高通量測序技術檢測非典型子宮內(nèi)膜增生疾病微小RNA 的差異表達

唐世倩 褚春芳 李 婷 鄭 萍 周 琦 劉菊紅 王 玉

首都醫(yī)科大學附屬北京婦產(chǎn)醫(yī)院婦科，北京 100026

非典型子宮內(nèi)膜增生（atypical endometrial hyperplasia，AEH）疾病被認為是子宮內(nèi)膜癌的癌前病變，在雌激素持續(xù)作用下，最終可進展為子宮內(nèi)膜癌[1]，目前AEH 的發(fā)病機制并不完全清楚。大量研究發(fā)現(xiàn)，AEH 疾病存在著多種基因的異常表達，提示AEH 是由多種基因共同參與的、復雜的生物演變過程[2]。

微小RNA（microRNA，miRNA)是一種小分子RNA，它可通過影響目標mRNA 的穩(wěn)定性及翻譯，參與細胞周期、分化、生長、新陳代謝等多個生物過程的調(diào)控[3]，現(xiàn)已證實多種miRNA 參與機體內(nèi)腫瘤的形成，并發(fā)揮巨大調(diào)節(jié)作用，但其在AEH 中的作用目前尚不清楚。為了探索miRNA 在AEH 中的作用，本研究采用高通量測序技術篩選正常人群與AEH 患者子宮內(nèi)膜的差異miRNA，并進行生物學分析，了解差異miRNA 在AEH 中作用及機制。

1 對象與方法

1.1 研究對象

收集2016 年1 月～2017 年1 月在首都醫(yī)科大學附屬北京婦產(chǎn)醫(yī)院（以下簡稱“我院”）就診的3 例AEH患者（實驗組）及3 名正常女性（對照組）的子宮內(nèi)膜組織標本，年齡25～40 歲。實驗組平均年齡（36.33±1.86）歲，平均體重指數(shù)（BMI）（24.31±1.42）kg/m2；對照組平均年齡（30.00±2.89）歲，平均BMI（18.25±1.36）kg/m2。兩組年齡、BMI 比較，差異無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)，具有可比性。

實驗組樣本選自經(jīng)診斷性刮宮術，術后病理證實為AEH 內(nèi)膜組織的患者；對照組樣本選自同期行診斷性刮宮術，術后病理證實為正常增生期子宮內(nèi)膜的女性。所有研究對象既往均未使用激素藥物治療，且無甲狀腺、子宮肌瘤、惡性腫瘤、糖尿病、多囊卵巢綜合征等病史。所有研究對象均簽署知情同意書，本研究經(jīng)我院醫(yī)學倫理委員會批準。

1.2 研究方法

用生理鹽水洗滌兩組診斷性刮宮術后得到的內(nèi)膜組織標本，置EP 管中，液氮快速冷凍后，-80℃冰箱保存待測。根據(jù)術后病理結(jié)果挑選符合要求的組織標本，將實驗組與對照組配對。

1.2.1 總RNA 提取及文庫構(gòu)建 總RNA 提取及文庫構(gòu)建由深圳華大基因科技有限公司完成。取適量組織樣品研磨后，加1.5 mL TRIzol 裂解液，放入組織研磨機（TissueLyser Ⅱ）中研磨30 s，使組織細胞充分裂解，12000 g 離心5 min（4°C），取上清液，抽提純化樣品的總RNA。采用安捷倫2100 芯片生物分析儀（Agilent 2100 Bioanalyzer）評估總RNA，NanoDrop Lite分光光度計(賽默飛世爾科技公司)檢測A260/A280 的總RNA 純度。將檢驗合格的總RNA 采用small RNA文庫構(gòu)建試劑盒TruSeq Small RNA Library Prep Kit（illumina，貨號：RS-200-0012）進行文庫構(gòu)建。取200～1000 ng RNA 樣品，通過聚丙烯酰胺凝膠電泳（PAGE）分離不同大小的RNA 片段，收集18～30 nt 之間的RNA條帶。根據(jù)small RNA 文庫構(gòu)建試劑盒在RNA 3′、5′端接上接頭，通過與3′端互補的逆轉(zhuǎn)錄引物反轉(zhuǎn)錄為cDNA，反應條件：70℃2 min，50℃1 h。PCR 擴增程序：98℃30 s；98℃10 s，60℃30 s，72℃15 s，11 個循環(huán)；72℃10 min；4℃保持。使用PAGE 對PCR 產(chǎn)物切膠回收純化，回收產(chǎn)物溶于溴化乙錠（EB）中，構(gòu)建small RNA 文庫。采用Agilent 2100 Bioanalyzer 檢測small RNA 文庫，經(jīng)測序平臺（Illumina HiSeq-4000）對該文庫進行高通量測序。

