基于生長素誘導降解系統(tǒng)條件性敲除弓形蟲ATG6蛋白的研究

陳運通，陳赫明，付佳雯，龐 宇，鄭 君，賈洪林

(中國農業(yè)科學院哈爾濱獸醫(yī)研究所獸醫(yī)生物技術國家重點實驗室，黑龍江 哈爾濱 150069)

弓形蟲為胞內寄生原蟲，可感染包括人在內的幾乎所有哺乳動物[1]。宿主感染弓形蟲后，常呈隱性感染，臨床癥狀不明顯[2]。對于免疫力低下人群，艾滋病患者、器官移植者等，弓形蟲感染會造成其明顯臨床癥狀，表現(xiàn)如高熱、腦炎、心肌炎等癥狀。在妊娠中急性感染弓形蟲后常導致流產、死胎或胎兒畸形等[3]。

條件性基因敲除技術對弓形蟲關鍵基因功能的研究以及藥物靶點的鑒定具有不可替代的作用。目前弓形蟲使用的條件性基因敲除技術是利用四環(huán)素調控表達系統(tǒng)[4]。然而，四環(huán)素調控表達系統(tǒng)需要長時間作用才能達到調節(jié)蛋白表達的效果[5]。近年來，有研究報道生長素誘導降解系統(tǒng)可應用于弓形蟲基因的研究， 該方法將生長素誘導降解因子(AID)標簽插入到目的基因的3' 端，通過藥物篩選重組蟲株，該系統(tǒng)能夠在弓形蟲中快速的、可逆的調控蛋白的表達水平[6-7]。然而，某些基因的3' 端添加標簽將導致該基因功能的紊亂。因此，在弓形蟲中構建5'端基因融合表達AID標簽進行條件性敲除的方法十分必要。

在弓形蟲中進行基因敲除，通常通過抗藥基因篩選重組蟲株。但是這種方法需要添加目的基因的啟動子序列以保證基因的正常表達水平，需要進行多個步驟的基因克隆。因此，本研究采用TgKu80基因缺失蟲株，通過CRISPR/Cas9 方法和流式細胞術將AID標簽定點插入到目的基因的5'端，將標簽和目的基因融合表達，利用生長素調控目的基因的降解，從而實現(xiàn)條件性基因敲除。

ATG6 蛋白是PI3K 復合物的組成成分之一，在自噬起始過程中發(fā)揮關鍵作用[8]。有研究表明ATG6蛋白的C 端具有重要功能，不適合添加表達標簽[9]。因此，本研究擬構建其 N 端融合表達 AID 的TgATG6 條件性基因敲除蟲株，通過生長素調控TgATG6 的蛋白表達水平，為進一步研究TgATG6的功能奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 主要實驗材料 弓形蟲RH 蟲株、非洲綠猴腎細胞(Vero)以及人包皮成纖維細胞(HFF)為本實驗室保存；TgSAG2 兔源多克隆抗體及TgTubulin 兔源多克隆抗體由本實驗室制備；HA 鼠源單克隆抗體(MAb)以及 Flag 鼠源 MAb 購自 Sigma 公司；Dy-LightTM800-標記抗鼠IgG 和DyLightTM680-標記抗兔IgG 購自KPL 公司；紅色熒光Alexa Fluor 594 標記羊抗兔抗體及綠色熒光Alexa Fluor 488 羊抗鼠抗體均購自Thermo 公司；TIANamp Genomic DNA 提取試劑盒購自TIANGEN 公司；Human T Cell Nucleofector Kit 購自LONZA 公司；植物生長素(NAA)購自日本東京化工公司；pBluescript II KS 質粒、p12HAAID 質粒為本實驗室保存；pTUB1-OsTIR1-3Flag 由David Sibley 教授惠贈(Addgene plasmid #87258)。

