基于豬流行性腹瀉病毒N蛋白間接ELISA抗體檢測(cè)方法的建立及初步應(yīng)用

楊朋霞，閆若潛，王華俊，馬震原，王淑娟，趙雪麗，謝彩華，趙月龍，李 孟

(1.河南農(nóng)業(yè)大學(xué)牧醫(yī)工程學(xué)院，河南 鄭州 450002；2.河南省動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心，河南 鄭州 450008；3.河南科技大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院，河南 洛陽(yáng) 471003)

豬流行性腹瀉(Porcine epidemic diarrhea，PED)是由PED 病毒(PEDV)引起的一種急性、高度接觸性的腸道傳染病。臨床上常引起豬水樣腹瀉、嘔吐和脫水等癥狀，各年齡階段的豬均可感染，尤其對(duì)10日齡以內(nèi)的仔豬危害最為嚴(yán)重。由于PED 經(jīng)典疫苗株CV777 滅活疫苗和弱毒疫苗的廣泛使用，使得PED 的流行得到一定的控制[1]。但是從2006年初開(kāi)始，個(gè)別免疫過(guò)經(jīng)典疫苗株的豬群開(kāi)始出現(xiàn)免疫保護(hù)失敗的情況。2010年以來(lái)，全國(guó)大部分豬場(chǎng)包括免疫過(guò)經(jīng)典疫苗株的豬場(chǎng)開(kāi)始大規(guī)模暴發(fā)由PEDV 變異強(qiáng)毒株引起的豬群腹瀉疫病[2]，其中以2日齡～10日齡的哺乳仔豬發(fā)病最為嚴(yán)重，發(fā)病率可達(dá) 100 %，病死率高達(dá) 80 %～100 %[3]。2013年Huang 等首次報(bào)道了美國(guó)PEDV 變異強(qiáng)毒株引起的豬群腹瀉性疫病[4]，之后該病迅速蔓延至 20 多個(gè)州，給美國(guó)養(yǎng)豬業(yè)造成了嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失。

PEDV 是冠狀病毒亞科(Coronavirinae) α 冠狀病毒屬(Alpha coronavirus)的成員，分子量約為28 kb，為不分節(jié)段的單股正鏈RNA 病毒，有囊膜。該病毒基因組順序?yàn)?'-Rep-S-ORF3-E-M-N-3'[5]，其中N基因編碼病毒的核蛋白，由441 個(gè)氨基酸組成，N蛋白在病毒轉(zhuǎn)錄復(fù)制和裝配等多個(gè)生物活性過(guò)程中發(fā)揮著重要作用[6]，同時(shí)該基因在PEDV 各亞型中具有較強(qiáng)的保守性[7]。因此，N 蛋白可以作為潛在的血清學(xué)診斷靶基因。

由于PED 的臨床癥狀與豬傳染性胃腸炎(Porcine transmissible gastroenteritis， TGE)、 豬 輪 狀病毒病(Porcine rotavirus，PoRV)等很難區(qū)分，僅憑臨床癥狀和病理剖檢難以鑒別檢測(cè)。目前國(guó)內(nèi)檢測(cè)PEDV 抗體普遍采用的是國(guó)外進(jìn)口的間接ELISA 試劑盒，但其價(jià)格昂貴，無(wú)形中提高了PEDV 流行病學(xué)的檢測(cè)以及臨床檢測(cè)的成本，難以真正的推廣應(yīng)用。本研究建立以原核表達(dá)的重組PEDV 變異強(qiáng)毒株 N 蛋白為包被抗原的間接ELISA 檢測(cè)方法，為PEDV 的抗體檢測(cè)提供一種實(shí)用的血清學(xué)檢測(cè)方法。

