貢菊再生體系建立及羧芐青霉素濃度篩選

徐亞男， 任鏝蓉， 岳圓圓， 趙 麗， 廉美蘭， 高 日*

(1.延邊大學農(nóng)學院；2.延邊林業(yè)科學研究院:吉林 延吉 133000)

貢菊(Chrysanthemummorifolium(Ramat) Tzvel. cv. Gongju)系菊科菊屬多年生草本植物，主產(chǎn)黃山歙縣金竹嶺地區(qū)。貢菊以頭狀花序入藥，是我國4大藥用菊之一，味甘苦、性微寒，具有疏風清熱、平肝明目、解毒消腫的功效，同時作為高級茶飲、保健品被開發(fā)，具有廣闊的市場前景[1]。然而，近年來因貢菊重茬種植等問題，造成種質(zhì)嚴重退化，加上病蟲害嚴重，造成產(chǎn)量下降，甚至絕產(chǎn)[2]。植物基因工程技術(shù)是獲得創(chuàng)新品種的技術(shù)手段，在改良植物的抗病蟲害和抗逆性、提高天然藥物含量等方面起著重要作用。目前，這種技術(shù)在菊屬植物中研究較多，如通過超表達F3′H基因，使菊花花色發(fā)生明顯改變[3]；DREBa基因的轉(zhuǎn)入，提高了地被菊的抗旱能力[4]；超表達E2F基因，使甘菊花朵變大[5]，這些研究表明，通過功能基因的轉(zhuǎn)入可有效地改良菊花種質(zhì)特性，促進菊花產(chǎn)業(yè)的發(fā)展。但是，至目前為止貢菊轉(zhuǎn)基因研究處薄弱狀態(tài)，對其再生體系建立的研究尚未見報道。因此，為了建立貢菊再生體系，該研究以試管苗葉片作為材料，研究了提高不定芽誘導的條件，并對生根條件也進行了優(yōu)化，為今后開展貢菊轉(zhuǎn)基因研究鑒定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

選擇田間生長的健壯貢菊，切取1 cm的莖段，用洗潔劑清洗，自來水沖洗1 h，再用70%酒精消毒40 s，然后用0.1%氯化汞溶液消毒2 min，用無菌水沖洗4次，用無菌濾紙吸干表面水分后，接種到MS+蔗糖30 g/L+瓊脂0.8%的培養(yǎng)基中。培養(yǎng)基的pH值調(diào)節(jié)為5.8。培養(yǎng)條件為光照強度2 000 lx，光周期16 h/d，溫度(25±2) ℃。

1.2 方法

1.2.1 BA和NAA對不定芽分化的影響

無菌試管苗培養(yǎng)30 d后，選擇頂部第3和第4片葉，將其切成0.5 cm×0.5 cm大小的葉盤后，葉背下放到含不同濃度6-芐基腺嘌呤(BA)和萘乙酸(NAA)的MS培養(yǎng)基的培養(yǎng)皿中，每個培養(yǎng)皿接入16個葉盤。BA濃度設置為1.0，1.5，2.0和2.5 mg/L，而NAA濃度設置為0.1，0.3，0.6和0.9 mg/L。培養(yǎng)條件同上。每個處理重復3次，培養(yǎng)30 d后調(diào)查不定芽的分化率和分化的不定芽數(shù)。

不定芽分化率=分化不定芽的外植體總數(shù)/接種的外植體總數(shù)×100%；

不定芽數(shù)=分化的不定芽總數(shù)/分化不定芽的外植體總數(shù)。

1.2.2 試管苗葉齡對不定芽分化的影響

在莖端培養(yǎng)20，25，30，35和40 d時，分別取底端第2、3片葉片作為外植體，將葉片切成0.5 cm×0.5 cm，接入MS+BA 2.0 mg/L +NAA 0.6 mg/L+30 g/L蔗糖+0.8%瓊脂培養(yǎng)基中。每個培養(yǎng)皿放入16個葉盤，每個處理重復3次，30 d調(diào)查不定芽的分化率和平均每個外植體分化不定芽數(shù)，培養(yǎng)條件同上。

1.2.3 IBA濃度對生根的影響

將從葉片中分化的不定芽切成2 cm長，分別接種含不同濃度吲哚丁酸(IBA)的培養(yǎng)基中，IBA濃度設為0，0.25，0.5，0.75和1.0 mg/L。每個培養(yǎng)瓶接種3個外植體，每個處理重復3次，30 d后調(diào)查幼苗生根和生長狀況，培養(yǎng)條件同上。

1.2.4 羧芐青霉素(Carb)濃度對不定芽分化的影響

將培養(yǎng)25 d的貢菊試管苗葉片切成1 cm×1 cm大小，接種到MS+BA 2.0 mg/L +NAA 0.6 mg/L+0.8%瓊脂+30 g/L蔗糖培養(yǎng)基中，附加不同濃度的Carb抗生素(1 000，750，500，250和100 mg/L)。30 d后調(diào)查不定芽的分化率和平均每個外植體

1.3 數(shù)據(jù)分析

試驗數(shù)據(jù)3次重復平均值，采用SPSS 11.0軟件進行統(tǒng)計分析，采用鄧肯氏新復極差法作顯著性差異分析，顯著水平為0.05。

2 結(jié)果與分析

2.1 BA和NAA濃度對不定芽誘導的影響

為篩選出適合誘導貢菊愈傷組織和不定芽的培養(yǎng)基，將BA和NAA以不同濃度分別組合進行誘導不定芽研究。接種10 d后，葉盤邊緣開始形成愈傷組織，30 d后，部分愈傷組織形成小芽，其中，BA 2.0 mg/L+NAA 0.6 mg/L組合每個葉盤能分化出3.4個小芽，誘導不定芽數(shù)80.7%，誘導不定芽數(shù)最多，其次為BA 2.5 mg/L+NAA 0.6 mg/L和BA 1.5 mg/L+NAA 0.3 mg/L組合。其他的BA和NAA組合，都能形成愈傷組織，但是愈傷組織不能形成不定芽或者不定芽形成的較少(表1，圖1a)。適合誘導不定芽的激素組合為BA 2.0 mg/L+NAA 0.6 mg/L。