1.2 載體構建 使用E-CRISP 在線軟件(http://www.e-crisp.org/E-CRISP/designcris/html)設計TgATG6基因敲除引導RNA (gRNA)序列(CAGCCGAACTTTGAG AATGA)及TgKu80gRNA 序列(GCGAGTGATTGTC CTGCTCT， CGAGACCCTTAGATCCGCAT)，并將該兩段序列分別插入到pCD 載體[10-11]，構建敲除質粒 pCD-TgATG6及pCD-TgKu80。根據(jù)ToxoDB(http://toxodb.org/toxo/)中TgATG6基因序列(TGGT1_221360)及p12HA-AID 質粒中12HA-AID基因序列，設計引物(TgATG6-F：5'-CTGCCTTCAATCGCGCG ATTCTCACAGCCGAACTTTGAGAATGTACCCTTA CGATGTC-3'/TgATG6-R： 5'-GCAGTCGATGCATCG ATGCAAAGACCTGGGAACCATCATCTTCACGAAC GCCGCCGC-3')，以 p12HA-AID 質粒為模板，對12HA-AID全長基因序列進行PCR 擴增，使其帶有TgATG6 起始密碼子兩端的同源臂序列(40 bp)，并將擴增產物命名為TgATG6-AID。以常規(guī)方法提取的弓形蟲RH 蟲株的基因組為模板，根據(jù)ToxoDB(http://toxodb.org/toxo/)中TgKu80基因序列(TGGT1_312510)設計引物(TgKu80- F1：5'-GAGCACAGATG GACGAAA-3'/TgKu80-R1：5'-TTTGCGAGGAGAATA AGA-3')擴增TgKu80基因的 5' UTR；設計引物(TgKu80-F2：5'-AAAACGAACGATTGCTTC-3'/TgKu80-R2： 5'-CACTGACGTTTTGTCACA-3')擴增TgKu80基因的3' UTR；以擴增的TgKu80基因的5' UTR 及3' UTR 的混合物為模板，以TgKu80-F1/TgKu80-R2為引物進行融合PCR 擴增，將融合的基因片段命名為TgKu80-Arm。以上PCR 擴增產物均通過測序鑒定。

1.3 TIR-3Flag 蟲株的構建及篩選 采用電穿孔技術將pTUB1-OsTIR1-3Flag 質粒轉入RH 蟲株內，正常培養(yǎng)8 h 后，加入氯霉素篩選，正常培養(yǎng)3 代后，使用連續(xù)稀釋法篩選TIR-3Flag 單克隆蟲株并擴大培養(yǎng)，分別以 Flag 鼠源MAb(1∶3 000)及 TgSAG2兔源多克隆抗體(1∶5 000)為一抗，DyLightTM800- 標記抗鼠 IgG(1∶5 000)和 DyLightTM800- 標記抗兔 IgG(1∶5 000)為二抗，利用western blot 鑒定篩選的單克隆蟲株；同時，將接種TIR-3Flag 單克隆蟲株24 h后的HFF 使用4%的多聚甲醛固定，4 ℃固定30 min后，使用PBS 清洗兩次，加入0.3 %的Triton-X 100透膜劑，室溫15 min 后使用PBS 清洗兩次，加入5 %的BSA/PBS。室溫封閉30 min，分別以Flag 鼠源 MAb (1 ∶1 000)及 TgSAG2兔源多克隆抗體(1∶1 000)為一抗，以Alexa Fluor 594 標記的羊抗兔抗體(1∶1 000)及 Alexa Fluor 488 標記的羊抗鼠抗體(1∶1 000 倍稀釋)為二抗，使用 DAPI (1∶5 000)染細胞核15 min，利用激光共聚焦(CLSM)鑒定篩選的單克隆蟲株，鑒定的陽性蟲株命名為TIR-3Flag。

1.4 TIR-3Flag-ΔTgKu80蟲株的構建及篩選 使用電穿孔技術將pCD-TgKu80 質粒及 TgKu80-Arm共轉染TIR-3Flag蟲株，培養(yǎng)16 h后，使用流式細胞分選儀篩選帶有綠色熒光的蟲株，按照4 只/孔的比例將其接入96孔板的HFF細胞中，7 d后于光學顯微鏡下觀察篩選TIR-3Flag-ΔTgKu80 單克隆蟲株并擴大培養(yǎng)，使用試劑盒提取TIR-3Flag-ΔTgKu80蟲株的基因組，以P1(5'-TAAGGCTACCCAACTCA C-3')/P4(5'-AGGAAACCGAACCAGAC-3')為引物，利用PCR方法擴增TgKu80基因全長，選取一株陽性蟲株的基因組，以P1(5'-TAAGGCTACCCAACTCA C-3')/P2(5'-CTGGCTCTTTCCTAGTCC-3')為引物，利用PCR方法擴增TgKu80的5'UTR基因全長及部分TgKu80的5'基因；以P3(5'-CGCGATAGTATTCAG AGG-3')/P4(5'-AGGAAACCGAACCAGAC-3')為引物，利用PCR方法擴增TgKu80的3'UTR基因全長及部分TgKu80的3'基因，陽性產物經(jīng)測序鑒定篩選的單克隆蟲株。

