡12h，超聲30min，補(bǔ)重，過濾，利用HPLC測(cè)定溶液中喜樹堿的峰面積。

2.2.2方法1（浸泡超聲提取法）

將粉碎好的樣品1g，加入2.2.1節(jié)優(yōu)化的溶劑及濃度，室溫浸泡12h，超聲30min，補(bǔ)重，過濾，利用HPLC測(cè)定溶液中喜樹堿的峰面積。

2.2.3方法2（熱回流提取法）

將粉碎好的樣品1g，加入2.2.1節(jié)優(yōu)化的溶劑及濃度，在70℃水浴中回流1.5h，補(bǔ)重，過濾，利用HPLC測(cè)定溶液中喜樹堿的峰面積。

2.2.4方法3（浸泡熱回流提取法）

將粉碎好的樣品1g，加入2.2.1節(jié)優(yōu)化的溶劑及濃度，室溫浸泡12h，在70℃水浴中回流1.5h，補(bǔ)重，過濾，利用HPLC測(cè)定溶液中喜樹堿的峰面積。

2.2.5方法4（浸泡超聲熱回流提取法）

將粉碎好的樣品1g，加入2.2.1節(jié)優(yōu)化的溶劑及濃度，室溫浸泡12h，超聲30min，在70℃水浴中回流1.5 h，補(bǔ)重，過濾，利用HPLC測(cè)定溶液中喜樹堿的峰面積。

2.2.6正交試驗(yàn)

在已確定出的溶劑及提取方法基礎(chǔ)上，增加浸泡時(shí)間、超聲時(shí)間、液料比3個(gè)影響因子，按照正交試驗(yàn)進(jìn)行3因素5水平優(yōu)化實(shí)驗(yàn)。

2.3對(duì)照品制備

取喜樹堿的對(duì)照品適量，精密稱定，加色譜甲醇制成濃度為0.6mg·mL^-1的對(duì)照品儲(chǔ)備液，避光保存，備用。利用HPLC測(cè)定喜樹堿對(duì)照品的峰面積，進(jìn)樣量分別為：25、30、35、40、45、50uL。

2.4色譜條件

色譜柱：Waters Symmetry C 18（4.6mm×250 mm，5um）;流動(dòng)相：甲醇一水（55l 45）;流速：1.0mL·min^-1;檢測(cè)波長(zhǎng)：254nm：柱溫：26℃;進(jìn)樣量：40uL。該色譜條件下喜樹堿對(duì)照品的色譜圖見圖1。

3結(jié)果與分析

3.1提取溶液及濃度

由表1結(jié)果可見，在相同的條件下，甲醇和乙醇提取喜樹堿面積存在差異性，甲醇提取率優(yōu)于乙醇。

不同甲醇和乙醇提取效率特征表現(xiàn)為：甲醇濃度為40%～70%時(shí)喜樹堿的峰面積隨著溶劑濃度的提高而增加，溶劑濃度達(dá)到70%時(shí)峰面積最高，隨后峰面積隨著溶劑濃度的增加而降低;乙醇濃度為30%～60%時(shí)喜樹堿的提取率逐步增加，之后乙醇濃度的增高的提取率降低?？梢?0%的甲醇更有利力喜樹堿在溶劑中的擴(kuò)散，過高過低的溶劑濃度都不利于穿透細(xì)胞膜。

3.2不同提取方法提取效率

表2實(shí)驗(yàn)結(jié)果基礎(chǔ)上，各稱取1g粉碎好的樣品，分別在浸泡超聲提取法、熱回流提取法、浸泡熱回流提取法、浸泡超聲熱回流提取法4種提取方法下同等條件下檢測(cè)喜樹堿的HPLC峰面積。從表1可以看到，浸泡超聲熱回流法提取的喜樹堿含量最高。浸泡對(duì)有效成分的細(xì)胞穿透力有影響，超聲對(duì)有效物質(zhì)的擴(kuò)散有影響，且熱回流能夠加速有機(jī)物質(zhì)的溶出速率，對(duì)其提取影響較大，幾個(gè)方面的優(yōu)勢(shì)使得方法4提取的有效物質(zhì)的峰面積最高。

3.3響應(yīng)面優(yōu)化提取工藝條件

模型的建立與方差分析在上述2個(gè)實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)上，增加浸泡時(shí)間、超聲時(shí)間、液料比3個(gè)影響因子，設(shè)計(jì)3因素5水平設(shè)計(jì)正交試驗(yàn)（表2），根據(jù)Box-benhnken軟件設(shè)計(jì)正交實(shí)驗(yàn)方案，其結(jié)果及方差分析見表3、表4。

對(duì)表3實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行回歸分析，得到以喜樹堿峰面積y關(guān)于各因素的回歸方程為：

y=0.001627+11938.93A+6383.70B-429.87C+1972.60AB+4977.75AC+1333.0OBC-31400.62A³-2381.8882-7558.53C³。

由表4方差分析可知，喜樹堿含量峰值面積回歸極顯著，且失擬項(xiàng)不顯著，說明此回歸模型是理想的，可以用用模擬提取時(shí)間（A）、料液比的（B）和超聲時(shí)間的（C）的變化的對(duì)喜樹堿峰值面積的影響。3個(gè)因素中提取時(shí)間（A）對(duì)峰值面積的影響均達(dá)到了顯著水平;影響力大小順次依次為提取的影響>料液比的影響>超聲時(shí)間。相互項(xiàng)A2對(duì)結(jié)果具有顯著影響，而其他影響不顯著。各因素對(duì)喜樹堿峰值面積的影響是一個(gè)復(fù)雜的過程，并非簡(jiǎn)單的線性關(guān)系，存在交互作用。

