基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)三芪口服液治療糖尿病腎病的作用機(jī)制

林嘉榮 張 蕾 桂定坤 曾貴興 吳禹池 鄒 川 林啟展

1.廣州中醫(yī)藥大學(xué)第二臨床醫(yī)學(xué)院，廣東廣州 510405；2.廣州中醫(yī)藥大學(xué)第二附屬醫(yī)院腎內(nèi)科，廣東廣州 510120；3.上海交通大學(xué)附屬第六人民醫(yī)院腎內(nèi)科，上海 200233

據(jù)流行病學(xué)研究，我國(guó)慢性腎臟病發(fā)病率約10.8%[1]，而慢性腎臟病最終發(fā)展為腎終末期疾?。‥SRD），已經(jīng)成為我國(guó)嚴(yán)重的公共衛(wèi)生事業(yè)問題。在我國(guó)，糖尿病腎病作為繼慢性腎小球疾病之后慢性腎臟病的第二大病因[2]，且近年有升高趨勢(shì)。在西方國(guó)家，糖尿病腎病已成為導(dǎo)致ESRD 的第一大病因[3]。因此，防治糖尿病腎病的重要性不言而喻。國(guó)醫(yī)大師張琪教授認(rèn)為，糖尿病腎病病機(jī)以本虛標(biāo)實(shí)為特點(diǎn)，包含氣陰兩虛、脾腎氣虛，脾腎虛衰三個(gè)主證及夾血瘀、夾濕濁、晚期以濕濁毒瘀血壅結(jié)三個(gè)兼證[4]。張?jiān)倏档萚5]根據(jù)多年臨床經(jīng)驗(yàn)，認(rèn)為糖尿病腎病氣虛血瘀病機(jī)貫穿病程始終，根據(jù)益氣活血理論防治糖尿病腎病的臨床實(shí)踐，以三七、黃芪為主要成分開發(fā)的三芪口服液取得了良好的臨床療效，但其機(jī)制尚不明確。目前針對(duì)中藥復(fù)方有效成分及作用機(jī)制主要通過動(dòng)物實(shí)驗(yàn)、細(xì)胞實(shí)驗(yàn)等方法進(jìn)行，但由于中藥復(fù)方活性成分復(fù)雜，其作用機(jī)制研究存在一定的困難。隨著科技的發(fā)展及化合物研究的興起，網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)為復(fù)雜的中藥系統(tǒng)研究提供了新的思路及方法。本研究運(yùn)用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的方法，對(duì)三芪口服液的活性成分及作用靶點(diǎn)進(jìn)行預(yù)測(cè)分析，探討其治療糖尿病腎病的作用機(jī)制，為三芪口服液的作用機(jī)制研究提供實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)及理論研究。

1 材料與方法

1.1 材料

TCMSP 數(shù)據(jù)庫、DrugBank 數(shù)據(jù)庫、String 數(shù)據(jù)庫、GeneCards 數(shù)據(jù)庫、OMIM 數(shù)據(jù)庫、DisGeNET 數(shù)據(jù)庫；DAVID 6.8 數(shù)據(jù)庫；KEGG 數(shù)據(jù)庫；Cytoscape 3.2.1 軟件。

1.2 藥物分子信息收集及活性成分篩選

在TCMSP 數(shù)據(jù)庫中檢索得到三七和黃芪的藥物動(dòng)力學(xué)（ADME）參數(shù)信息，將生物利用度（OB）和類藥性（DL）作為篩選指標(biāo)，其篩選閾值均為OB ≥30%，DL ≥0.18[6]，篩選出三芪口服液中的活性成分。

1.3 三芪口服液潛在作用靶點(diǎn)預(yù)測(cè)

基于篩選的活性成分預(yù)測(cè)化合物潛在的靶點(diǎn)，經(jīng)DrugBank 數(shù)據(jù)庫將測(cè)出的靶點(diǎn)，以基因簡(jiǎn)稱命名。