1.5 TgATG6_iKD 蟲株的構建及篩選 使用電穿孔技術將pCD-TgATG6 質粒及TgATG6-AID PCR 產物轉入 TIR-3Flag-ΔTgKu80 蟲株內，培養(yǎng)16 h 后利用流式細胞分選儀篩選帶有綠色熒光的蟲株，按照4只/孔的比例將其接入96 孔板的HFF 細胞中，7 d 后于光學顯微鏡下觀察篩選TgATG6 蛋白融合12HA-AID 表達的單克隆蟲株TgATG6_iKD 蟲株并擴大培養(yǎng)，使用試劑盒提取TgATG6_iKD 蟲株的基因組，以P5 (5'-GATGGGAGCACAATTGCCCG-3')/P6 (5'-GTGTGCAGAGCAGTCCTCCG-3')為引物，利用PCR 方法擴增12HA-AID 基因全長，選取一株陽性蟲株的基因組，以P5 及P7 (5'-ATCTCACCGGTG GCCATCCC-3')為引物擴增12HA-AID 基因的5' 端，陽性產物經(jīng)測序鑒定篩選的單克隆蟲株。

1.6 生長素誘導降解目的蛋白的檢測 將蟲株接種6 孔板培養(yǎng)的HFF 細胞接種TgATG6_iKD 蟲株，在收集蟲體前4 h 加入NAA，同時設置未加入NAA對照組，每組設置3 個平行孔，4 h 后以HA 鼠源MAb (1∶3 000)及 TgTubulin 兔源多克隆抗體(1∶5 000)為 一 抗 ， DyLightTM800-標記抗鼠IgG (1 ∶5 000)和DyLightTM800- 標記抗兔 IgG (1∶5 000)為二抗，利用western blot 法檢測12HA-AID-TgATG6 的表達水平。

同時，將接種TgATG6_iKD 蟲株單克隆蟲株24 h后的HFF 使用4%的多聚甲醛固定，4 ℃固定30 min后，使用PBS 清洗兩次，加入0.3 %的Triton-X 100透膜劑，室溫15 min 后，使用PBS 清洗兩次，加入5 %的BSA/PBS。室溫封閉30 min，分別以HA 鼠源 MAb (1∶1 000)及 TgTubulin 兔源多克隆抗體(1∶1 000)為一抗，以 Alexa Fluor 594 羊抗兔抗體(1 ∶1 000 倍稀釋)及 Alexa Fluor 488 羊抗鼠抗體(1∶1 000倍稀釋)為二抗，使用DAPI(1∶5 000)染細胞核15 min，利用激光共聚焦(CLSM)檢測12HA- AID-TgATG6 在蟲體內的含量。

2 結 果

2.1 載體構建以及PCR 片段擴增 以p12HA-AID質粒為模板，擴增TgATG6-AID，通過測序驗證結果顯示擴增產物序列與預期相符，表明獲得TgATG6-AID 基因片段；以弓形蟲基因組為模板，擴增TgKu80基因的5'UTR 及3'UTR，然后將5'UTR及3'UTR 通過融合PCR 擴增，通過測序驗證結果顯示擴增產物序列與預期相符，表明正確融合擴增TgKu80-Arm。

2.2 TIR-3Flag 蟲株的鑒定 采用western blot 方法鑒定TIR-3Flag 單克隆蟲株， 結果顯示，與RH 蟲株相比，TIR-3Flag 單克隆蟲株檢測到55 ku～72 ku的特異性條帶(箭頭所指條帶)，其大小與預測相符(圖1A)。將TIR-3Flag 單克隆蟲株接入HFF 細胞中，培養(yǎng)24 h 后利用IFA 檢測TIR-3Flag 的表達，結果顯示，可檢測到TIR-3Flag (綠色熒光)均勻的分布于蟲體胞漿內(圖1B)。表明TIR-3Flag 已轉入弓形蟲體內構建了TIR-3Flag 蟲株。

2.3 TIR-3Flag-ΔTgKu80蟲株的鑒定利用CRISPR/Cas9 方法將 TIR-3Flag 蟲株中的 TgKu80 基因敲除，構建 TIR-3Flag-ΔTgKu80 蟲株(圖2A)。以TIR-3Flag-ΔTgKu80 蟲株的基因組為模板，以P1/P4為引物，PCR 鑒定結果顯示，PCR 產物大小為4 140 bp，明顯小于 TIR-3Flag 蟲株(9 230 bp)，同時，TIR-3Flag-ΔTgKu80 蟲株無法使用在TgKu80 基因內部設計的引物(P1/P2 或P3/P4)擴增出目的條帶(圖2B)。序列分析顯示，TgKu80 基因被完全敲除。表明獲得TgKu80基因敲除的TIR-3Flag-ΔTgKu80單克隆蟲株。

