擴張型心肌病患者左心室心肌組織中轉(zhuǎn)化生長因子β、結(jié)締組織生長因子和膠原蛋白的表達水平及臨床意義▲

易 欣 劉 暢 周 易 蔣學俊

(1 武漢大學人民醫(yī)院心血管內(nèi)科，2 武漢大學心血管病研究所，3 心血管病湖北省重點實驗室，湖北省武漢市 430060，電子郵箱：yixin321624@126.com)

擴張型心肌病(dilated cardiomyopathy，DCM)是在排除冠狀動脈疾病所致缺血性心肌病或其他疾病導致心臟負荷異常的情況下，出現(xiàn)的以左、右心室擴張和心臟舒張/收縮功能障礙為臨床特征的一類心肌病[1]。DCM是年輕患者發(fā)生心力衰竭的主要原因之一，也是心臟移植最常見的手術(shù)指征[2]。研究表明，心肌纖維化在DCM中起到重要作用，膠原蛋白在心肌組織中的過度增生和沉積是心肌纖維化的典型病理改變，尤以Ⅰ型膠原蛋白(collagen Ⅰ，Col Ⅰ)、Ⅲ型膠原蛋白(collagen Ⅲ，ColⅢ)為主[3]。已有學者發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)化生長因子(transforming growth factor，TGF)-β1、TGF-β2、結(jié)締組織生長因子(connective tissue growth factor，CTGF)是心肌纖維化、肺纖維化、肝纖維化和腎纖維化中的重要促纖維化因子[4-6]。本研究旨在探討TGF-β1、TGF-β2、CTGF和膠原蛋白在DCM心肌組織中的表達情況及其與纖維化程度的相關(guān)性，進一步深入研究以上因子評估DCM患者心肌纖維化程度的可行性。

1 材料與方法

1.1 標本來源 收集9例行心臟移植術(shù)的DCM患者的受體心臟組織作為DCM組。納入患者均符合2006年美國心臟協(xié)會制定的DCM診斷標準，即左心室舒張末期內(nèi)徑>55 mm、左心室射血分數(shù)<45%或左心室縮短速率<25%[7]。排除其他可以引起心臟擴張的心血管疾病和全身性疾病如冠狀動脈性心臟病、先天性心臟病、高血壓、自身免疫性疾病。同時收集因心源性因素所致移植失敗的供體心臟組織7例作為對照組。

1.2 DCM患者臨床資料的收集 收集DCM患者的超聲心動圖結(jié)果，包括左心室內(nèi)徑、右心室內(nèi)徑、左室射血分數(shù)。

1.3 心肌組織相關(guān)指標的檢測

1.3.1 標本處理：切取DCM患者受體心臟及移植失敗供體心臟的左心室心肌組織，于冰上迅速去除心臟表面的結(jié)締組織，于生理鹽水沖洗，分為兩份：一份切成小組織塊，放入凍存管內(nèi)，液氮中迅速冷凍后-80℃保存，用于檢測TGF-β1、TGF-β2、CTGF和膠原蛋白的mRNA表達；另一份修剪后置于4%多聚甲醛內(nèi)固定，經(jīng)脫水、透明、浸蠟、包埋、切片等步驟制成石蠟切片，用于觀察心肌組織結(jié)構(gòu)、評估心肌纖維化程度。

1.3.2 蘇木精-伊紅(hematoxylin-eosin，HE)染色：石蠟切片依次經(jīng)二甲苯脫蠟、下行梯度酒精脫苯、水洗、蘇木素染色、0.1%鹽酸酒精分化、Scott液返藍、伊紅染色、上行梯度酒精脫水、二甲苯透明、中性樹脂封片。最后在顯微鏡(日本Olympus公司，型號：BX53)下觀察心肌組織的形態(tài)結(jié)構(gòu)及排列特點。

1.3.3 苦味酸-天狼星紅(picric-sirius red，PSR)染色：制備好的石蠟切片常規(guī)脫蠟、脫水后，依次經(jīng)磷鉬酸染色、0.1%苦味酸-天狼星紅染色、0.01 mmol/L鹽酸分化、上行梯度酒精脫水、二甲苯透明、中性樹脂封片。最后光學顯微鏡(日本Olympus公司，型號：BX53)下觀察心肌組織中紅色膠原纖維的分布情況，拍照并計算膠原容積百分比(collagen volume fraction，CVF)，CVF=膠原面積/圖像面積×100%。