1 材料與方法

1.1 病毒及血清 PEDV 變異強(qiáng)毒株(PEDV-HNCADC-2017)由河南省動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心實(shí)驗(yàn)室分離并保存(國(guó)家菌毒種保藏中心登記號(hào)：CCTCC NO：V201766)；150 份 PEDV 陽(yáng)性血清：PEDV 經(jīng)典株(CV777)滅活疫苗免疫豬血清采自臨床免疫豬，變異強(qiáng)毒株滅活疫苗免疫豬血清為本實(shí)驗(yàn)室制備，經(jīng)中和試驗(yàn)和進(jìn)口商品化間接ELISA 試劑盒檢測(cè)結(jié)果均為PEDV 陽(yáng)性；150 份PEDV 陰性血清采自臨床未免疫過(guò)PEDV 疫苗的健康仔豬，經(jīng)上述兩種方法檢測(cè)結(jié)果均為陰性，且血清中和抗體效價(jià)均≤1∶21.5；并從上述陰陽(yáng)性血清中隨機(jī)挑選兩支血清分別定為陽(yáng)性、陰性對(duì)照。TGE、豬圓環(huán)病毒2 型(Porcine circovirus type 2，PCV2)陽(yáng)性血清為武漢科前生物股份有限公司間接ELISA 抗體檢測(cè)試劑盒中的陽(yáng)性對(duì)照血清；偽狂犬病毒(Pseudorabies virus，PRV)、豬瘟病毒(Classical swine fever virus，CSFV)、豬繁殖與呼吸障礙綜合征病毒(Porcine reproductive and respiratory syndrome virus，PRRSV)陽(yáng)性血清為美國(guó)愛(ài)德士(IDEXX)公司間接ELISA 抗體檢測(cè)試劑盒中的陽(yáng)性對(duì)照血清。500 份臨床哺乳母豬血清采自河南省背景清晰的5 個(gè)規(guī)?；B(yǎng)豬場(chǎng)，有2 個(gè)豬場(chǎng)免疫了PEDV 經(jīng)典株(CV777)滅活疫苗；1 個(gè)豬場(chǎng)未進(jìn)行PEDV 疫苗免疫，但仔豬發(fā)生了疑似PEDV 變異強(qiáng)毒株引起的腹瀉，通過(guò)實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)在病死仔豬組織中檢測(cè)到了PEDV 變異強(qiáng)毒株核酸；另外1 個(gè)為PEDV 陰性豬場(chǎng)。

1.2 主要試劑 BL21 感受態(tài)細(xì)胞 DE3 (+)、His-Tagged Protein Purification Kit 購(gòu)自康為世紀(jì)生物科技有限公司；pQE-30 購(gòu)自優(yōu)寶生物公司；核酸柱子提取試劑盒購(gòu)自北京世紀(jì)元亨有限公司；BCA Protein Assay Kit (BCA 試劑盒)購(gòu)自 TaKaRa 公司；pGEM-T Easy Vector 購(gòu)自Promega 公司；內(nèi)切酶購(gòu)自 NEW ENGLAND 公司；羊抗豬 HRP-IgG 購(gòu)自Proteintech 公司；TMB 單組份顯色液購(gòu)自Solarbio公司；western blot 試劑盒購(gòu)自索萊寶公司。進(jìn)口商品化PEDV 間接ELISA 檢測(cè)試劑盒購(gòu)自加拿大Bio-Vet 公司。

1.3 引物設(shè)計(jì)與合成 PEDV 作為一種基因組較大的RNA 病毒，容易發(fā)生核酸變異，導(dǎo)致新的變異株甚至基因型的出現(xiàn)，但分析近年來(lái)流行的PEDV強(qiáng)毒株以及本實(shí)驗(yàn)室保存的病毒株與經(jīng)典株，各病毒株之間具有高度同源性，且N 蛋白在PEDV 各結(jié)構(gòu)蛋白中具有較強(qiáng)保守性。因此，本實(shí)驗(yàn)參照Gen-Bank 中登錄的PEDV N (AF353511)基因序列，設(shè)計(jì)一對(duì)擴(kuò)增N 基因的特異性引物，P1：5'-TCAGGAT CCAATAACGCTGTACCCACTAAT-3'/P2：5'-TACGG TACCTTAATTTCCTGTATCGAAGATC-3'，上下游引物中5' 端分別添加BamHⅠ和KpnⅠ酶切位點(diǎn)，基因擴(kuò)增片段長(zhǎng)度為1 221 bp，由英濰捷基(上海)貿(mào)易有限公司合成。