表1 BA和NAA濃度對誘導不定芽的影響

注： 同列數(shù)據(jù)后小寫英文字母表示不同處理間差異顯著(P<0.05)，下同。

2.2 不同葉齡誘導分化不定芽數(shù)

由表2可知，葉齡不同分化的不定芽數(shù)也有差異，葉齡小，葉面積較小，且葉片較薄，誘導不定芽數(shù)也低；葉齡為25 d的葉片鮮嫩，誘導不定芽率最高，為88.4%，平均每個葉盤分化不定芽數(shù)為4.6個(圖1b)；葉齡繼續(xù)增加，葉片增厚，適合操作，但是誘導的不定芽數(shù)逐漸減少。因此，適合誘導不定芽的葉齡為25 d。

表2 試管苗葉齡對不定芽分化的影響

a:試管苗葉片接種于MS+BA 2.0 mg/L +NAA0.6 mg/L培養(yǎng)基中后的第30天。b: 培養(yǎng)30 d后，不定芽的分化；c: 葉片接種到含250 mg/L的Carb的培養(yǎng)基中培養(yǎng)40 d后的不定芽分化和生長情況；d: 在IBA濃度為0.25 mg/L的培養(yǎng)基中培養(yǎng)30 d后的試管苗生根及生長狀況。

圖1 貢菊不定芽分化和生根

Fig.1 Adventitious bud differentiation androoting of chrysanthemum Gongju

2.3 IBA濃度對幼苗生長和生根的影響

IBA促進貢菊無菌苗生根，接種7 d后，加入IBA的處理，在幼苗莖底端形成白色凸起，14 d后，能分化出數(shù)條不定根。未加入IBA的處理，在12 d后，莖的底端形成白色凸起，20 d后能形成不定根。由表3可知，IBA濃度為0.25和0.5 mg/L時，株高、根數(shù)、地下部鮮物重和干物重都顯著高于其他處理；在根長中，IBA濃度為0.25 mg/L的處理好于0.5 mg/L處理。繼續(xù)增加IBA濃度，幼苗地上部和地下部的生長都明顯下降。因此，IBA濃度為0.25 mg/L時更適合貢菊生根。

表3 IBA濃度對幼苗生長和生根的影響

2.4 Carb對誘導不定芽的影響

Carb抗生素不僅對農(nóng)桿菌有抑制作用，同時也會抑制貢菊葉盤的不定芽形成，Carb濃度在100和250 mg/L，不定芽誘導率分別為87.6%和85.7%，每個葉盤平均分化3.7和3.9個植株(表4，圖1c)，與不加Carb處理的誘導率和葉盤分化苗數(shù)無顯著差異。Carb濃度繼續(xù)增加，不定芽誘導率和葉盤平均分化不定芽數(shù)逐漸降低(表4)。

表4 Carb對誘導愈傷不定芽的影響

3 討論與結(jié)論

植物激素是組織和器官等組織培養(yǎng)過程中不可缺少的物質(zhì)，激素的種類，濃度和配比是植物器官誘導愈傷組織和不定芽的關(guān)鍵因子。以菊花葉片為外植體建立再生體系，其中激素BA、NAA等應用的較多[6]。梁芳等[7]研究表明，MS+NAA 0.1 mg/L+BA 1.0 mg/L適合傳統(tǒng)菊花“獅子頭”愈傷組織誘導及分化。地被菊品種“鋪地金”和“北林紅”再生培養(yǎng)基分別為MS+BA 2.0 mg/L+NAA 1.0 mg/L和MS+BA 1.0 mg/L+NAA 0.5 mg/L[8]；切花菊“神馬”的最適誘導不定芽再生培養(yǎng)基為MS+NAA 1.0 mg/L+BA 1.0 mg/L[9]。本研究發(fā)現(xiàn)，適合誘導愈傷組織和不定芽的培養(yǎng)基是MS+BA 2.0 mg/L+NAA 0.6 mg/L，與上面所報道的菊花再生體系中激素濃度有差異，這可能是不同品種導致，菊花可以異花授粉，菊屬遺傳背景復雜，不同基因型需要不同激素濃度和配比。

目前，常用的抗生素主要有羧芐青霉素、頭孢霉素(Cef)、卡那霉素(Kan)、氨芐青霉素(Amp)和潮霉素(Hyg)等[10]，周小梅等[11]報道，9種抗生素對根癌農(nóng)桿菌EHA105有抑制效果，發(fā)現(xiàn)羧芐青霉素效果最好。羧芐青霉素濃度過高抑制轉(zhuǎn)基因細胞生長，濃度過低則不足以抑制農(nóng)桿菌生長[12]。羧芐青霉素濃度在菊花“Reagan Elite White”遺傳轉(zhuǎn)化體系中為200～300 mg/L，而菊花“神馬”為300 mg/L能夠抑制不定芽分化。因此，不同基因型的植株遺傳轉(zhuǎn)化體系添加的羧芐青霉素濃度不同。本研究發(fā)現(xiàn)，250 mg/L的羧芐青霉素對貢菊葉片誘導不定芽無影響，且能夠抑制農(nóng)桿菌生長，但濃度為500 mg/L時，不定芽誘導率明顯降低(表4)，這與茶，大豆和葡萄遺傳轉(zhuǎn)化體系中的羧芐青霉素濃度相似[13-16]。