由圖3可以看出，3個(gè)因素與峰值面積Y呈拋物線關(guān)系，即隨著各因素值的增加，峰值面積先增加后減少。

工藝條件的確定及驗(yàn)證試驗(yàn)為進(jìn)一步確定馬比木喜樹堿提取工藝的最佳參數(shù)，采用根據(jù)Design-Expert8.0.6軟件在模型試驗(yàn)水平范圍內(nèi)進(jìn)行優(yōu)化，得到最佳工藝參數(shù)為喜樹堿提取浸泡時(shí)間：14.76h，超聲時(shí)間：30.73，液料比為60.54，喜樹堿峰值面積7342.47。根據(jù)實(shí)際試驗(yàn)條件，將工藝參數(shù)修正為喜樹堿提取浸泡時(shí)間：14.80h，超聲時(shí)間：30.70，液料比為60.00。在此工藝條件下，實(shí)測(cè)馬比木根中喜樹堿峰值面積為7299.00，與預(yù)測(cè)值的相對(duì)誤差為0.6%。

3.4不同產(chǎn)地馬比木根中喜樹堿含量

在上述修正工藝條件下，測(cè)試了貴州萬(wàn)山區(qū)、松桃縣、湖南吉首市等12個(gè)產(chǎn)地馬比木根中喜樹堿含量。從表5可看出，12個(gè)產(chǎn)地馬比木喜樹堿含量在0.10%～3.89%之間，相互間差異較大;其中湖南省保靖縣夯沙鄉(xiāng)含量最高、貴州省麻江縣壩芒鄉(xiāng)最低。在優(yōu)化工藝條件下，除貴州麻江縣壩芒鄉(xiāng)外，其余產(chǎn)地含量都在1.50%以上;其中湖南省7個(gè)產(chǎn)地喜樹堿含量均≥2.29%，平均含量達(dá)到2.86%，遠(yuǎn)高于貴州省5個(gè)產(chǎn)地平均含量（1.89%）。

與當(dāng)前文獻(xiàn)采用的工藝所得含量相互比較，本文優(yōu)化出的工藝測(cè)得鳳凰縣馬比木喜樹堿含量2.29%，遠(yuǎn)高于白永花等（2014）優(yōu)化工藝下0.944%的含量，以及呂江明等0.53%的含量，古丈縣含量3.17%，也遠(yuǎn)高于呂江明等（2010）0.49%的測(cè)得含量;永順縣含量2.84%，是呂江明等測(cè)得含量（0.31%）的9倍;吉首市三個(gè)產(chǎn)地樣品喜樹堿平均含量2.61%，也是其他工藝測(cè)得吉首馬比木最高喜樹堿含量（0.48%）的5倍;貴州銅仁市3個(gè)產(chǎn)地平均含量2.19%，亦是該地區(qū)其他工藝最高喜樹堿含量的12倍。

4結(jié)論與討論

在已優(yōu)化出的馬比木喜樹堿提取工藝基礎(chǔ)上，采用同一產(chǎn)地樣品，以甲醇、乙醇為提取液，通過實(shí)驗(yàn)篩選出提取率最高的提取液及濃度為70%甲醇，并進(jìn)一步比較了目前提取馬比木喜樹堿常見的幾種方法，確定最佳提取方法為浸泡超聲熱回流提取法。在此基礎(chǔ)上，通過Box-benhnken實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)建立浸泡時(shí)間、超聲時(shí)間、液料比與提取效率的回歸數(shù)字模型;通過分析可知3個(gè)因素對(duì)提取效率影響大小順序?yàn)椋禾崛〉挠绊?料液比的影響>超聲時(shí)間，且彼此間有較強(qiáng)的交互作用;最終確定最佳提取工藝為：提取浸泡時(shí)間：14.80h，超聲時(shí)間：30.70，液料比為60.00，70℃水浴中回流1.5h。在此工藝條件下，喜樹堿峰值面積為7299.00，與預(yù)測(cè)值的相對(duì)誤差為0.6%。

通過12個(gè)產(chǎn)地的馬比木喜樹堿含量測(cè)定及其與文獻(xiàn)報(bào)道的相同區(qū)域樣品所測(cè)得最高含量比較，本文優(yōu)化出的工藝測(cè)得含量是其他工藝的2.4～10倍，大幅度提高了喜樹堿提取率，具有明顯優(yōu)越性。利用此工藝條件提取馬比木中喜樹堿，可大幅度提升資源利用效率，以及產(chǎn)生更好的經(jīng)濟(jì)效益。

12個(gè)產(chǎn)地馬比木生長(zhǎng)位置的經(jīng)緯度高底、海拔高度與含量關(guān)系并沒有呈現(xiàn)一致性特征，但喜樹堿含量最低的點(diǎn)海拔最高（樣品5），含量最高的點(diǎn)海拔最低（樣品12）。考慮到環(huán)境要素、測(cè)試樣品樹齡及長(zhǎng)勢(shì)等綜合因素影響，是否低海拔地區(qū)栽植更有利于馬比木喜樹堿的產(chǎn)生，獲得更高的含量，有待進(jìn)步一證實(shí)，旨為人工栽植環(huán)境選擇提供支撐。