貫葉連翹不定根提取工藝優(yōu)化及其對酪氨酸酶活性的影響

孫浩丁， 郝悅君， 安曉麗， 廉美蘭， 樸炫春

(延邊大學(xué)農(nóng)學(xué)院，吉林 延吉 133002)

貫葉連翹(Hypericumperforatum)屬金絲桃科，金絲桃屬多年生草本植物，又稱貫葉金絲桃、千層樓，多產(chǎn)于我國陜西、河北、河南省，生長于山區(qū)河從草地、灌叢和山坡中，是一種常見的藥用植物[1]。貫葉連翹性平，味辛、苦，具有清熱解毒，調(diào)經(jīng)止血的功效。人們常將貫葉連翹鮮品搗碎或干品研末敷到傷口，以此治創(chuàng)傷出血、傷口腫毒和燒燙傷等。德國將貫葉連翹用作抗抑郁癥藥已有100多年的歷史，英國、俄羅斯也有大面積栽培，并廣泛應(yīng)用于臨床。貫葉連翹的有效成分為金絲桃素和偽金絲桃素，這2種植物次生代謝產(chǎn)物具有抗菌、止血、退熱和治療灼傷，外傷出血等作用，是很多人熟悉的民間藥草。作為純天然植物藥，貫葉連翹的提取物在治療輕中度抑郁癥，聯(lián)合治療失眠、消化系統(tǒng)疾病、良性陣發(fā)性位置性眩暈、酒精依賴綜合征，焦慮障礙、心血管神經(jīng)癥等方面具有優(yōu)良的效果，而且耐受群體多，安全性高，值得臨床推廣應(yīng)用[2]。

黑色素是一種生物色素，是分布于自然界的色素之一，由酪氨酸或3，4-二羥苯丙氨經(jīng)過一系列的化學(xué)反應(yīng)合成，黑色素通常以聚合的方式存在于動物、植物與原生生物中。黑色素是動物皮膚和毛發(fā)中存在的一種黑色或褐色的色素，由黑色素細(xì)胞生成并且儲存于其中。且正是由于黑色素的存在，才使皮膚有了顏色。黑色素其實是一種氨基酸衍生物，它們存在于皮膚底層的細(xì)胞之間，被稱作色素母細(xì)胞，色素母細(xì)胞能夠分泌麥拉寧色素，當(dāng)紫外線照射到皮膚上時，刺激麥拉寧色素，激活酪氨酸酶的活性，來保護(hù)我們的皮膚細(xì)胞。多巴經(jīng)酪氨酸氧化，釋放出黑色素。黑色素經(jīng)由細(xì)胞代謝的層層移動，到了肌膚表皮層形成雀斑、曬斑、黑斑等形狀[3]。

酪氨酸酶、氧化酶、多巴色素互變酶在黑色素的產(chǎn)生中起到了催化的作用。由于無法控制酪氨酸，所以只能通過控制催化劑來防止黑色素的產(chǎn)生。在這其中，酪氨酸酶的催化作用是反應(yīng)產(chǎn)生的第1步，它是黑色素合成的關(guān)鍵酶。 所以控制酪氨酸酶的活性，是美白護(hù)理的重點。酪氨酸酶是一種黑色素合成的限速酶，其活性與黑色素合成的數(shù)量有關(guān)。現(xiàn)如今，關(guān)于酪氨酸酶活性抑制劑的相關(guān)研究越來越多，為攻克色素細(xì)胞性腫瘤、黃褐斑等色素疾病提供幫助。天然植物效果顯著且毒副作用低，現(xiàn)在已經(jīng)成為化妝品的熱點研發(fā)對象[4]。

近年來，貫葉連翹越來越多地應(yīng)用于醫(yī)療保健行業(yè)，臨床上在聯(lián)合治療失眠、酒精依賴綜合征、良性陣發(fā)性位置性眩暈、心血管神經(jīng)癥、消化系統(tǒng)疾病等方面，具有肯定的療效，而且安全性和耐受性好，林芝等[5]研究發(fā)現(xiàn)，貫葉連翹提取物可作為治療輕、中度抑郁癥及焦慮癥的純中藥制劑；余愛農(nóng)等[6]在研究貫葉連翹時發(fā)現(xiàn)貫葉連翹中含有的金絲桃素具有抗病毒、抗抑郁等作用。國內(nèi)外還完成了抗艾滋病的Ⅱ期臨床試驗，治療惡性神經(jīng)膠質(zhì)瘤的臨床研究也在進(jìn)行中。然而，至今為止尚未發(fā)現(xiàn)國內(nèi)外用其提取物抑制黑色素生成的研究，且由于提取工藝的不同，其提取物中活性成分含量會有所差異，因此，該試驗以貫葉連翹不定根為材料，研究不同提取條件的提取物抑制酪氨酸酶活性的能力，篩選出最佳的提取工藝，為深入研究貫葉連翹抑制黑色素生成及美白護(hù)膚相關(guān)產(chǎn)品的研發(fā)提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