1.3.4 TGF-β1、TGF-β2、CTGF和膠原蛋白mRNA表達水平的檢測：采用實時熒光定量PCR技術(shù)檢測心室肌組織中TGF-β1、TGF-β2、CTGF、Col Ⅰ、ColⅢ的mRNA表達水平。采用TRIzolTMReagent試劑盒(美國Invitrogen公司，批號：15596026)提取總RNA。采用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(日本TaKaRa公司，批號：RR036A)，將RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA。再應(yīng)用LightCycler? 480 SYBR Green Ⅰ Master試劑盒(德國Roche公司，批號：04707516001)進行PCR擴增反應(yīng)，反應(yīng)體系嚴格參照說明書配制，20 μL的反應(yīng)體系包括10.0 μL LightCycler? 480 SYBR Green Ⅰ Master(2×)、0.5 μL 10 μmol/L PCR上游引物、0.5 μL 10 μmol/L PCR下游引物、1.0 μL cDNA模板和8.0 μL RNase Free dH2O；反應(yīng)條件為預變性94℃ 2 min、變性95℃ 10 s、退火58℃ 30 s、 延伸72℃ 30 s，一共40個循環(huán)，72℃ 10 min延伸后，于4℃終止反應(yīng)。以甘油醛-3-磷酸脫氫酶(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase,GAPDH)為內(nèi)參基因，采用2-ΔΔCt法計算TGF-β1、TGF-β2、CTGF和膠原蛋白mRNA的相對表達水平。引物由上海生工生物技術(shù)有限公司合成，引物序列見表1。

表1 引物序列

1.4 統(tǒng)計學分析 采用SPSS 19.0軟件進行統(tǒng)計分析。計量資料以(x±s)表示，兩組間比較采用兩獨立樣本t檢驗；相關(guān)性分析采用Pearson檢驗。以P<0.05為差異具有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié) 果

2.1 DCM患者的超聲心動圖結(jié)果 超聲心動圖檢查結(jié)果顯示DCM患者雙心室擴大，右心室內(nèi)徑為(51.25±6.99)mm，左心室內(nèi)徑為(71.33±13.59)mm，左心室擴張更為顯著；心肌室壁運動幅度普遍降低，左室射血分數(shù)明顯下降，為(26.22±9.18)%。

2.2 兩組組織病理檢查結(jié)果 與對照組相比，HE染色可見DCM組心肌組織排列紊亂、心肌細胞不同程度肥大，胞漿內(nèi)少許空泡形成，核多形性增加，PSR染色可見DCM組心肌間質(zhì)中大量紅色膠原纖維沉積、彌漫性分布，見圖1。此外，DCM組的CVF為(43.35±4.32)%，高于對照組的(1.65±0.43)%(t=-25.228，P<0.001)。

圖1 對照組和DCM組心室肌組織的病理學改變(HE染色，×40；PSR染色，×20)

注：PSR染色中黃色為心肌組織，紅色為膠原纖維。

2.3 兩組心室肌組織中TGF-β1、TGF-β2、CTGF和膠原蛋白的mRNA相對表達水平比較 實時熒光定量PCR結(jié)果顯示，與對照組相比，DCM組心室肌組織中TGF-β1、TGF-β2、CTGF、ColⅠ、ColⅢ的mRNA相對表達水平均升高(P<0.05)，見表2。

表2 兩組心室肌組織中TGF-β1、TGF-β2、CTGF和膠原蛋白的mRNA相對表達水平比較(x±s)

2.4 DCM患者心室肌組織中TGF-β1、TGF-β2、CTGF和膠原蛋白的mRNA表達水平與CVF的相關(guān)性 相關(guān)性分析結(jié)果顯示，DCM患者心室肌組織中TGF-β1、TGF-β2、CTGF、Col Ⅰ、ColⅢ的mRNA表達水平與CVF均呈正相關(guān)(r=0.924，P=0.003；r=0.955，P=0.001；r=0.964,P<0.001；r=0.941，P=0.002；r=0.858，P=0.013)。

3 討 論

DCM是由遺傳、感染、中毒、自身免疫等因素引起的，以心室擴張、室壁變薄、收縮功能降低為臨床特點的一類心肌病，容易并發(fā)心力衰竭、惡性心律失常、心源性猝死等[1，8]。心室重構(gòu)是DCM發(fā)生發(fā)展中最為重要的病理生理過程，而心肌纖維化是DCM心室重構(gòu)的典型病理特征。心肌纖維化的進展與DCM的疾病進展密切相關(guān)，心肌纖維化的程度與DCM患者的預后密切相關(guān)[9-12]。因此，研究DCM心肌纖維化的臨床特征和發(fā)生機制，尋找抗心肌纖維化的靶點，對控制DCM患者病情進展、改善臨床預后具有重要的臨床意義。