1.4 PEDV N 基因的擴(kuò)增及表重組達(dá)載體的構(gòu)建按照核酸提取試劑盒說(shuō)明書提取PEDV 變異強(qiáng)毒株總RNA，以P2 為反轉(zhuǎn)錄引物將其反轉(zhuǎn)錄為cDNA后作為模板擴(kuò)增N 基因片段，回收目的片段并連接入pGEM-T Easy 載體，雙酶切、PCR 和測(cè)序鑒定陽(yáng)性重組質(zhì)粒，采用BamHⅠ和KpnⅠ對(duì)陽(yáng)性重組質(zhì)粒和pQE-30 表達(dá)載體雙酶切后，將目的片段亞克隆入pQE-30 載體構(gòu)建重組表達(dá)質(zhì)粒pQE30-N，通過(guò)PCR 和測(cè)序鑒定陽(yáng)性重組表達(dá)質(zhì)粒。

1.5 重組N (rN)蛋白的表達(dá)、純化及western blot分析 將上述構(gòu)建正確的重組表達(dá)質(zhì)粒pQE30-N 轉(zhuǎn)化入BL21 DE3(+)感受態(tài)細(xì)胞中，選取陽(yáng)性菌落培養(yǎng)至OD600nm為0.4～0.6，加入終濃度為0.2 mmol/L的IPTG，37 ℃誘導(dǎo)6 h。離心后收集菌體，PBS 重懸，超聲破碎后，分別取上清和沉淀進(jìn)行SDSPAGE 電泳確定目的蛋白的表達(dá)形式。按照說(shuō)明書對(duì)包涵體變性、過(guò)柱純化及復(fù)性，蔗糖濃縮后利用BCA 試劑盒測(cè)定純化蛋白濃度。以滅活的PEDV 陽(yáng)性豬血清(1∶200)為一抗，羊抗豬 HRP-IgG (1∶5 000)為二抗，對(duì)純化的rN 蛋白進(jìn)行western blot 鑒定，同時(shí)設(shè)空載體轉(zhuǎn)化產(chǎn)物為陰性對(duì)照，以確定重組蛋白與PEDV 陽(yáng)性血清的反應(yīng)原性。

1.6 間接ELISA 方法條件的優(yōu)化 采用矩陣法，分別對(duì)純化的 rN 蛋白包被濃度(4 μg/mL、2 μg/mL、1 μg/mL、0.5 μg/mL)， PEDV 陽(yáng)性豬血清和陰性豬血清稀釋倍數(shù)(1∶10、1∶20、1:50、1∶100、1∶200、1∶400)，包被液[pH7.2 的 PBS 4 ℃過(guò)夜、pH9.6 的碳酸鹽緩沖鹽(CB) 4 ℃過(guò)夜]、封閉液(1 %牛血清白蛋白、5 %脫脂奶粉和5 %魚(yú)明膠)、封閉條件(4℃，過(guò)夜和37℃，2 h)、羊抗豬HRP-IgG (1 ∶2 500、1∶5 000、1∶7 500、1∶10 000)、作用時(shí)間(30 min、45 min、60 min)、TMB 顯色時(shí)間(5 min、10 min、15 min)等進(jìn)行優(yōu)化，確定該方法的最佳反應(yīng)條件。

1.7 陰性樣品臨界值的確定 采用確定的最佳反應(yīng)條件檢測(cè)50 份PEDV 陰性豬血清(20 份是中和效價(jià)為1:21～1:21.5陰性樣本，另30 份從陰性樣品中隨機(jī)選擇），每個(gè)樣品做3 個(gè)重復(fù)，計(jì)算陰性樣品OD450nm的平均值()和標(biāo)準(zhǔn)方差(S)，當(dāng) OD450nm值＞+3S 時(shí)，在99.9 %的統(tǒng)計(jì)學(xué)水平上即可判定為陽(yáng)性，反之為陰性。

1.8 特異性試驗(yàn) 利用本研究建立的間接ELISA方法分別對(duì) TGEV、PCV2、PRV、CSFV、PRRSV陽(yáng)性血清進(jìn)行檢測(cè)，每份陽(yáng)性血清各做5 個(gè)重復(fù)取其平均值，并設(shè)PEDV 陽(yáng)性和陰性血清對(duì)照，測(cè)定OD450nm值來(lái)判斷該方法的特異性。

1.9 敏感性試驗(yàn) 取本實(shí)驗(yàn)保存的10 份PEDV 陽(yáng)性豬血清(變異強(qiáng)毒株滅活疫苗免疫豬血清)作2 倍倍比稀釋(1:2 ～1:512)，利用本研究建立的間接ELISA 方法進(jìn)行檢測(cè)，同時(shí)對(duì)上述陽(yáng)性血清進(jìn)行PEDV 變異株中和試驗(yàn)[8]，比較二者實(shí)驗(yàn)結(jié)果，判定該方法的敏感性。