試驗使用于曉坤[7]的方法獲得貫葉連翹不定根。

1.2 方法

1.2.1 不定根不同溶劑提取物對酪氨酸酶活性的影響

稱取烘干的不定根干粉1 g置于50 mL容量瓶中，之后分別加入80%乙醇，80%甲醇和水，物料比設(shè)置為1∶30(g∶mL)。應(yīng)用超聲提取法，在50 ℃和40 kHz的頻率(KH3200DE數(shù)控超聲波清洗器，昆山禾創(chuàng)有限公司，中國)下提取1 h，共3次，并將提取液過濾，之后使用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(R2002D,上海申順生物科技有限公司，中國)將所得濾液真空濃縮至膏狀，將其置于烘干箱(YHW-1103遠(yuǎn)紅外鼓風(fēng)干燥箱，天津市華北實驗儀器有限公司，中國)中44 ℃下干燥至恒重后，測定3種溶劑提取的貫葉連翹不定根提取物對酪氨酸酶活性的影響。

1.2.2 不定根提取物濃度對酪氨酸酶活性的影響

將貫葉連翹不定根粉末1 g浸泡在80%的甲醇中，研究在不同提取時間、溫度、次數(shù)以及甲醇濃度條件下貫葉連翹不定根提取物對酪氨酸酶活性的影響。按照1.2.1方法制備提取物，取干燥好的提取物分別以2，4，6，8，10，12 mg溶于10 mL磷酸鹽緩沖液中，測定不同濃度的提取物對酪氨酸酶活性的影響，確定提取物的最佳濃度。

1.2.3 提取時間、提取溫度和提取次數(shù)及甲醇濃度對酪氨酸酶活性的影響

1) 單因素試驗 ①提取時間：將提取時間設(shè)置為0.5，1.0，1.5，2.0和2.5 h，在50 ℃，料液比為1∶30(g∶mL)的提取條件下提取3次，其他提取物提取方法同1.2.1；②提取溫度：在提取溫度試驗中，使用酪氨酸酶活性較低的時間作為提取時間，將提取溫度設(shè)置為30，40，50，60，70 ℃，其他提取物制備方法同1.2.1；③提取次數(shù)：以提取溫度試驗中酪氨酸酶活性較低的溫度及時間作為提取條件，將提取次數(shù)分別設(shè)置為1，2，3，4，5次，其他提取物制備方法同1.2.1；④甲醇濃度：以提取次數(shù)試驗中酪氨酸酶活性較低的次數(shù)、溫度、時間為提取條件，將甲醇濃度設(shè)置為20%，40%，60%，80%，100%，其他提取物制備方法同1.2.1。

2) 正交試驗設(shè)計 依據(jù)單因素試驗的結(jié)果，選擇提取時間、提取溫度、提取次數(shù)以及甲醇濃度等4個因素，以貫葉連翹不定根提取物對酪氨酸酶活性影響作為指標(biāo)，設(shè)定4因素3水平L9(34)正交試驗(表1)，確定最佳的提取工藝條件。

表1 正交試驗因素水平

根據(jù)正交試驗中最佳提取條件的結(jié)果，對其進(jìn)行驗證試驗，重復(fù)3次，確定該條件是否具有穩(wěn)定性。

1.2.4 酪氨酸酶活性的測定方法

參照蔣曉龍等[8]的方法測定酪氨酸酶活性，用酶標(biāo)儀(iMark酶標(biāo)儀，Bio-Rad，美國)檢測貫葉連翹不定根提取物對酪氨酸酶活性的影響。按照表2精確吸取貫葉連翹不定根提取物溶液、磷酸鹽緩沖溶液(pH值為6.8)和1 mmol/L L-多巴(SIGMA公司，美國)溶液于96孔檢測板相鄰的4個凹槽A1、A2、A3、A4中，在室溫下孵化10 min后，加入50 U/mL的蘑菇酪氨酸酶(SIGMA公司，美國)溶液，5 min后用酶標(biāo)儀在450 nm處測吸光值(OD)，并計算出對酪氨酸酶活性的抑制率。

抑制率/%=1-[(ODA1-ODA2)/(ODA3-ODA4)]×100%

表2 反應(yīng)液的組成

1.2.5 軟件分析及數(shù)據(jù)整理

利用SPSS 22.0(Statistical Product and Service Solutions 22.0)中的方差分析程序分析試驗數(shù)據(jù)，用鄧肯氏新復(fù)極差法作對比，顯著水平為0.05，每個處理重復(fù)3次。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同濃度的貫葉連翹不定根甲醇提取物對酪氨酸酶活性的影響

