牛傳染性鼻氣管炎病毒SYBR GreenⅠ熒光定量PCR檢測方法的建立及應用

任亞初，楚會萌，程凱慧，解曉莉，張 亮，孫陽陽，楊 美，楊宏軍，唐月新，劉文浩，李開榮

(1.山東省農(nóng)業(yè)科學院奶牛研究中心，山東 濟南 250131；2.曲阜市畜牧獸醫(yī)局，山東 曲阜 273100)

牛傳染性鼻氣管炎(Infectious bovine rhinotracheitis，IBR)是由IBR 病毒(IBRV)引起的一種急性、熱性、接觸性傳染病，以高熱、呼吸困難、流鼻涕、上呼吸道及氣管、黏膜發(fā)炎等為特征[1]。IBRV可導致潛伏性感染，世界動物衛(wèi)生組織(OIE)將該病列為B 類疫病，也是我國進境動物必檢疾病之一[2]。因此，亟需建立針對IBRV 的快速有效的檢測方法。

目前國外已經(jīng)建立了諸多針對IBRV 的檢測方法，如病毒分離培養(yǎng)與鑒定、常規(guī)PCR 鑒定、熒光定量PCR 鑒定等方法[3]。但病毒分離培養(yǎng)鑒定與常規(guī)PCR 鑒定等傳統(tǒng)方法，不能滿足現(xiàn)代疾病檢測對時效性、準確性、便捷性等要求，亟需建立新的檢測方法。曲光剛等建立了IBRV 的熒光定量檢測方法[4-9]。在此基礎上，本研究通過生物信息學方法分析本實驗室分離獲得的IBRV 及國內(nèi)外流行株全基因組序列，發(fā)現(xiàn)gD 結(jié)構(gòu)基因在IBRV 全基因組中屬于保守序列，因此選取gD 結(jié)構(gòu)基因設計引物，利用SYBR Green I 熒光染料法[10]建立了特異性檢測IBRV 的熒光定量PCR 方法，并初步應用于臨床樣品的檢測，為IBRV 流行病學檢測及疫情診斷提供了技術(shù)支持。

1 材料與方法

1.1 病毒株和樣品來源 IBRV、牛病毒性腹瀉病毒(Bovine viral diarrhea virus，BVDV)、牛腸道病毒(Bovine enterovirus，BEV)、牛輪狀病毒(Bovine totavirus， BRV)、牛冠狀病毒(Bovine coronavirus，BCoV)、牛副流感 3 型病毒(Bovine parainfluenza virus type 3，BPIV3)等相關(guān)病毒核酸均由山東省農(nóng)業(yè)科學院奶牛研究中心疾病研究室保存。47 份奶牛鼻拭子樣品分別來自2018年山東省、江蘇省等3 家規(guī)模化牧場送檢樣品。

1.3 引物的設計與合成 參考GenBank 中IBRV(MK552112.1)的全基因組核酸序列，設計擴增IBRV結(jié)構(gòu)基因gD 的通用引物及SYBR GreenⅠ熒光定量PCR 引物(表1)，由擎科生物技術(shù)有限公司合成。

表1 IBRV 引物序列引物名稱Primer name gD-F gD-R IBRV-F IBRV-R引物序列(5'-3')Primer sequence (5'-3')GGGCGACTAGAGATACACTCGCC GTTTCGAGAACCAGCAGTCC ACGGACGACGAGCTGGGACT CGGCAGCGAAACCATGAAAT

1.4 重組質(zhì)粒標準品的制備 取200 μL IBRV 病毒原液，利用病毒基因組DNA/RNA 提取試劑盒提取IBRV 病毒基因組DNA，以其為模板，gD-F/R 為引物進行PCR 擴增，擴增產(chǎn)物經(jīng)1 %瓊脂糖凝膠電泳檢測后回收目的片段，克隆于pClone 007 載體，經(jīng)測序鑒定正確的重組質(zhì)粒測定濃度，按照以下公式轉(zhuǎn)換成質(zhì)粒的拷貝數(shù)：拷貝數(shù)= 質(zhì)粒濃度×10-9×6.02×1023/(660×質(zhì)粒長度)，并作為陽性標準品，命名為pClone 007-gD，-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.5 SYBR Green Ⅰ熒光定量PCR 檢測方法的建立 以pClone 007-gD 陽性標準品為模板，采用方陣法分別對引物濃度(5 pmol/L～20 pmol/L)、退火溫度(55 ℃～62 ℃)和循環(huán)數(shù)進行優(yōu)化，選取Cp 最小值、熒光最高值、融解曲線特異型明顯的PCR 反應條件作為最適反應條件。