1.2.2 miRNA 信息分析 處理原始數(shù)據(jù)：過濾低質(zhì)量讀數(shù)，如去除長度小于18 nt 的片段、去除5′和3′端口質(zhì)量連續(xù)低于10 的堿基及含有＞10% N 堿基的讀數(shù)等。將處理后的序列運用序列拼接工具bowtie 定位到人類基因組，通過對比分析，去除與基因組不匹配的序列。再將匹配序列分別與基因組重復序列Gen-Bank 數(shù)據(jù)庫和Rfam 10.0 數(shù)據(jù)庫進行對比，篩選和去除其他小分子RNA 序列，剩余序列應用Blast 和miRbase 21.0 數(shù)據(jù)庫比對，鑒定已知的miRNA。對存在于人類基因組外顯子反義鏈、內(nèi)含子、基因間區(qū)，但未確定的sRNA 而言，通過Mirdeep 篩選miRNA 的生物特征得到新的miRNA，將鑒定出已知和預測的新miRNA 用于后續(xù)分析。

1.2.3 已知miRNA 差異表達分析 應用DEGseq 軟件對已知的miRNA 進行表達分析，閾值為|log FC|＞2、qvalue＜0.001，篩選出有顯著性差異的miRNA。對差異表達的miRNA 進行Venn 分析，篩選3 組或2 組間有交集的miRNA 作為差異表達，進入下游分析。

1.2.4 miRNA 的功能分析 用miRWalk 2.0、miRanda、PITA、RNAhybrid 和Targetscan 數(shù)據(jù)庫預測miRNA 的靶基因，使用R 包clusterprofiler 進行KEGG 富集分析。使用BH（Benjamini 和Hochberg）法校正P 值，以P＜0.05 為截止值。

1.2.5 miRNA 之間相互作用 若兩miRNA 共同調(diào)控同一靶基因，則該靶基因為兩miRNA 共調(diào)控靶基因，對共同調(diào)控的靶基因進行GO Biological Process 富集分析，并根據(jù)富集到的條目數(shù)量來量化miRNA 之間功能協(xié)同作用。

1.3 統(tǒng)計學方法

采用SPSS 23.0 統(tǒng)計學軟件進行數(shù)據(jù)分析，計量資料用均數(shù)±標準差（）表示，兩組間比較采用t 檢驗；計數(shù)資料用率表示，組間比較采用χ2檢驗。以P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 small RNA 文庫表達情況

實驗組和對照組經(jīng)高通量測序分別得到45 446 485 和46 115 154 條原始序列，數(shù)據(jù)處理后，得到的序列分別為44 418 630 及45 097 769 條。

2.2 miRNA 及相應靶基因情況

通過軟件分析及比對，實驗組得到284 個已知miRNA 及1925 個新miRNA；對照組得到409 個已知miRNA 及2314 個新miRNA，進一步通過數(shù)據(jù)庫預測其相應的靶基因。見表1。

