Irisin 對(duì)H9C2 心肌細(xì)胞缺氧復(fù)氧損傷后的保護(hù)作用

吳 娟 張曉萌 常 盼 朱肖星 李 靜 王西輝 王建榜 于 軍

1.西安醫(yī)學(xué)院第二附屬醫(yī)院全科醫(yī)學(xué)科暨陜西省心血管內(nèi)科疾病臨床研究分中心，陜西西安 710038；2.空軍軍醫(yī)大學(xué)西京醫(yī)院超聲科，陜西西安 710036；3.西安國(guó)際醫(yī)學(xué)中心臨床實(shí)驗(yàn)中心，陜西西安 710100

心肌缺血再灌注損傷在心肌梗死發(fā)生過(guò)程中及其細(xì)胞凋亡、結(jié)構(gòu)重塑、炎性反應(yīng)的發(fā)生中都發(fā)揮重要作用[1]。過(guò)氧化物增殖子激活-受體因子γ 輔激活因子（PGC-1α）是改善缺血再灌注損傷的重要分子，PGC-1α 通過(guò)改善能量代謝，線粒體融合、分裂、新生，調(diào)節(jié)細(xì)胞氧化-抗氧化平衡等功能改善再灌注損傷發(fā)生時(shí)的能量耗竭，氧自由基堆積和線粒體結(jié)構(gòu)及功能受損等病理生理過(guò)程，顯著改善缺血再灌注損傷后的心肌細(xì)胞預(yù)后。鳶尾素（Irisin）是運(yùn)動(dòng)后肌肉中PGC-1α 表達(dá)激活，導(dǎo)致下游產(chǎn)生膜蛋白纖維連結(jié)蛋白Ⅲ型域包含蛋白5（FNDC5），F(xiàn)NDC5 經(jīng)過(guò)剪切后產(chǎn)生的一種激素[2]。Irisin 可促進(jìn)干細(xì)胞向骨細(xì)胞分化，促進(jìn)脂肪細(xì)胞棕色化，降低成熟脂肪細(xì)胞數(shù)量，并可以改善脂肪、心肌、骨骼肌等多種細(xì)胞的代謝[3]。有研究[4]報(bào)道，血清中Irisin 的含量與心力衰竭嚴(yán)重程度相關(guān)，而Irisin 在心肌缺血再灌注損傷過(guò)程中的作用很少被研究。為此，本研究探究Irisin 在心肌細(xì)胞缺氧復(fù)氧過(guò)程中的保護(hù)作用。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞模型的建立及實(shí)驗(yàn)分組

H9C2 細(xì)胞接種于25 cm2培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)，每孔加入2 mL含10%胎牛血清的DMEM 培養(yǎng)基，于37℃，5% CO2培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)。細(xì)胞生長(zhǎng)至鋪滿(mǎn)底面80%時(shí)，用0.25%的胰蛋白酶消化傳代，接種于6 孔板或96 孔板中，取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)分為對(duì)照組，對(duì)照+Irisin 組，缺氧復(fù)氧組，缺氧復(fù)氧+Irisin 組，Irisin濃度為10 ng/mL。分別處理，正常培養(yǎng)的細(xì)胞作為對(duì)照組，在對(duì)照組中加入10 ng/mL 的Irisin 作為對(duì)照+Irisin 組，細(xì)胞行缺氧復(fù)氧處理作為缺氧復(fù)氧組，細(xì)胞進(jìn)行缺氧復(fù)氧處理后再加入10 ng/mL 的Irisin 為缺氧復(fù)氧+Irisin 組。

1.2 H9C2 細(xì)胞的缺氧復(fù)氧

將對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的H9C2 細(xì)胞換為無(wú)血清的DMEM低糖培養(yǎng)基，放入含有95% N2、5% CO2的三氣培養(yǎng)箱中（三洋，日本）進(jìn)行缺氧4 h 處理，而后放入含5%CO2的培養(yǎng)箱中進(jìn)行復(fù)氧2 h 處理。

1.3 細(xì)胞活力檢測(cè)

將細(xì)胞接種于96 孔板中，處理結(jié)束后，棄去培養(yǎng)基，用預(yù)熱后的PBS 緩沖液沖洗3 次，每孔加入100 μL的DMEM 無(wú)血清培養(yǎng)基和10 μL 的CCK-8 試劑（碧云天生物有限公司），混勻后避光置于37℃恒溫?fù)u床進(jìn)行孵育45 min，BioTek 酶標(biāo)儀于470 nm 檢測(cè)吸收光值。