采用優(yōu)化后的反應條件，以10 倍倍比稀釋后的重組質(zhì)粒標準品pClone 007-gD 為模板，進行熒光定量PCR 擴增，繪制標準曲線。

1.6 特異性試驗 按反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書將BVDV、BPIV-3、BCoV、BEV 基因組反轉(zhuǎn)錄為cDNA，以其cDNA 及 IBRV 的 DNA 為模板，采用已建立的SYBR Green Ⅰ熒光定量PCR 方法分別進行擴增，并以ddH2O 為陰性對照，分析該方法的特異性。

1.7 敏感性試驗 以10 倍倍比稀釋的質(zhì)粒pClone 007-gD 標準品為模板，以ddH2O 作為無模板對照，按照建立的SYBR Green Ⅰ熒光定量PCR 方法進行擴增，每個模板濃度做3 個重復，進行敏感性試驗。同時進行常規(guī)PCR 試驗，比較兩種方法的靈敏性。

1.8 重復性試驗 批內(nèi)重復性試驗：取4 份不同稀釋度的pClone 007-gD 質(zhì)粒進行熒光定量PCR 檢測(同時設置空白對照)，每份樣品做3 個重復，通過計算Cp 值的標準差(S)和變異系數(shù)(CV)來確定熒光定量PCR 的批內(nèi)重復性。

批間重復性試驗：選取上述4 份不同稀釋度的pClone 007-gD 質(zhì)粒為模板，進行熒光定量PCR 擴增，間隔7 d 重復一次，共進行3 次重復，計算Cp值的變異系(CV)，以確定熒光定量PCR 的批間重復性。

1.9 臨床樣品的檢測 將47 份奶牛鼻拭子樣品取樣分裝至2 mL 離心管中，經(jīng)PBS 稀釋后將樣品4 500 r/min 離心，取200 μL 上清，利用病毒基因組DNA/RNA 提取試劑盒提取核酸，以其為模板，采用本研究建立的IBRV SYBR GreenⅠ熒光定量PCR方法和普通PCR 進行檢測，比較二者的檢出率，計算二者的符合率。

2 結(jié) 果

2.1 重組質(zhì)粒標準品的鑒定 以提取的IBRV 基因組DNA 為模板，利用引物gD-F/gD-R 進行 PCR 擴增，得到約130 bp 的目的片段，與預期片段大小一致，陰性對照無該目的條帶(圖1)。將目的片段膠回收及純化后，克隆于pClone 007 載體。提取質(zhì)粒測序，測序結(jié)果與NCBI 登錄的標準序列對比，片段插入位置正確，且同源性為100 %。表明質(zhì)粒標準品pClone 007-gD 構(gòu)建正確。擴增后提取質(zhì)粒，其中pClone 007-gD 的質(zhì)粒濃度為223 ng/μL，總長度為 2 030 bp。經(jīng)計算拷貝數(shù)為 6.1×1010拷貝 /μL。

2.2 SYBR Green Ⅰ熒光定量 PCR 方法的建立通過對SYBR GreenⅠ熒光定量PCR 條件進行優(yōu)化，建立了最佳的反應體系，并獲得了最佳循環(huán)參數(shù)。反應體系IBRV-F/R 各 0.5 μL，模板 2 μL，ddH2O 補充至 20 μL。反應條件：95 ℃ 30 s；95 ℃ 5 s、60 ℃ 30 s，40 個循環(huán)。融解曲線：95 ℃5 s，60 ℃1 min，95 ℃，1個循環(huán)。建立標準曲線斜率為-2.6225，截距為26.094，相關(guān)系數(shù)為0.9913 (圖2)。

SYBR GreenⅠ熒光定量PCR 檢測 IBRV 的融解曲線顯示，重組質(zhì)粒標準品均出現(xiàn)了單一波峰，而陰性對照沒有出現(xiàn)融點峰(圖2)，表明試驗中未出現(xiàn)污染和引物二聚體，引物特異性較強。

2.3 特異性試驗結(jié)果 利用建立的SYBR GreenⅠ熒光定量PCR 方法對IBRV、BVDV、BPIV-3、BCoV、BEV、ddH2O 進行檢測，結(jié)果顯示除了IBRV 核酸檢測結(jié)果為陽性外，其余病毒核酸與陰性對照檢測均為陰性(圖3)，表明建立的SYBR GreenⅠ熒光定量PCR 方法具有很強的特異性。

2.4 敏感性試驗結(jié)果 將重組質(zhì)粒標準品10 倍倍比稀釋至 6.1×107拷貝 /μL～6.1×100拷貝 /μL 后作為模板，分別利用建立的SYBR Green I 熒光定量PCR 方法和常規(guī)PCR 方法進行擴增。結(jié)果顯示，SYBR Green I 熒光定量PCR 對質(zhì)粒標準品的檢測下限為 6.1×101拷貝 /μL，而常規(guī) PCR 方法對相應質(zhì)粒標準品的檢測下限為 6.1×102拷貝 /μL (圖4)，表明本研究建立的方法敏感性較高。

