蘇鐵葉枯病病原菌鑒定研究

林鈞

摘要：指出了在蘇鐵樹(shù)上發(fā)現(xiàn)了一種葉枯病害，導(dǎo)致大量蘇鐵葉干枯，為明確其致病菌，采集了蘇鐵葉枯病葉片數(shù)份，對(duì)病原茵進(jìn)行了致病性測(cè)定、形態(tài)學(xué)和分子生物學(xué)鑒定。結(jié)果顯示：病原茵接種后能夠產(chǎn)生與采集樣本相同的痛害癥狀。確定其為致病菌;對(duì)病原茵進(jìn)行形態(tài)學(xué)鑒定發(fā)現(xiàn)病原茵的分生孢子器、分生孢子的形態(tài)與擬莖點(diǎn)霉相同;通過(guò)分子生物學(xué)鑒定可知待測(cè)茵株rDNA-ITS的序列與GenBank中吸蟲(chóng)疫苗的rDNA-ITS的序列同源性可這97%。根據(jù)該病原茵的形態(tài)學(xué)特點(diǎn)以及rDNA-ITS測(cè)序結(jié)果可知：蘇鐵葉枯病病原菌為嗜血桿茵。

關(guān)鍵詞：蘇鐵;葉枯病;病原茵;嗜血桿菌

中圖分類(lèi)號(hào)：$763文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A 文章編號(hào)：1674-9944（2019）17-0097-02

1引言

蘇鐵，俗稱(chēng)“鐵樹(shù)”，具有很高的觀賞價(jià)值和人文價(jià)值，在世界上廣為栽培觀賞和利用。但近年來(lái)蘇鐵葉枯病病害嚴(yán)重，導(dǎo)致大量蘇鐵葉干枯，大大影響了蘇鐵的觀賞價(jià)值。該病癥狀是初發(fā)病時(shí)，蘇鐵葉尖或葉片上出現(xiàn)黃色斑點(diǎn)，病斑呈圓形狀凹陷，隨著病情發(fā)展，病斑顏色逐漸轉(zhuǎn)為黃褐色，嚴(yán)重時(shí)再由黃褐色發(fā)展為具有黑色小粒點(diǎn)的灰白色，該黑色小粒點(diǎn)就是病原菌的分生孢子器。筆者對(duì)蘇鐵的葉枯病進(jìn)行了致病性測(cè)定、形態(tài)學(xué)和分子生物學(xué)鑒定，旨在找出其致病的病原菌，為蘇鐵葉的防治提供理論依據(jù)。

2材料與方法

2.1材料

在2015～2018年間，每年的5～8月，分別從福州植物園、華南植物園、仙湖植物園的蘇鐵園內(nèi)采集發(fā)病的蘇鐵葉子數(shù)片。

2.2方法

2.2.1病原菌的分離純化

取滅菌培養(yǎng)皿于操作臺(tái)中，用無(wú)菌操作法向培養(yǎng)皿中加入1～2滴25%的乳酸，再倒入10～15mL的pda培養(yǎng)基，搖動(dòng)使之呈平面。培養(yǎng)好平板培養(yǎng)基后，取發(fā)病的蘇鐵葉，用剪刀從病健交界處剪取典型的病斑小塊組織，將病變組織放在70%酒精中浸3～5s后移入0.1%升汞液進(jìn)行表面消毒，再放入滅菌水中漂洗。完成后用無(wú)菌操作法將病變組織放人平板培養(yǎng)基中，每塊培養(yǎng)皿可放4～6塊，然后將培養(yǎng)皿置于恒溫箱內(nèi)培養(yǎng)。之后使用稀釋分離法將較為整齊一致的菌落挑取出來(lái)進(jìn)行斜面培養(yǎng)，多次進(jìn)行分離純化直到獲得純種菌株。

2.2.2病原茵的致病性測(cè)定

取健康的蘇鐵葉片分為對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組。用75%酒精對(duì)蘇鐵葉片進(jìn)行表面消毒，使用刺傷法和無(wú)傷接種在實(shí)驗(yàn)組葉片上接種3個(gè)接種點(diǎn)，接種分離純化后的5mm的菌餅，對(duì)照組葉片上接種2個(gè)接種點(diǎn)，接種5mm無(wú)菌的PSA培養(yǎng)基。將接種后的葉片放入培養(yǎng)皿中在25℃、光照1500Ix的培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)，觀察接種結(jié)果，將出現(xiàn)病斑的葉片進(jìn)行組織分離，確定致病菌株。

2.2.3茵落的培養(yǎng)特征和形態(tài)學(xué)鑒定

在25℃、PSA平板上培養(yǎng)致病菌株數(shù)日，記錄菌株的培養(yǎng)特征。完成致病性測(cè)定后，用針尖將接種成功的葉片上的小黑點(diǎn)挑取出來(lái)置于玻片中，在光學(xué)顯微鏡下觀察分生孢子器和分生孢子的形態(tài)、大小。