細胞外基質(zhì)異常增生堆積，以及心臟成纖維細胞異常增殖、表型轉(zhuǎn)化和遷移是心肌纖維化最主要的病理改變[13]。細胞外基質(zhì)主要由豐富的ColⅠ、ColⅢ及較少的ColⅣ、ColⅤ、ColⅥ構(gòu)成，他們在維持心室形狀、心肌細胞排列以及心肌正常收縮功能中發(fā)揮重要作用[14]。生理情況下，各型膠原蛋白的合成與降解處于一種動態(tài)平衡狀態(tài)；心肌纖維化時，細胞外基質(zhì)內(nèi)膠原增生，各型膠原蛋白比例失調(diào)，以ColⅠ、ColⅢ的改變最為明顯[15]。此外，促纖維化細胞因子與抑纖維化細胞因子的失調(diào)也是心肌纖維化的重要調(diào)節(jié)機制[16-17]。促纖維化細胞因子活化、表達上調(diào)，可促進心臟成纖維細胞異常增殖、表型轉(zhuǎn)化，合成大量膠原纖維，進而誘導心肌纖維化。其中，細胞因子TGF-β以及CTGF是各器官、組織纖維化進展中的重要細胞生長因子[18-19]。TGF-β是一類分泌型的多肽細胞生長因子，其功能涉及多類細胞的增殖、分化、凋亡調(diào)節(jié)等[20]。家族成員TGF-β1主要表達在內(nèi)皮細胞、造血細胞和結(jié)締組織細胞[21]，可誘導心臟成纖維細胞增殖分化，抑制膠原降解，促進細胞外基質(zhì)堆積；并可抑制金屬蛋白酶生成，增加細胞間黏附，保持肌纖維母細胞生存能力[22]。TGF-β1/Smad 3的激活在心肌纖維化中起重要作用，可誘導心臟成纖維細胞異常增殖及ColⅠ的過表達[23]。家族成員TGF-β2主要表達在上皮細胞和神經(jīng)細胞[21]。Bao等[24]研究發(fā)現(xiàn)，TGF-β2可上調(diào)CTGF，致人房水Tenon′s囊成纖維細胞增殖，促進青光眼濾泡瘢痕形成。Ma等[25]發(fā)現(xiàn)TGF-β2可誘導CTGF表達上調(diào)，致人晶狀體上皮細胞增殖，加速白內(nèi)障進程。目前有關(guān)TGF-β2的研究主要集中在眼科學，其在心肌纖維化中作用的研究相對較少。CTGF也是一種分泌型的多功能細胞生長因子，調(diào)節(jié)細胞外基質(zhì)穩(wěn)態(tài)，參與血管生成、組織修復、組織器官纖維化的發(fā)生發(fā)展，是組織器官纖維化的重要標志物之一[26]。研究表明CTGF是TGF-β1的下游調(diào)控因子[19]。正常狀態(tài)下，心肌細胞及心臟成纖維細胞分泌CTGF到心肌間質(zhì)中，維持一定的基礎(chǔ)分泌量；心肌纖維化時，TGF-β1可異常上調(diào)CTGF的表達水平，進一步促進膠原蛋白的合成[27]。

目前，臨床主要以心臟超聲檢查結(jié)果作為DCM的診斷依據(jù)，常以心臟擴大程度來評估病情進展和判斷預后。然而，心臟超聲檢查的準確性有賴于操作者的經(jīng)驗及熟練程度，若單純以心臟超聲結(jié)果作為DCM患者病情評估的依據(jù)，其可靠性還需斟酌。DCM患者心肌組織中有大量膠原蛋白沉積，因此，目前認為可采用對膠原檢測敏感的心臟磁共振T1映射成像與細胞外容積來評估心肌纖維化程度，對DCM患者的疾病進展和預后進行評估，但目前在臨床上尚未開展[28]。本研究結(jié)果顯示，DCM患者心室肌組織中紅色膠原纖維沉積明顯，CVF增加(P<0.05)，提示DCM患者心肌纖維化嚴重；同時TGF-β1、TGF-β2、CTGF和膠原蛋白(ColⅠ、ColⅢ)的mRNA表達水平增加(P<0.05)，且均與CVF水平呈正相關(guān)，這提示TGF-β1、TGF-β2、CTGF和膠原蛋白(ColⅠ、ColⅢ)均在DCM患者心肌纖維化的發(fā)生發(fā)展中起到重要作用。因此，若對DCM患者行心肌組織活檢，測定心肌組織中TGF-β1、TGF-β2、CTGF和膠原蛋白的表達，可對患者的疾病發(fā)展及預后做出更為準確的判斷。但在實際臨床工作中，愿意接受心肌組織活檢的患者數(shù)量比較少，檢測以上細胞因子在心肌組織中表達的技術(shù)很難廣泛開展。而TGF-β1、TGF-β2、CTGF作為分泌型細胞因子，其血清表達水平也可一定程度上反映DCM患者心肌纖維化程度，在臨床實際中對評估DCM患者疾病轉(zhuǎn)歸具有一定的實際意義。此外，TGF-β1、TGF-β2、CTGF和膠原蛋白也可作為抗心肌纖維化藥物研究的重要靶點，有助于抗心肌纖維化藥物的進一步研發(fā)，為控制甚至逆轉(zhuǎn)DCM患者心室重構(gòu)提供參考依據(jù)。