2.5 重復性試驗結(jié)果 重復性試驗結(jié)果顯示，該方法批內(nèi)變異系數(shù)為1.1 %～2.8 %，批間變異系數(shù)為1.2 %～1.9 %，均小于3 %。表明本研究建立的方法具有良好的重復性。

2.6 臨床樣品檢測 采用建立的SYBR GreenⅠ熒光定量PCR 方法檢測47 份奶牛鼻拭子樣品，結(jié)果顯示共檢出IBRV 陽性樣品12 份，陽性檢出率為25.5 %(12/47)，而普通PCR 陽性檢出率為23.4 %(11/47)。經(jīng)計算，二者的符合率為97.87 %。計算方法為：100 %×(兩種方法共同認定陽性數(shù)+ 共同認定陰性數(shù))/ 受測樣品總數(shù)，表明該方法具有較好的檢測準確率。

表2 SYBR GreenⅠ熒光定量PCR 批內(nèi)與批間重復性試驗結(jié)果(copies/μL)6.1×106 copies /μL 6.1×105 copies /μL 6.1×104 copies /μL 6.1×103 copies /μL Ct values±SD 9.73±0.25 12.53±0.35 16.3±0.2 19.75±0.21 CV values 2.6 %2.8 %1.2 %1.1 %between groups±SD 9.69±0.18 12.57±0.23 16.18±0.19 19.84±0.26 between groups 1.9 %1.8 %1.2 %1.3 %

d total熒光定量PCR SYBR GreenⅠPCR Grand total Positive No.Negative No.Positive No.11 0 11 Negative No.1 35 36 12 35 47

3 討 論

IBRV 可引起潛伏感染，導致患牛長期攜帶病毒并排毒，造成大規(guī)模的牲畜感染，對牛群育肥、產(chǎn)奶量和繁殖影響極大[11]。隨著集約化、規(guī)模化畜牧生產(chǎn)的發(fā)展，建立IBRV 的群體檢測方法對該病的流行病學調(diào)查、臨床診斷、疫苗研制乃至疫病的防控等方面均具有重要的意義[12]。本研究建立了IBRV的SYBR Green I 熒光定量 PCR 檢測方法。SYBR Green I 對雙鏈DNA 具有高度專一性，其靈敏度要優(yōu)于常規(guī)PCR[13]。隨著分子生物學檢測方法在臨床中的應用，熒光定量PCR 技術(shù)已應用于對多種病毒的檢測，該檢測方法具有靈敏度高、特異性強、操作簡便、快速高效的特點，能夠?qū)Σ《緈RNA 進行準確定量[14]。

曲光剛等2012年建立的IBRVTaqMan 熒光定量PCR 敏感性試驗中檢測到質(zhì)粒標準品最低濃度為11 拷貝 /μL[4]；陳圣軍等 2013年建立的 IBRV SYBR Green I 熒光定量的檢測敏感度為 360 拷貝/25μL(14.4 拷貝 /μL)[5]；喬波等 2015年建立的 IBRV 的TaqMan-MGB 熒光定量PCR 檢測敏感度為 14.9 拷貝 /μL[6]；2017年張喜喜等建立的 IBRV 的 SYBR Green I 熒光定量PCR 與TaqMan 探針熒光定量PCR檢測到最低質(zhì)粒濃度為100 拷貝/μL[7]。

本實驗室通過對已經(jīng)報道的多個IBRV 基因序列進行比對，針對gD 基因保守區(qū)域[15]，設計引物，建立了SYBR GreenⅠ檢測方法。本實驗用該方法所能檢出的最低拷貝數(shù)為6.1×101拷貝/μL，對比其它IBRV 熒光定量檢測方法和常規(guī)PCR 方法，敏感度有提高；該方法檢測BVDV、BPIV3、BCoV、BEV等奶牛易感病毒均為陰性結(jié)果，表明該方法具有較強的特異性；批內(nèi)、批間重復性試驗的變異系數(shù)均小于3 %，表明該方法具有良好的重復性。采用建立的SYBR GreenⅠ熒光定量PCR 方法和普通PCR方法同時檢測了3 個規(guī)?；鏊蜋z的47 份奶牛鼻拭子，SYBR GreenⅠ熒光定量PCR 方法陽性樣品檢出率高于普通PCR 方法，檢測結(jié)果更加準確。

綜上所述，本研究建立的SYBR GreenⅠ熒光定量PCR 檢測方法具有特異、穩(wěn)定、高效、靈敏的優(yōu)點。該方法可更加快速高效檢出患病牛，便于牧場對患病牛的下一步治療處理；又可對IBRV 定量監(jiān)測，為IBRV 流行病學調(diào)查、疫病診斷提供了有力的技術(shù)支持。