1.4 糖尿病腎病相關(guān)靶點(diǎn)構(gòu)建

本研究基于GeneCards 數(shù)據(jù)庫、OMIM 數(shù)據(jù)庫、DisGeNET 數(shù)據(jù)庫構(gòu)建糖尿病腎病的相關(guān)靶點(diǎn)。Gene-Cards 數(shù)據(jù)庫整合了約125 個(gè)網(wǎng)絡(luò)來源的基因數(shù)據(jù)（包括基因組、轉(zhuǎn)錄組學(xué)、蛋白質(zhì)組學(xué)等）；OMIM 數(shù)據(jù)庫通過對(duì)新的病癥分類并命名、收錄表型和相關(guān)病因基因的關(guān)系來收錄人類孟德爾疾病信息；DisGeNET是目前可用的最大和最全面的人類基因-疾病協(xié)會(huì)（GDAs）存儲(chǔ)庫之一，旨在解決有關(guān)人類疾病遺傳基礎(chǔ)的各種問題。以“Diabetic nephropathy”為檢索詞，在三大數(shù)據(jù)庫中檢索其疾病相關(guān)基因。最后合并三大數(shù)據(jù)庫檢索到的基因靶點(diǎn)，剔除重復(fù)值取其并集，完成糖尿病腎病相關(guān)靶點(diǎn)的構(gòu)建。Venny 2.1.0 工具可以將三大數(shù)據(jù)庫得到的疾病靶點(diǎn)與藥物作用的靶點(diǎn)進(jìn)行篩選，從而得出兩者之間的重復(fù)靶點(diǎn)，即得出藥物治療疾病的靶點(diǎn)。

1.5 蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用（PPI）全局網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建

將糖尿病腎病相關(guān)靶點(diǎn)與三芪口服液潛在靶點(diǎn)導(dǎo)入String 蛋白質(zhì)互作數(shù)據(jù)庫，進(jìn)行PPI 分析，利用Cytoscape3.2.1 構(gòu)建靶點(diǎn)-靶點(diǎn)PPI 網(wǎng)絡(luò)。設(shè)置網(wǎng)絡(luò)中節(jié)點(diǎn)大小和顏色深淺反映度的大小，邊的粗細(xì)反映連接度的大小，通過構(gòu)建這一網(wǎng)絡(luò)分析三芪口服液的作用機(jī)制。

1.6 潛在靶點(diǎn)生物學(xué)過程分析及通路富集

將三芪口服液-糖尿病腎病-基因數(shù)據(jù)集導(dǎo)入DAVID 6.8 數(shù)據(jù)庫進(jìn)行GO 分析及KEGG 通路富集分析，從而得到基因的功能水平分析結(jié)果和共同通路。

2 結(jié)果

2.1 三七-黃芪活性成分的篩選

通過TCMSP 數(shù)據(jù)庫檢索的三七化學(xué)成分119 個(gè)，黃芪化學(xué)成分87 個(gè)，通過OB ≥30%和DL ≥0.18 進(jìn)一步篩選到三七、黃芪潛在活性成分各為8 個(gè)和20 個(gè)，剔除重復(fù)成分1 個(gè)，共27 個(gè)。見表1。

2.2 三芪口服液治療糖尿病腎病的潛在作用靶點(diǎn)預(yù)測(cè)

利用DrugBank 數(shù)據(jù)庫，得到三七、黃芪活性成分靶點(diǎn)各為162 個(gè)和180 個(gè)，去除重復(fù)靶點(diǎn)后得三芪口服液活性成分靶點(diǎn)191 個(gè)。在GeneCards 數(shù)據(jù)庫、OMIM 數(shù)據(jù)庫、DisGeNET 數(shù)據(jù)庫共收集糖尿病腎病相關(guān)靶點(diǎn)基因共2423 個(gè)。利用Venny 2.1.0 工具將藥物潛在作用的靶點(diǎn)基因同疾病基因進(jìn)行映射比對(duì)并繪制維恩圖（圖1），獲得共同基因118 個(gè)。

2.3 藥物-活性成分-關(guān)鍵作用靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建與分析

將三七、黃芪兩味藥物共27 個(gè)活性成分及118 個(gè)關(guān)鍵靶點(diǎn)基因?qū)隒ytoscape 軟件進(jìn)行網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建及可視化，見圖2（封四）。其中連接度最高的化合物有槲皮素（quercetin）、山奈酚（kaempferol）、芒柄花素（formononetin）、異鼠李素（isorhamnetin）等；連接度最高的基因有PTGS2、PTGS1、ADRB2、PRSS1、AR、PPARG、ACHE、JUN、AKR1B1 等。