2.4 TgATG6_iKD 蟲株的構建及篩選 采用CRISPR/Cas9 方法將12HA-AID 標簽插入到TgATG6 基因起始密碼子后，使其與TgATG6 融合表達(圖3A)，獲得TgATG6_iKD 蟲株。提取TgATG6_iKD 蟲株的基因組，對TgATG6_iKD 蟲株進行PCR 鑒定，結果顯示，在48 個單克隆蟲株中，有7 株獲得了序列插入，其插入效率約為14.6 %。在12HA-AID 基因內部設計一條下游引物，選取其中一株單克隆蟲株進一步進行PCR 驗證，結果顯示，與野生型蟲株相比，TgATG6_iKD 蟲株可擴增約590 bp 片段。對擴增產物進一步測序分析結果顯示，12HA-AID 標簽正確插入TgATG6 基因起始密碼子后。以上結果表明獲得TgATG6_iKD 單克隆蟲株(圖3B)。

2.5 生長素誘導降解目的蛋白的檢測結果 將TgATG6-iKD 蟲株接種HFF 細胞，加入NAA 4 h 后檢測TgATG6 蛋白表達水平，結果顯示，與未加入NAA 的蟲株相比，加入NAA 4 h 后，TgATG6 蛋白含量明顯下降(圖4A)。同時，IFA 結果顯示，加入NAA 4 h 后，TgATG6 的蛋白(綠色熒光)表達水平明顯下調(圖4B)。表明 NAA 可以有效降低 TgATG6在蟲體內的含量。

3 討 論

使用CRISPR/Cas9 技術可敲除目的基因，然而對于某些生長必須的關鍵基因來說，無法單純的使用CRISPR/Cas9 技術對其進行完全敲除。因此，條件性基因敲除技術對關鍵基因功能的研究具有不可替代的作用。

植物生長激素作為植物激素的一種，其參與調控基因的表達水平，AID 蛋白是生長素調控信號通路中的關鍵因子。當NAA 濃度升高時，NAA 發(fā)揮類似分子螯合劑的功能，將AID 和TIR 蛋白參與形成的復合物緊密地結合在一起，TIR 蛋白屬于F-box Transport Inhibitor Response 家族成員之一，參與形成E3 泛素連接酶SCF 復合物(Skp1、Cullin1、F-box protein)，TIR 通過與SCF 復合物中的其它成分配合，將泛素添加至AID 蛋白，泛素化的AID 蛋白最終通過蛋白酶體途徑被降解[12]。近年來，生長素誘導的蛋白表達系統(tǒng)已經(jīng)應用于酵母細胞[13]、哺乳動物細胞[12]、瘧原蟲[14]以及弓形蟲[6-7]等。生長素誘導的蛋白表達系統(tǒng)與之前廣泛應用的四環(huán)素誘導的蛋白表達系統(tǒng)相比較具有調控速度快、調控效果明顯等優(yōu)點。

目前在弓形蟲中應用的生長素誘導降解系統(tǒng)是將AID 標簽連同HXGPRT 抗性基因插入到目的基因的3'端，通過加入霉酚酸(MPA)及黃嘌呤(Xan)兩種藥物篩選獲得單克隆蟲株[6-7]。對于3' 端不能融合標簽的基因，該方法存在一定的局限性。因此，本研究針對這一問題對目前采用的AID 標簽連同HXGPRT 抗性基因插入到目的基因的3' 端這一方法進行改良，從而實現(xiàn)將AID 標簽插入弓形蟲基因組的任意位置。有研究表明，敲除弓形蟲Ku80 基因能抑制蟲體內的非同源末端重組修復，提高同源重組修復的效率[15]。本研究基于TIR-3Flag 蟲株使用CRISPR/Cas9 技術構建 TIR-3Flag-ΔTgKu80 蟲株，同時本研究首次基于TgKu80基因缺失蟲株，通過流式術成功高效的獲得了插入12HA-AID 標簽的蟲株。該方法可在不改變基因啟動子的條件下將外源性標簽插入弓形蟲基因組的任意位置，為將弓形蟲基因組定點插入提供新的途徑。本研究進一步研究表明，生長素可以快速的誘導降解N 端融合表達12HA-AID標簽的目的蛋白。本研究為弓形蟲關鍵基因功能研究補充了有效手段。

自噬是真核生物維持細胞穩(wěn)態(tài)的重要機制[16]。當弓形蟲處于卵囊期時，無法從外界環(huán)境獲取充足的養(yǎng)分，自噬途徑對于弓形蟲的生存來說可能更重要[17]。因此，弓形蟲的自噬相關基因是極具應用前景的藥物靶點。ATG6 蛋白作為PI3K 的重要組成成分之一，在自噬的起始過程發(fā)揮重要的作用[18]。本研究為進一步解析TgATG6 基因的功能打下堅實基礎。