提取物濃度從0.2 mg/mL 提高到0.8 mg/mL 時，對酪氨酸酶的抑制率明顯升高，達(dá)到71.5%，當(dāng)提取物濃度從0.8 mg/mL 提高到1.2 mg/mL 時，對酪氨酸酶的抑制率趨于平緩，雖有所升高，但已無顯著差異(表3)。因此，綜合上述，將0.8 mg/mL作為貫葉連翹不定根提取物的最適濃度。通過對甲醇、乙醇和水提取物對酪氨酸酶活性抑制率測定的結(jié)果，發(fā)現(xiàn)甲醇提取物對酪氨酸酶活性抑制率(71.5%)高于水提(39%)及乙醇提取物(42%)。測定酪氨酸酶活性通常使用生物酶學(xué)法或細(xì)胞學(xué)法，該試驗采用生物酶學(xué)法進(jìn)行測定，因此排除甲醇毒性的因素，后續(xù)試驗都選擇甲醇作為提取溶劑。

表3 貫葉連翹不定根提取物濃度對酪氨酸酶活性的影響

注：不同字母表示0.05水平上差異顯著。

2.2 提取時間、溫度、次數(shù)及甲醇濃度對酪氨酸酶活性的影響

2.2.1 貫葉連翹不定根提取物的提取時間對酪氨酸酶活性的影響

提取時間從0.5 h上升到2.5 h過程中，酪氨酸酶活性的抑制能力雖然持續(xù)增高，由68%上升到72.1%(圖1)，但各水平之間抑制率沒有明顯差異。因此，為了節(jié)約試驗時間，后續(xù)試驗采用0.5 h來制備提取物。

圖1 貫葉連翹不定根的提取時間對酪氨酸酶活性的影響

2.2.2 貫葉連翹不定根的提取溫度對酪氨酸酶活性的影響

當(dāng)提取溫度從30 ℃上升到60 ℃時，酪氨酸酶活性的抑制率呈上升趨勢，且在60 ℃提取物對酪氨酸酶活性抑制能力達(dá)到最高，能夠達(dá)到78.8%。當(dāng)提取溫度繼續(xù)升高時，酪氨酸酶活性的抑制率開始降低(圖2)。

圖2 貫葉連翹不定根的提取溫度對酪氨酸酶活性的影響

2.2.3 貫葉連翹不定根的提取次數(shù)對酪氨酸酶活性的影響

在提取4次以內(nèi)的范圍內(nèi)，提取物對酪氨酸酶抑制能力隨著提取次數(shù)的增加而升高，而再繼續(xù)增加提取次數(shù)后，抑制能力開始降低。重復(fù)提取4次時，酪氨酸酶活性的抑制率達(dá)到79.5%，因此，選擇的提取次數(shù)為4次(圖3)。

圖3 貫葉連翹不定根的提取次數(shù)對酪氨酸酶活性的影響

2.2.4 不同濃度甲醇提取的貫葉連翹不定根對酪氨酸酶活性的影響

提取物對酪氨酸酶抑制能力隨著甲醇含量的增加而升高，而在使用80%的甲醇提取時，酪氨酸酶抑制率達(dá)到最高值80.1%。當(dāng)繼續(xù)使用更高濃度的甲醇時，抑制率開始降低，因此，最適宜的甲醇濃度為80%(圖4)。

圖4 不同濃度甲醇提取的貫葉 連翹不定根對酪氨酸酶活性的影響

2.3 正交試驗

依據(jù)上述單因素試驗結(jié)果，設(shè)定L9(34)正交試驗方案，對提取時間(A)、提取溫度(B)、提取次數(shù)(C)和甲醇含量(D)等4個因素進(jìn)行不同組合，探究了這些組合對酪氨酸酶活性的影響，正交試驗方案及結(jié)果見表4。

表4 正交試驗方案及結(jié)果

注：不同字母表示0.05水平上差異顯著。

表4中的第6組，即當(dāng)提取時間為1 h、提取溫度為70 ℃、提取3次、甲醇濃度為80%時，對酪氨酸酶活性的抑制率最高，達(dá)到83%，高于其他組合。對極值R進(jìn)行分析的結(jié)果，R值由大到小的順序排列為提取時間(A)>提取溫度(B)>提取次數(shù)(C)>甲醇含量(D)，說明不同提取條件對酪氨酸酶活性的影響不同，其中影響最大的是提取時間，其次是提取溫度、提取次數(shù)和甲醇含量。分別計算出各因素水平對酪氨酸酶活性的平均值K，經(jīng)分析發(fā)現(xiàn)提取時間(A)、提取次數(shù)(C)和甲醇含量(D)中K2值最大，提取溫度(B)中K3值最大。綜上所述,最適宜的工藝條件為A2B3C2D2,即提取時間為1 h、提取溫度為70 ℃、提取4次、甲醇濃度為80%。與蔣曉龍的東北刺人參的最佳提取工藝(提取時間1.5 h，料液比1∶20，提取溫度70 ℃，提取次數(shù)3次)相比較，最優(yōu)提取條件有所不同，其原因可能是與植物種類直接存在差異，并且抑制酪氨酸酶活性的有效成分也有所不同。