2.4 關(guān)鍵靶點(diǎn)基因蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò)分析

將三七-黃芪治療糖尿病腎病的118 個(gè)潛在的關(guān)鍵靶點(diǎn)基因?qū)隨tring 數(shù)據(jù)庫獲取蛋白質(zhì)相互作用關(guān)系，再將獲得數(shù)據(jù)導(dǎo)入Cytoscape 軟件繪制蛋白關(guān)系網(wǎng)絡(luò)（圖3）。以Degree 數(shù)值反映節(jié)點(diǎn)的大小，節(jié)點(diǎn)的Degree 數(shù)值越大，節(jié)點(diǎn)越大。以Combine score 反映節(jié)點(diǎn)連接之間邊的粗細(xì)，Combine score 越大，邊越粗。其中Degree 數(shù)值前5 名的靶點(diǎn)基因?yàn)镴UN、AKT1、MAPK1、RELA、IL-6。表明這些基因在網(wǎng)絡(luò)中具有重要地位，這些靶點(diǎn)基因在三七-黃芪治療中具有重要意義，可作為三七-黃芪藥對(duì)有效成分作用的靶點(diǎn)基因。

2.5 關(guān)鍵靶點(diǎn)基因生物功能及通路分析

GO 分析結(jié)果顯示，三芪口服液的118 個(gè)潛在關(guān)鍵靶點(diǎn)基因的富集的前10 個(gè)生物學(xué)功能主要為蛋白質(zhì)異二聚化活性、受體配體活性、細(xì)胞因子受體結(jié)合、細(xì)胞因子活性、血紅素結(jié)合、磷酸酶結(jié)合、下游受體信號(hào)傳感器活動(dòng)、RNA 聚合酶Ⅱ轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合、激酶調(diào)節(jié)劑活性。表明三芪口服液通過參與調(diào)控多種生物學(xué)過程而發(fā)揮治療糖尿病腎病的作用。KEGG 通路富集分析顯示，三芪口服液的關(guān)鍵基因靶點(diǎn)主要富集的通路為糖尿病并發(fā)癥中的AGE-RAGE 信號(hào)通路、流體剪切應(yīng)力和動(dòng)脈粥樣硬化、IL-17 信號(hào)通路、HIF-1 信號(hào)通路等。表明三芪口服液的活性成分通過各個(gè)通路對(duì)糖尿病腎病有治療作用。見圖4～5。

表1 三七與黃芪潛在活性成分

圖1 疾病靶點(diǎn)基因與三七-黃芪靶點(diǎn)基因的匹配

圖3 三芪口服液的蛋白質(zhì)互相作用網(wǎng)絡(luò)

3 討論

圖4 三芪口服液治療糖尿病腎病關(guān)鍵靶點(diǎn)的GO 生物學(xué)過程富集分析

糖尿病腎病是糖尿病的常見并發(fā)癥之一，是慢性腎臟病的第二大原發(fā)病。楊霓芝教授根據(jù)多年的臨床經(jīng)驗(yàn)，認(rèn)為糖尿病的基本病機(jī)為氣虛血瘀證[7]。益氣活血法為治療糖尿病腎病的基本大法，應(yīng)貫穿于糖尿病腎病治療的始終。根據(jù)這一理論，楊教授主持開發(fā)了廣東省院內(nèi)制劑——三芪口服液，在臨床治療中收到了良好的療效[8]。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，三芪口服液可減輕實(shí)驗(yàn)性糖尿病腎病模型大鼠蛋白尿及腎臟損害，改善脂質(zhì)代謝，并且可以控制血糖和改善腎血流動(dòng)力學(xué)，發(fā)揮腎臟保護(hù)作用[5，9]。在三芪口服液的初步藥理機(jī)制研究中發(fā)現(xiàn)，三芪口服液可能通過調(diào)節(jié)腎組織MMP-9/TIMP-1 蛋白表達(dá)，改善Col-Ⅳ代謝，以及抑制腎組織TGFβ-1 表達(dá)，發(fā)揮對(duì)糖尿病腎病的保護(hù)作用[10-11]。具體機(jī)制仍需進(jìn)一步研究。