表1 miRNA 及相應靶基因情況

2.3 差異miRNA 分析

結(jié)果顯示，在閾值為|log FC|＞2，qvalue＜0.001的條件下，得到3 組（346、66、11 個）差異miRNA，下游分析共獲得18 個miRNA，其中17 個為上調(diào)miRNA，包括：hsa-miR-375、hsa-miR-1307-5p、hsa-miR-671-3p、hsa-miR-1247-5p、hsa-miR-340-3p、hsamiR-100-3p、hsa-miR-345-5p、hsa-miR-3909、hsamiR-431-5p、hsa-miR-1247-3p、hsa-miR-4454、hsamiR-182-5p、hsa-miR-4286、hsa-miR-577、hsa-miR-455-3p、hsa-miR-183-5p、hsa-miR-4485；1 個為表達下調(diào)miRNA，hsa-miR-3609。

2.4 差異miRNA 靶基因的富集分析

每個miRNA 的靶基因功能富集和通路分析結(jié)果見圖1（封四），富集因子點越大表示富集程度越高，通路中候選靶基因個數(shù)越多。

圖1 差異miRNA 靶基因的富集分析

2.5 差異miRNA 共調(diào)控靶基因網(wǎng)絡圖

結(jié)果顯示，miRNA 之間共調(diào)控靶基因共有18 個節(jié)點，107 個關系對。miR-4286、miR-577、miR-182-5p 等miRNA 之間有較多、緊密的功能協(xié)同作用，分別調(diào)控1493、3455、2864 個靶基因，共同調(diào)節(jié)CACNA1C、MECP2、FOXK1、LPP、SH3TC2、Smad、MDM4 等靶基因，見圖2。直線代表兩miRNA 之間的共調(diào)控靶基因存在顯著的GO Biological Process 富集結(jié)果，其粗細代表富集結(jié)果數(shù)目。

圖2 差異miRNA 共調(diào)控靶基因網(wǎng)絡圖

3 討論

近年來，AEH 的發(fā)病率呈上升趨勢，越來越受關注。臨床上對無生育要求的AEH 患者可行全子宮切除術，但對于有生育要求的女性而言，可連續(xù)服用大劑量、高效的孕激素[4]或選擇放置左炔諾孕酮宮內(nèi)緩釋系統(tǒng)（LNG-IUS）[5]抑制內(nèi)膜增生，同時口服二甲雙胍等[6]輔助治療，但是部分患者的治療效果并不滿意。隨著人們對疾病逐漸深入了解，認識到AEH 不僅是腫瘤相關性疾病，而且還與機體糖耐量降低、糖尿病、中心性肥胖、內(nèi)分泌異常等多種代謝異常疾病相關。

miRNA 是一類包含19～25 個堿基的內(nèi)源性RNA，主要通過與靶基因mRNA 的3′-非翻譯區(qū)（3′-UTR）結(jié)合，調(diào)節(jié)mRNA 相關靶基因，影響細胞的增殖、分化、凋亡及個體發(fā)育。miRNA 具有高度保守性，自身不翻譯蛋白質(zhì)[7-8]，但在生物體內(nèi)可以通過多種代謝途徑發(fā)揮調(diào)控作用。研究發(fā)現(xiàn)，多種miRNA 在子宮內(nèi)膜癌的發(fā)展過程中發(fā)揮著重要作用，例如miR-1202 降低或miR-196a 升高影響AN3CA 和HEC-1-A 細胞增加子宮內(nèi)膜癌細胞遷移和侵襲能力[9]；miR-21、miR-205 通過下調(diào)PTEN、程序性凋亡基因4 等基因表達水平，促進子宮內(nèi)膜癌的細胞增殖[10]；miR-106b-93-25 調(diào)節(jié)p21 和BIM，減少子宮內(nèi)膜癌細胞周期停滯及細胞凋亡[11]。然而，目前miRNA 在AEH 中的研究較少。近期有報道顯示，miR-205、miR-146a、miR-1260b 可作為分子標志物來鑒定AEH 和典型子宮內(nèi)膜增生[12]，因此miRNA 可能在不同子宮內(nèi)膜狀態(tài)轉(zhuǎn)化間發(fā)揮作用。