2.2.4病原茵的分子生物學(xué)鑒定

取0.5g茵絲在加入石英砂的研缽中研磨至粉狀，加入已預(yù)熱至65℃的3mLDNA提取緩沖液，充分振蕩混勻后65℃水浴30min，之后加入1mL5MKAC，冰浴20min，取等體積的24：1的氯仿和異戊醇混合，在12000r/min、5℃下離心5min，再取上清液加入2/3體積的已預(yù)冷至-20℃異丙醇，混勻，靜置30rain。再用玻璃棒挑取出其中的絮狀沉淀，用75%的乙醇反復(fù)沖洗，再用無(wú)水乙醇漂洗，吹干后置于5L TE中，加入1uL的RNaseA于37℃處理1h，加入25：24：1的pH=8的苯酚、氯仿和異戊醇，在12000r/rain，4℃下離心，取上清加人1/10V 3M NaAc，2.5V體積的無(wú)水乙醇，在一70℃沉淀30min以上，取沉淀用75%無(wú)水乙醇沖洗，吹干后溶于200uL無(wú)菌水中，在-20℃下保存?zhèn)溆谩?/p>

選用通用引物ITSl（5-TCCGTAGGTGAACCT-GCGG-3）和ITS4（5-TCCTCCGCTTATTGATAT-GC-3）對(duì)提取得到的病原菌DNA進(jìn)行擴(kuò)增，擴(kuò)增結(jié)束后，取5uL的擴(kuò)增產(chǎn)物用1.2%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，在NCBI網(wǎng)站中將測(cè)出的ITS序列進(jìn)行同源性分析，將分析得出的序列提交到GenBank，然后在其中選擇合適的序列，用CLUSTALW2.0軟件對(duì)比序列，同時(shí)使用MEGA5.05中的NJ構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)。

3結(jié)果與分析

3.1病原菌的分離純化

經(jīng)過(guò)分離純化，共獲得病原菌菌株20株，編號(hào)為A01-20。回接后發(fā)現(xiàn)其中的A05、A08、A11、A17均為非致病菌，其余菌株形態(tài)基本一致，后面進(jìn)行病原菌的致病性測(cè)定和形態(tài)學(xué)鑒定使用A07菌株。

3.2病原菌的致病性測(cè)定結(jié)果

實(shí)驗(yàn)組的葉片在接種2d后刺傷接種點(diǎn)出現(xiàn)褐色病斑且隨著時(shí)間推移擴(kuò)散，第9d開(kāi)始出現(xiàn)葉片干枯現(xiàn)象，13d后出現(xiàn)黑色的分生孢子器，15d后葉片完全變成褐色。將病害葉片上的病原菌進(jìn)行分離培養(yǎng)，發(fā)現(xiàn)分離物的形態(tài)特點(diǎn)與實(shí)驗(yàn)組接種的供試菌株形態(tài)特點(diǎn)相同，由此可知供試菌株即為蘇鐵葉枯病的致病菌。

3.3病原菌的形態(tài)學(xué)鑒定結(jié)果

光學(xué)顯微鏡下可觀察到分生孢子器大小約為255～425mm，有球狀和扁球狀。器壁為褐色，有孔口。壓迫后可出現(xiàn)甲型分生孢子，大小約為（5.11～10.4）ptm×（2.0～4.6）p.m，呈無(wú)色紡錘狀，其中有2～3個(gè)油球，未觀察到乙型分生孢子。分生孢子梗為無(wú)色，呈分隔狀或簇狀。

將菌株進(jìn)行培養(yǎng)4d后，發(fā)現(xiàn)菌絲為白色絨毛狀、呈輻射狀生長(zhǎng);6d后菌絲的背面開(kāi)始出現(xiàn)黑色小粒點(diǎn);15d后正面出現(xiàn)黑色的分生孢子器;30d后正面的黑色小粒點(diǎn)噴出黃色的分生孢子。取黃色的分生孢子置于光學(xué)顯微鏡下觀察，除觀察到甲型分生孢子外，還有乙型分生孢子，大小約為（15.25～51.78）p.m×（0.7～1.25）um，為單胞、線性、無(wú)色且無(wú)油球的真菌。

3.4病原菌的rDNA-ITS測(cè)序結(jié)果

對(duì)病原菌的DNA進(jìn)行擴(kuò)增可得到一條600bp左右的條帶，測(cè)序目的片段長(zhǎng)度為527bp，將測(cè)得的DNA序列與GenBank中的DNA序列進(jìn)行同源性對(duì)比，發(fā)現(xiàn)菌株A07與GenBank中的Phomopsis vaccinii的同源性最高可達(dá)97%，而構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)中發(fā)現(xiàn)該病原菌與擬莖點(diǎn)霉菌株的遺傳距離最近，但該病原菌又不是Phomopsis vaccinii，由此可知該病原菌為Phomopsiscycacis。

4結(jié)論與討論

我國(guó)關(guān)于擬莖點(diǎn)霉引起的蘇鐵葉枯病的論文很少。本人通過(guò)對(duì)A07病原菌DNA的測(cè)序發(fā)現(xiàn)與擬莖點(diǎn)霉的Phomosis vaccinii的同源性最高，同時(shí)構(gòu)建出的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)中顯示，Phomosis vaccinii和Phomosis cycadis支持率達(dá)98%，但是兩者的形態(tài)學(xué)特點(diǎn)具有很大的差異。根據(jù)對(duì)A07病原菌的形態(tài)學(xué)鑒定和培養(yǎng)特性顯示蘇鐵葉枯病病原菌的形態(tài)特點(diǎn)與Phomosis cycadis相似。因此可以鑒定蘇鐵葉枯病的致病菌為擬莖點(diǎn)霉Phomosis cycadis