在三芪口服液的藥物-活性成分-基因靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)中，活性成分槲皮素、山奈酚、芒柄花素、異鼠李素等是網(wǎng)絡(luò)中的重要節(jié)點(diǎn)。研究表明，槲皮素能通過抑制氧化應(yīng)激改善腎功能不全及腎臟病理損傷[12-13]。山奈酚通過抑制細(xì)胞中高血糖誘導(dǎo)的RhoA 活化，降低氧化應(yīng)激、促炎細(xì)胞因子（TNF-α 和IL-1β）和腎臟纖維化[14]。芒柄花素也證實(shí)了可以減輕腎臟損害，改善腎功能[15]。異鼠李素通過抑制NF-κB 信號(hào)通路發(fā)揮腎臟保護(hù)作用[16]。目前的相關(guān)研究均證實(shí)了三七與黃芪的活性成分對(duì)糖尿病腎病有治療作用，也說明了預(yù)測(cè)的合理性。而在重要的基因節(jié)點(diǎn)中，有研究發(fā)現(xiàn)，PPARG 是中國(guó)糖尿病腎病進(jìn)展的風(fēng)險(xiǎn)[17]。在一項(xiàng)中國(guó)的前瞻性隊(duì)列研究[18]中發(fā)現(xiàn)，IL-6 基因多態(tài)性可作為中國(guó)2 型糖尿病患者腎病進(jìn)展的預(yù)測(cè)因子，而另一項(xiàng)研究[19]表明，IL-6 基因增加1 型糖尿病腎病患者白蛋白與肌酐的增加以及不利于血糖、血脂控制。PTGS2、PTGS1、ADRB2、PRSS1、AR 等基因目前還未有明確的證據(jù)研究，或許可作為糖尿病腎病研究的新靶點(diǎn)。

GO 分析結(jié)果顯示，富集的關(guān)鍵基因靶點(diǎn)涉及的生物學(xué)過程細(xì)胞因子、受體結(jié)合、RNA 聚合酶轉(zhuǎn)錄。KEGG 通路富集分析顯示，三芪口服液通過糖尿病并發(fā)癥中的AGE-RAGE 信號(hào)通路、流體剪切應(yīng)力和動(dòng)脈粥樣硬化、IL-17 信號(hào)通路、HIF-1 信號(hào)通路等信號(hào)通路發(fā)揮對(duì)糖尿病腎病的治療作用。研究證實(shí)，AGERAGE 信號(hào)通路是糖尿病及其并發(fā)癥發(fā)病機(jī)制中的信號(hào)傳導(dǎo)機(jī)制[20]，通過氧化應(yīng)激加重糖尿病血管損傷[21]，增加腎功能惡化及心血管事件風(fēng)險(xiǎn)，導(dǎo)致全因死亡率增加[22]。在一項(xiàng)病例對(duì)照及生物學(xué)分析的研究中發(fā)現(xiàn)，糖尿病腎病患者的PI3K/Akt、流體剪切應(yīng)力和動(dòng)脈粥樣硬化、AGE-RAGE、TGF-β1 和松弛素信號(hào)通路的基因的循環(huán)miRNA 表達(dá)上調(diào)[23]。許多研究表明[24-26]，IL-17 通過促炎性反應(yīng)加重糖尿病腎病進(jìn)展，而一項(xiàng)新的研究[27]卻發(fā)現(xiàn)，低劑量IL-17 療法可以預(yù)防和逆轉(zhuǎn)糖尿病腎病、代謝綜合征和相關(guān)器官纖維化，這可能是因?yàn)镮L-17 對(duì)炎癥的調(diào)節(jié)作用依賴于疾病背景、組織、同種型和受體-配體相互作用[28]。缺氧誘導(dǎo)因子HIF-1 能介導(dǎo)缺氧和誘導(dǎo)糖尿病腎病纖維化[29]，但是開發(fā)脯氨酰羥化酶抑制劑以促進(jìn)HIF 活性以治療腎性貧血也可能靶向糖尿病誘導(dǎo)的腎缺氧，需要進(jìn)行進(jìn)一步的臨床試驗(yàn)驗(yàn)證結(jié)果[30]。

總之，本研究運(yùn)用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法，探討了三芪口服液主要成分治療糖尿病腎病的復(fù)雜網(wǎng)絡(luò)關(guān)系及機(jī)制。研究結(jié)果表明三芪口服液主要活性成分、作用靶點(diǎn)、生物學(xué)過程及相關(guān)通路，為進(jìn)一步研究其治療機(jī)制提供新思路，但其結(jié)果仍需進(jìn)行相關(guān)基礎(chǔ)研究及相關(guān)研究進(jìn)行驗(yàn)證。