1.10 重復(fù)性試驗(yàn) 采用同一批次包被的ELISA 反應(yīng)板檢測(cè)10 份豬血清樣品(PEDV 陽(yáng)性、陰性血清各5 份)，每份樣品重復(fù)檢測(cè)3 次；同時(shí)用3 個(gè)不同批次包被的ELISA 反應(yīng)板重復(fù)以上試驗(yàn)，根據(jù)檢測(cè)結(jié)果計(jì)算上述批內(nèi)和批間重復(fù)試驗(yàn)的變異系數(shù)，評(píng)估該方法的重復(fù)性。

1.11 臨床樣品檢測(cè) 采用建立的ELISA 方法檢測(cè)采自河南省5 個(gè)規(guī)模化養(yǎng)豬場(chǎng)的500 份臨床血清，并與進(jìn)口商品化PEDV 間接ELISA 抗體檢測(cè)試劑盒檢測(cè)結(jié)果相比較，計(jì)算二者的符合率，初步評(píng)價(jià)其在臨床上的應(yīng)用價(jià)值。

2 結(jié) 果

2.1 PEDV N 基因的擴(kuò)增及重組表達(dá)載體的構(gòu)建N 基因PCR 擴(kuò)增結(jié)果顯示獲得約1 200 bp 的目的片段，構(gòu)建的重組表達(dá)質(zhì)粒pQE30-N 經(jīng)PCR 鑒定后結(jié)果顯示，獲得約1 200 bp 的目的片段，與預(yù)期相符(圖1)。經(jīng)測(cè)序比對(duì)分析，獲得的PCR 產(chǎn)物與GenBank 中PEDV N 基因同源性為99.5 %以上，表明重組表達(dá)質(zhì)粒pQE30-N 構(gòu)建正確。

2.2 rN 蛋白的表達(dá)、純化及 western blot 分析SDS-PAGE 電泳顯示，rN 蛋白主要以包涵體形式表達(dá)；其經(jīng)純化處理后，獲得了分子量為50.4 ku、純度＞95 %的rN 蛋白；復(fù)性后經(jīng)western blot 檢測(cè)在約50.4 ku 處有特異性條帶(圖2)，經(jīng)BCA 蛋白濃度試劑盒測(cè)定，該rN 蛋白的濃度為1.081 mg/mL，表明該rN 蛋白具有較好的反應(yīng)原性。

2.3 間接ELISA 方法優(yōu)化結(jié)果 通過(guò)矩陣試驗(yàn)，對(duì)該ELISA 方法各反應(yīng)條件優(yōu)化的結(jié)果詳見(jiàn)表1。

表1 間接ELISA 檢測(cè)方法的反應(yīng)條件優(yōu)化結(jié)果最佳稀釋度Optimized dilutions反應(yīng)條件Reaction conditions rN 為包被抗原Coating with rN 2 μg/mL血清Serum 1:100包被條件Coating CB pH=9.6羊抗豬HRP-IgG Goat anti-pig HRP-IgG 1:5 000 4 ℃/16 h-18 h 37 ℃/1 h 4 ℃overnight封閉條件Blocking 1 %的牛血清白蛋白1%bovine serum albumin 37 ℃/2 h 37 ℃/30 min TMB 底物TMB substrate室溫避光Room temperature and avoided light 10 min

2.4 陰性樣品臨界值的確定 采用確定的最佳條件檢測(cè)50 份PEDV 陰性豬血清的OD450nm值，結(jié)果顯示 OD450nm值均介于0.062～0.226 (圖3)，計(jì)算平均值為 0.121 68，標(biāo)準(zhǔn)差 S 為 0.050 617，+3S 值為 0.274。當(dāng)OD450nm值＞0.274 時(shí)，在 99.9 %的統(tǒng)計(jì)學(xué)水平上可判定該P(yáng)EDV 血清樣品為陽(yáng)性，反之為陰性。

2.5 特異性試驗(yàn)結(jié)果 采用本研究建立的ELISA方法分別檢測(cè)TGE、PCV2、PRV2、CSFV、PRRSV陽(yáng)性豬血清，結(jié)果顯示，除PEDV 陽(yáng)性血清外其它病原陽(yáng)性血清的OD450nm值均小于臨界值(表2)，表明本研究建立的間接ELISA 方法與上述病原無(wú)交叉反應(yīng)性，具有較強(qiáng)的特異性。