為確定最優(yōu)的提取工藝是否具有穩(wěn)定性，對正交試驗中得到最佳提取條件(A2B3C2D2)進(jìn)行3次重復(fù)驗證試驗，結(jié)果發(fā)現(xiàn)酪氨酸酶活性的抑制率均值為90.2%，高于正交試驗中抑制率最高的第6組(83%)。驗證試驗結(jié)果的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)值較小，為0.6%(表5)。

表5 驗證試驗結(jié)果 Table 5 Verification of test results

3 討論與結(jié)論

由于近年來對貫葉連翹的大量采收，導(dǎo)致其野生植物資源逐漸稀少，直接影響了對貫葉連翹的開發(fā)與利用。而通過生物反應(yīng)器可以大量培養(yǎng)植物細(xì)胞、組織或器官，目前已應(yīng)用于貫葉連翹[9]、人參[10]以及瓦松[11]等多種植物的愈傷組織和不定根培養(yǎng)當(dāng)中。通過這種方法培養(yǎng)的貫葉連翹不定根也已作為制藥、保健品及美白產(chǎn)品開發(fā)的原材料。當(dāng)前市場上，相關(guān)的美白產(chǎn)品大多數(shù)是通過抑制酪氨酸酶活性來達(dá)到美白的效果。目前如兒茶酚、熊果苷等多種化學(xué)合成的酪氨酸酶抑制劑被廣泛應(yīng)用在美白產(chǎn)品的生產(chǎn)中，然而，對于這些化學(xué)合成物質(zhì)的毒性、副作用、安全性則需要嚴(yán)格把控[12]。相比較而言，植物的提取物安全性高，其美白、護(hù)膚的功效也更加顯著。研究表明，構(gòu)樹[13]、側(cè)柏葉[14]、人參酚酸[15]、無患子[16]、白附子提取物[17]和蒺藜提取物[18]等能夠有效地抑制酪氨酸酶活性，達(dá)到美白的效果。

現(xiàn)如今，超聲提取法被廣泛應(yīng)用于植物有效成分的提取，黃曉輝等[19]研究了水葫蘆黃酮的提取工藝，其最佳工藝條件為：超聲溫度45 ℃ ，料液比1∶45(g∶mL) ，超聲時間35 min ，提取pH值8。在該工藝條件下，測得黃酮提取率4.51%；李良玉等[20]對苦蕎麥殼黃銅的提取工藝進(jìn)行優(yōu)化，結(jié)果顯示：超聲功率379 W，液料比33.5∶1(mL∶g)，超聲溫度61.2 ℃，超聲時間29.7 min，苦蕎麥殼總黃酮的得率達(dá)到(3.66±0.2)%；計紅芳等[21]對檸檬蠟傘多糖的提取工藝進(jìn)行研究，試驗確定檸檬蠟傘多糖的最佳提取條件為：液料比40∶1(mL∶g)、提取溫度85 ℃、提取時間90 min，提取2次；在此條件下，多糖含量達(dá)4.412 g/100 g；李蘭等[22]對懷山藥活性多糖提取條件優(yōu)化后的結(jié)果顯示，懷山藥活性多糖最佳的提取條件為：浸提時間3 h，浸提料液比為1∶10(g∶mL)，浸提次數(shù)3次。利用最佳的提取條件做重復(fù)試驗，可使多糖平均得率達(dá)到17.18%。

植物中有效成分的提取方法對酪氨酸酶活性的影響很大，越來越多的研究人員通過提取條件的改善，確定最佳的提取工藝，但由于植物種類不同，所適合的最佳提取條件也會有所不同。本試驗中貫葉連翹不定根甲醇提取物在提取時間1 h，提取溫度70 ℃ ，提取次數(shù)4次 ，甲醇含量80%的條件下，對酪氨酸酶活性抑制能力最強，為90.2%。因此，貫葉連翹不定根可作為美白化妝品產(chǎn)業(yè)的一種較好的原材料，本研究對貫葉連翹資源的開發(fā)及利用提供了參考依據(jù)。