本實驗采用測序速度快、準確度高的高通量測序技術檢測AEH 與正常子宮內(nèi)膜組織miRNA 的差異性。研究中分別提取3 例正常子宮內(nèi)膜組織及3 例AEH 組織的總RNA 并進行文庫構(gòu)建，分析各樣品中的miRNA 及靶基因情況。通過分析共篩選出18 種具有明顯差異的miRNA，其中上調(diào)17 個，下調(diào)1 個。為進一步明確其在機體內(nèi)的功能，對篩選出的具有顯著差異的miRNA 進行靶基因功能富集和通路分析比較，結(jié)果發(fā)現(xiàn)差異性miRNA 的靶基因大部分富集在腫瘤或者機體代謝的信號傳導相關通路上，意味著這些具有差異的miRNA 可能通過激活腫瘤及機體代謝途徑對靶基因發(fā)揮作用。這與目前已知的AEH 發(fā)生機制相符，說明AEH 不單是一種腫瘤相關的病變，機體代謝性異?？赡芤矃⑴cAEH 疾病的發(fā)展。

通過構(gòu)建差異miRNA 之間的作用網(wǎng)，分析差異miRNA 共同調(diào)控的靶基因，作用網(wǎng)顯示miR-577、miR-182-5p、miR-4286 相互之間有著密切關系。且這三種miRNA 已經(jīng)被證實分別在多種腫瘤及機體代謝疾病中發(fā)揮重要的作用。miRNA-182-5p 在前列腺癌[13]、胃癌[14]，miR-4286 在非小細胞肺癌[15]、食管癌[16]，miR-577 在胃癌[17]等腫瘤中均有表達。靶向調(diào)控相應靶基因，激活并促進腫瘤細胞的侵襲和增殖能力。通過對miR-577、miR-182-5p、miR-4286 進行靶基因預測，結(jié)果發(fā)現(xiàn)其均可通過調(diào)節(jié)Smad 發(fā)揮作用。而Smad 被認為是子宮內(nèi)膜癌的相關靶點[18]，且有研究發(fā)現(xiàn)，miRNA-182-5p 在膀胱癌組織中可以靶向作用于Smad 4 發(fā)揮致癌作用[19]。但是到目前為止，尚未有研究這三種miRNA 在AEH 中的調(diào)節(jié)機制，由此提示需要進行后期驗證，進一步確定miR-577、miR-182-5p、miR-4286 與Smad 4 之間是否存在調(diào)節(jié)關系。

差異miRNA 的靶基因功能富集和通路分析發(fā)現(xiàn)，miR-577、miR-4286 的靶基因均與AMPK 信號通路相關。AMPK 信號通路是體內(nèi)中樞代謝轉(zhuǎn)換的重要途徑，且AMPK 已被確認是糖尿病患者的治療靶點[20]。在AEH 中，miR-577、miR-4286 是否通過AMPK 信號通路發(fā)揮作用，還有待進一步研究。另外，成纖維細胞生長因子21（FGF-21）水平的降低可能與糖尿病發(fā)生具有相關性，此前Chen 等[21]發(fā)現(xiàn)miR-577 可通過負向調(diào)節(jié)FGF-21 影響機體內(nèi)的血糖及血脂水平。由此可見，miR-577、miR-4286 可能通過機體的代謝途徑參與AEH 的發(fā)生。

綜上所述，本研究通過高通量測序技術檢測到AEH 和正常子宮內(nèi)膜組織中差異的miRNA，通過對差異miRNA 進行生物學分析，了解差異miRNA 在AEH 中可能發(fā)揮的作用和機制。然而，由于本試驗中檢測樣本數(shù)量較少，使得試驗存在一定的局限性，還有待于在大量的組織樣本中進行進一步的驗證，以便更好地了解miRNA 在AEH 中的作用機制。