納米TiO2和四環(huán)素暴露對(duì)耐藥大腸桿菌的影響

張永麗 袁偉 楊清香

（河南師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，新鄉(xiāng) 453007）

目前抗生素污染導(dǎo)致嚴(yán)重的環(huán)境問(wèn)題［1］，包括生態(tài)風(fēng)險(xiǎn)和人類(lèi)潛在的健康風(fēng)險(xiǎn)［2］。四環(huán)素（Tetracycline，TC）作為一大類(lèi)被廣泛使用的抗生素，占總抗生素使用量的29%［3］，并且在臨床上超過(guò)70%的四環(huán)素以活性形式被釋放到環(huán)境中［1］。美國(guó)在139條河流中有一半都檢測(cè)到了TC的存在［4］，并且不同地點(diǎn)樣品中TC含量也有較大差別［5］。洪波等［6］用高效液相（HPLC-UV）技術(shù)測(cè)定水樣品中的四環(huán)素類(lèi)、喹諾酮類(lèi)等6種抗生素，檢測(cè)限（Limit of detection ，LOD）為 2.00-8.00 μg/kg。在不同環(huán)境樣品中的土霉素和四環(huán)素含量也有報(bào)道，其LOD分別為0.08和9 μg/kg［7］，同時(shí)在食品樣品中TC檢出量為5-25 μg/kg［8］，兩者遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于微生物學(xué)抑菌實(shí)驗(yàn)中 TC 的 LOD（25 μg/kg）［9］，但在江蘇省的牛糞中TC檢出量達(dá)到了0.52 mg/kg［10］。孫剛等［11］研究結(jié)果表明，雞糞中土霉素含量高達(dá)11.25 mg/kg，超過(guò)了TC的平均含量（0.58 mg/kg）。根據(jù)歐盟的法規(guī)，抗生素的環(huán)境濃度應(yīng)在10 μg/kg以下，目前對(duì)于四環(huán)素和四環(huán)素衍生物的評(píng)估濃度在450-900 μg/kg范圍內(nèi)，比歐盟規(guī)定濃度高了約45-90倍［12］?？股氐某?guī)定濃度的暴露造成了環(huán)境中微生物的耐藥性，而抗生素耐藥菌是否對(duì)其他環(huán)境暴露毒性因子（如納米材料）有抗性還知之甚少。

納米材料［13-14］作為新型污染物，其造成的污染已逐步成為嚴(yán)峻的環(huán)境問(wèn)題［15］，在土壤和水中均被檢出［16］。污水處理廠(chǎng)中產(chǎn)生的污泥、納米農(nóng)藥的應(yīng)用、納米誘導(dǎo)的土壤修復(fù)和擴(kuò)散排放等都造成了土壤環(huán)境中納米材料的殘留［16］；同時(shí)在市政污水中也檢測(cè)到了納米材料的存在［10］。納米材料的暴露會(huì)對(duì)微生物造成毒性，其中TiO2-NPs的抑菌原理研究較為清楚，TiO2-NPs經(jīng)光照接觸微生物，光照后在其表面產(chǎn)生活性氧物質(zhì)（ROS）（如羥自由基，超氧根離子和過(guò)氧化氫），最終導(dǎo)致微生物的超氧化［17-18］。同時(shí)TiO2-NPs存在尺寸效應(yīng)，它的毒性隨粒徑變化而變化，較小的顆粒會(huì)更容易聚集，從而導(dǎo)致與細(xì)胞接觸的表面積增加，更有利于其在細(xì)胞上的附著并抑制細(xì)胞內(nèi)和細(xì)胞外物質(zhì)運(yùn)輸［19］，甚至可能導(dǎo)致細(xì)胞代謝的中斷或死亡［20］，這些研究表明TiO2-NPs對(duì)微生物存在很強(qiáng)的毒性。另一方面，環(huán)境中大腸桿菌比枯草芽孢桿菌對(duì)TiO2-NPs更敏感［21］，表明大腸桿菌更容易受到TiO2-NPs的傷害。目前對(duì)于耐藥大腸桿菌的抗性機(jī)制研究，多數(shù)是從抗生素的種類(lèi)和濃度著手，忽略了其他環(huán)境因子的影響。本研究以敏感菌和耐藥菌為實(shí)驗(yàn)對(duì)象，探究了納米TiO2和四環(huán)素對(duì)大腸桿菌生長(zhǎng)的影響。