2.6 敏感性試驗(yàn)結(jié)果 利用本研究建立的間接ELISA 方法和中和試驗(yàn)對(duì)10 份PEDV 陽(yáng)性血清分別進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果顯示10 份樣品中有5 份用本研究建立的方法能夠檢測(cè)出的樣品最高稀釋倍數(shù)比中和試驗(yàn)僅低1 個(gè)稀釋度，另外5 份與中和試驗(yàn)檢測(cè)結(jié)果一致(表3)，中和試驗(yàn)?zāi)軌驒z測(cè)出的陽(yáng)性血清的平均最高稀釋度為1 ∶153.6，而本研究建立的間接ELISA 檢測(cè)方法檢測(cè)出陽(yáng)性血清的平均最高稀釋度為1∶104。表明，本研究建立的間接ELISA 檢測(cè)方法敏感性較高，但略低于中和試驗(yàn)。

表3 敏感性試驗(yàn)血清編號(hào)Sera陽(yáng)性血清的最高稀釋倍數(shù)ELISA method can detect the highest dilution factor of positive serum陽(yáng)性血清的最高稀釋倍數(shù)Neutralization test can detect the highest dilution ratio of positive serum 1234567891 0 1:64 1:64 1:256 1:256 1:128 1:32 1:64 1:128 1:32 1:16 1:64 1:128 1:256 1:512 1:256 1:32 1:64 1:128 1:64 1:32

2.7 重復(fù)性試驗(yàn)結(jié)果 采用本研究建立的間接ELISA 方法對(duì)10 份背景清晰的血清進(jìn)行重復(fù)性檢測(cè)。結(jié)果顯示，批內(nèi)變異系數(shù)為2.54 %～3.25 %，批間變異系數(shù)為3.76 %～8.79 %，均小于10 % (表4)，表明該方法具有較好的重復(fù)性。

表4 間接ELISA 重復(fù)性試驗(yàn)(n=10)樣品序號(hào)Sample No.Intra batch CV%Inter batch CV%1234567891 0平均數(shù)X±SD 0.236±0.006 0.369±0.011 0.252±0.007 0.444±0.014 0.508±0.013 1.317±0.042 1.077±0.035 1.451±0.047 0.989±0.029 1.185±0.034變異系數(shù)CV (%)2.54 2.98 2.78 3.15 2.56 3.19 3.25 3.24 2.93 2.87平均數(shù)X±SD 0.329±0.015 0.452±0.027 0.429±0.019 0.638±0.024 0.672±0.055 0.891±0.067 0.694±0.061 0.976±0.064 1.193±0.065 0.702±0.057變異系數(shù)CV (%)4.56 5.98 4.43 3.76 8.18 7.52 8.79 6.56 5.45 8.12

2.8 臨床樣品檢測(cè)結(jié)果 采用本研究建立的間接ELISA 方法與進(jìn)口商品化間接ELISA 檢測(cè)試劑盒同時(shí)檢測(cè)500 份河南省5 個(gè)規(guī)?；B(yǎng)豬場(chǎng)的豬血清，該間接ELISA 檢測(cè)結(jié)果為：陽(yáng)性樣品372 份，陰性樣品128 份，陽(yáng)性檢出率為74.4 %；進(jìn)口商品化試劑盒檢測(cè)結(jié)果為：陽(yáng)性樣品370 份，陰性樣品130份，陽(yáng)性檢出率為74 %；二者符合率為99.6 %。表明本實(shí)驗(yàn)建立的間接ELISA 方法與商品化試劑盒的符合率較高，可以用于臨床樣品的檢測(cè)。