1.4 ROS 檢測(cè)

收集各組細(xì)胞后，用預(yù)熱后的PBS 緩沖液沖洗3 次，每孔加入2 mL 的DMEM 無(wú)血清培養(yǎng)基和1 μL的DCFH-DA 試劑（南京建成生物有限公司），混勻后避光置于37℃恒溫?fù)u床進(jìn)行孵育30 min，用0.25%的胰蛋白酶消化后，收集細(xì)胞懸液于15 mL 離心管中，800 g 常溫離心5 min，棄去上清，重懸后鋪板加入檢測(cè)液，在550 nm 檢測(cè)吸光值。

1.5 JC-1 的檢測(cè)

收集各組細(xì)胞后，依次加入1 mL JC-1 染色工作液（碧云天生物有限公司），充分混勻。細(xì)胞培養(yǎng)箱中37℃孵育20 min 后棄上清，用JC-1 染色緩沖液洗滌2 次，加入2 mL 細(xì)胞培養(yǎng)液，用流式細(xì)胞儀FL2 通道檢測(cè)。

1.6 RT-PCR 檢測(cè)凋亡相關(guān)基因

細(xì)胞總RNA 的提取使用TRIzol 試劑（Takara，日本），反轉(zhuǎn)錄以及RT-PCR 依照TaKaRa 公司Mir-XTMmiRNA First-Strand Synthesis and SYBR qRT-PCR的說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作，主要包括去除基因組DNA，反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)及RT-PCR 反應(yīng)[5]。反應(yīng)條件為預(yù)變性95℃（30 s），變性95℃（5 s），退火56℃（30 s），重復(fù)變性和退火步驟40 次，解離95℃（15 s）。引物構(gòu)建由上海生工完成，引物序列分別為，caspase-3 正向引物5′-GGACTGCGGTATTGAGA-3′，反向引物5′-GGTGCGGTAGAGTAAGC-3′；caspase-9 正向引物5′-GTGAAGAACGACCTGACT-3′，反向引物5′-AGGATGACCACCACAAAG-3′及β-actin 正向引物5′-TGCCCATCTATGAGGGTTACG-3′，反向引物5′-TAGAAGCATTTGCGGTGCACG-3′。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

使用SPSS 17.0 統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，計(jì)量資料采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（）表示，組間比較采用t 檢驗(yàn)，多組間均數(shù)比較采用單因素方差分析。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 Irisin 對(duì)心肌細(xì)胞活力的影響

通過(guò)CCK-8 檢測(cè)心肌細(xì)胞活力，對(duì)照+Irisin 組的細(xì)胞活力與對(duì)照組比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；缺氧復(fù)氧組的細(xì)胞活力較對(duì)照組顯著降低（P＜0.01）；缺氧復(fù)氧+Irisin 組較缺氧復(fù)氧組細(xì)胞活力增加（P＜0.05）。見(jiàn)圖1。

圖1 細(xì)胞活力的檢測(cè)（n=6）

2.2 Irisin 對(duì)心肌細(xì)胞ROS 含量的影響

對(duì)照+irisin 組的細(xì)胞活力與對(duì)照組比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；缺氧復(fù)氧組ROS 水平高于對(duì)照組（P＜0.01）；缺氧復(fù)氧+Irisin 組ROS 含量低于缺氧復(fù)氧組（P＜0.05）。見(jiàn)圖2。

圖2 ROS 的檢測(cè)（n=6）

2.3 Irisin 對(duì)心肌細(xì)胞線粒體膜電位的影響

缺氧復(fù)氧組JC-1 低于對(duì)照組（P＜0.05）；缺氧復(fù)氧+Irisin 組JC-1 高于缺氧復(fù)氧組（P＜0.05），對(duì)照組與對(duì)照+Irisin 組JC-1 比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。見(jiàn)圖3。

2.4 Irisin 對(duì)細(xì)胞凋亡相關(guān)基因表達(dá)的影響

對(duì)照組與對(duì)照+Irisin 組caspase-3 及caspase-9水平比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；缺氧復(fù)氧組caspase-3 及caspase-9 水平高于對(duì)照組（P＜0.05）；缺氧復(fù)氧+Irisin 組caspase-3 及caspase-9 水平顯著低于缺氧復(fù)氧組（P＜0.05）。見(jiàn)圖4。

圖3 流式細(xì)胞技術(shù)檢測(cè)JC-1 含量（n=3）

3 討論

圖4 凋亡相關(guān)基因caspase-3 和caspase-9 的表達(dá)（n=6）

近年來(lái)，隨著城鄉(xiāng)居民生活水平進(jìn)一步提高，我國(guó)心血管疾病的發(fā)生率屢創(chuàng)新高。由供氧不足引起的心臟缺血可導(dǎo)致心肌缺血/再灌注損傷的發(fā)生，是導(dǎo)致心血管疾病死亡率和發(fā)病率升高的主要原因[6]。由冠狀動(dòng)脈部分或完全閉塞引起的心肌缺血以及隨后的血流恢復(fù)引起的額外心臟損傷（缺血/再灌注損傷）是全世界死亡的主要原因[7]。心肌缺血/再灌注損傷的潛在病理生理學(xué)可能涉及許多因素，如活性氧形成[8]、心臟能量代謝改變[9]、細(xì)胞凋亡激活[10]和炎性反應(yīng)[11]。有氧運(yùn)動(dòng)時(shí)，肌肉收縮激活PGC-1α 的表達(dá)，進(jìn)一步刺激FNDC5 表達(dá)，位于細(xì)胞膜上的FNDC5 蛋白經(jīng)過(guò)剪切后成為Irisin 入血[12]。Irisin 在改善代謝、抗凋亡、調(diào)節(jié)免疫系統(tǒng)等方面均可發(fā)揮重要作用[13]。近年來(lái)越來(lái)越多的證據(jù)顯示，Irisin 與心腦血管疾病的發(fā)生和發(fā)展密切相關(guān)[14]，有望成為急性冠脈綜合征的新的靶點(diǎn)分子[15]。但其具體機(jī)制，尤其是在心血管系統(tǒng)疾病的機(jī)制很少報(bào)道。本研究利用大鼠心肌細(xì)胞H9C2 中行缺氧復(fù)氧處理，以探究Irisin 對(duì)心肌缺氧復(fù)氧的作用以及相關(guān)的作用機(jī)制，以期對(duì)臨床的進(jìn)一步應(yīng)用研究提供理論依據(jù)。

心肌細(xì)胞的缺血再灌注損傷主要的發(fā)生機(jī)制包括自由基的形成、鈣超載作用、白細(xì)胞炎性反應(yīng)、高能磷酸化合物缺乏等。在缺氧條件下，細(xì)胞內(nèi)的ATP 減少，無(wú)法將黃嘌呤氧化酶轉(zhuǎn)化為次黃嘌呤氧化酶，當(dāng)再灌注發(fā)生時(shí)，大量氧分子與黃嘌呤氧化酶接觸，形成大量ROS[16-17]。ROS 的降低可以有效保護(hù)心肌缺血再灌注損傷[18]，在本研究中，Irisin 在缺氧復(fù)氧的心肌細(xì)胞內(nèi)可顯著提高細(xì)胞活力，降低ROS 的生成。ATP 作為人體重要的能量物質(zhì)，也作為心肌收縮的功能的必需品，而超過(guò)95%是在線粒體中合成。線粒體合成的ATP 通過(guò)線粒體膜上的ADP/ATP 轉(zhuǎn)運(yùn)體進(jìn)入細(xì)胞質(zhì)為機(jī)體供應(yīng)能量。線粒體則通過(guò)氧化呼吸鏈將化學(xué)能轉(zhuǎn)化為電勢(shì)能儲(chǔ)存在線粒體內(nèi)。在缺血再灌注損傷過(guò)程中，線粒體內(nèi)電解質(zhì)紊亂，氧化呼吸鏈關(guān)鍵酶失活，ROS 產(chǎn)生增加，線粒體膜電位顯著降低。而加入Irisin后，線粒體的氧化呼吸功能得到保護(hù)，表現(xiàn)在JC-1 水平較單純?nèi)毖鯊?fù)氧處理的心肌細(xì)胞顯著提高，說(shuō)明Irisin 對(duì)心肌細(xì)胞缺氧復(fù)氧的保護(hù)作用與線粒體膜電位密切相關(guān)。

另一方面，凋亡作為心肌損傷中的重要機(jī)制，也作為線粒體損傷的重要環(huán)節(jié)[19-21]。本研究也檢測(cè)了凋亡的一些相關(guān)指標(biāo)，caspase-9 作為引起凋亡發(fā)生的重要分子，caspase-3 是細(xì)胞凋亡通路中的關(guān)鍵分子，兩個(gè)分子充分反映細(xì)胞凋亡通路的激活情況[22]。本研究中缺氧復(fù)氧引起心肌細(xì)胞caspase3 和caspase-9 基因的激活均可被Irisin 有效抑制。這些結(jié)果顯示Irisin對(duì)缺氧復(fù)氧心肌細(xì)胞的保護(hù)作用與凋亡有關(guān)。

綜上所述，Irisin 可顯著改善缺氧復(fù)氧后心肌細(xì)胞的細(xì)胞活力、減少ROS 生成、恢復(fù)線粒體膜電位、抑制凋亡通路，同時(shí)這也提示Irisin 對(duì)心肌細(xì)胞的保護(hù)作用與線粒體膜電位和凋亡相關(guān)。本研究可為臨床預(yù)防和治療心肌缺血再灌注損傷提供理論依據(jù)。