3 討 論

國(guó)內(nèi)外多位學(xué)者對(duì)2010年以來(lái)引起中國(guó)和2013年引起美國(guó)豬群發(fā)病的PEDV 變異強(qiáng)毒株分子遺傳變異規(guī)律進(jìn)行了研究，通過(guò)對(duì)其S 基因、M 基因、ORF3 基因遺傳變異分析，結(jié)果顯示，與經(jīng)典株CV777 或韓國(guó)減毒疫苗株DR13 相比，PEDV 變異強(qiáng)毒株屬于新的基因群，中國(guó)研究者將其命名為基因Ⅲ群[9-11]，而經(jīng)典株CV777 或DR13 疫苗株屬于基因Ⅰ群。PEDV 基因變異正是造成經(jīng)典疫苗免疫失敗和仔豬死亡率高的主要原因[12]。另外，PED 與TGE 臨床癥狀十分相似，很難區(qū)分，且其可以與輪狀病毒、冠狀病毒等發(fā)生混合感染，而臨床上卻缺少針對(duì)目前流行的PEDV 變異強(qiáng)毒株的有效疫苗和血清學(xué)檢測(cè)方法，導(dǎo)致該病已成為危害世界養(yǎng)豬業(yè)最為嚴(yán)重的疫病之一。因此，建立檢測(cè)PEDV 抗體的血清學(xué)檢測(cè)方法對(duì)于評(píng)價(jià)疫苗免疫效果及感染狀況很有必要。然而，目前市售的PEDV 間接ELISA抗體檢測(cè)試劑盒價(jià)格昂貴，難以在基層推廣。而本研究基于原核表達(dá)PEDV N 蛋白作為包被抗原，建立了檢測(cè)PEDV 血清抗體的間接ELISA 方法，并進(jìn)行了初步應(yīng)用，為PEDV 臨床血清抗體檢測(cè)提供技術(shù)手段。

N 蛋白作為PEDV 主要的結(jié)構(gòu)蛋白之一，在感染早期就能產(chǎn)生高水平抗體，且N 基因保守性較高，不易發(fā)生變異[13]，因此本研究選擇PEDV N 蛋白作為間接ELISA 的包被抗原。本研究以分離得到的PEDV 為模板，克隆并表達(dá)了PEDV N 蛋白，純化后其純度大于95 %，得到的重組蛋白濃度為1.081 mg/mL。經(jīng)western blot 分析，重組蛋白與滅活的PEDV 疫苗免疫豬血清具有良好的反應(yīng)原性，這為后續(xù)試驗(yàn)以及開(kāi)展其它基于PEDV 重組蛋白的研究，如膠體金免疫層析試紙等奠定了基礎(chǔ)。

本研究所建立的間接ELISA 方法可以特異性檢測(cè)PEDV 陽(yáng)性血清，與其它常見(jiàn)豬陽(yáng)性血清無(wú)交叉反應(yīng)，表明該方法特異性較強(qiáng)。病毒中和試驗(yàn)被公認(rèn)為是抗體檢測(cè)方法中靈敏且準(zhǔn)確的一種，因此，評(píng)估本研究建立方法的敏感性時(shí)，利用中和試驗(yàn)和該方法平行檢測(cè)，結(jié)果二者部分檢測(cè)結(jié)果一致，部分陽(yáng)性血清的檢測(cè)結(jié)果僅比中和試驗(yàn)低一個(gè)稀釋度。推測(cè)原因可能是由于中和抗體針對(duì)的是PEDV多種結(jié)構(gòu)蛋白產(chǎn)生的，而本研究建立的方法僅是針對(duì)N 蛋白產(chǎn)生的抗體，而N 蛋白只是PEDV 結(jié)構(gòu)蛋白中的一種[14]。但本研究建立的間接ELISA 方法仍具有較高敏感性。該ELISA 方法的批內(nèi)和批間變異系數(shù)均小于10 %，重復(fù)性良好。同時(shí)，用建立的間接ELISA 方法對(duì)500 份臨床豬血清進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果與進(jìn)口商品化的PEDV 間接ELISA 抗體檢測(cè)試劑盒的符合率為99.6 %，而這些血清既有來(lái)自經(jīng)典疫苗株免疫場(chǎng)，也有來(lái)自當(dāng)前野毒株感染場(chǎng)，這表明本研究建立的間接ELISA 方法可以用于臨床樣品的大批量檢測(cè)，而且對(duì)目前流行的PEDV 變異強(qiáng)毒株以及經(jīng)典株產(chǎn)生的抗體均能夠檢測(cè)到。

本研究建立了基于PEDV 變異強(qiáng)毒株N 蛋白為包被抗原的間接ELISA 檢測(cè)方法，且該方法特異性強(qiáng)、敏感性高、穩(wěn)定性好，可以為臨床PEDV 疫苗免疫和野毒感染豬血清提供一種有效的檢測(cè)方法和手段。