1 材料與方法

1.1 材料

菌種為從雞糞中分離出的大腸桿菌（M13），由本實(shí)驗(yàn)室保存。質(zhì)控大腸桿菌ATCC25922購(gòu)自廣東環(huán)凱微生物科技有限公司。納米二氧化鈦，購(gòu)自上海麥克林生化科技有限公司（Macklin Biochemical Co.Ltd），Bioscreen C（全自動(dòng)生長(zhǎng)曲線(xiàn)分析儀）來(lái)自芬蘭Bio-screen公司，F(xiàn)E-SEM（場(chǎng)發(fā)射掃描電鏡）型號(hào)為SIGMA500。

1.2 方法

1.2.1 耐藥性測(cè)試 根據(jù)美國(guó)臨床實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)化協(xié)會(huì)（Clinical and laboratory standards institute，CLSI）手冊(cè)，選用了16種抗生素研究耐藥大腸桿菌的耐藥性，如表1所示。藥敏試驗(yàn)采用紙片擴(kuò)散法（藥敏紙片購(gòu)自杭州微生物試劑有限公司），將Escherichia coliATCC25922 作為對(duì)照菌株，大腸桿菌M13作為實(shí)驗(yàn)菌株。實(shí)驗(yàn)過(guò)程依據(jù)CLSI操作，菌液利用比濁管校正OD600=0.6，利用游標(biāo)卡尺測(cè)量抑菌圈的直徑。抑菌圈直徑每個(gè)測(cè)3次，取平均值。

1.2.2 Bioscreen C測(cè)定生長(zhǎng)曲線(xiàn) TiO2-NPs配制的終濃度分別為125、250、500、1000、2000、4 000mg/L，命名為 Ti1、Ti2、Ti3、Ti4、Ti5、Ti6；TC 配制的濃度為0.125、0.25、0.5、1、2、4 mg/L，命名為T(mén)C1、TC2、TC3、TC4、TC5、TC6。 生 長(zhǎng) 曲 線(xiàn) 的 測(cè) 定方法參照之前的研究［22］，將質(zhì)控菌ATCC25922和M13分別接種到LB培養(yǎng)液中，接菌量為5%，總體系為250 μL，每個(gè)樣品3個(gè)平行。本實(shí)驗(yàn)采用的是Bioscreen C，內(nèi)裝2塊微孔板共200個(gè)孔，每孔的容積為400 μL，在600 nm下進(jìn)行測(cè)樣。其參數(shù)設(shè)定：37℃，150 r/min，40 h，每20 min測(cè)定一次OD值。

選取Bioscreen C測(cè)出的數(shù)據(jù)，通過(guò)下式計(jì)算TiO2-NPs和TC對(duì)兩菌株的抑菌率［23］：

式中：Xs為抑菌率，A表示空白菌液吸光度值，B表示樣品菌液吸光度值。

1.2.3 FE-SEM實(shí)驗(yàn)方法 按照?qǐng)霭l(fā)射電鏡制備方法對(duì)樣品進(jìn)行預(yù)處理，處理方法參照J(rèn)eon等［24］的研究，將質(zhì)控菌ATCCC25922和M13接種至LB液體培養(yǎng)基中，37℃，180 r/min條件下培養(yǎng)至對(duì)數(shù)期。取菌液在3000 r/min離心3 min收集菌體，PBS清洗2-3次，加入4%的戊二醛靜置過(guò)夜，離心去上清，PBS清洗2-3次后進(jìn)行乙醇梯度脫水，最后用適量的100% 叔丁醇懸浮菌體，樣品預(yù)處理之后，在FESEM上樣進(jìn)行觀(guān)察。

2 結(jié)果

2.1 M13耐藥性分析

本實(shí)驗(yàn)對(duì)大腸桿菌M13、質(zhì)控菌ATCC25922進(jìn)行藥敏測(cè)試，并用游標(biāo)卡尺測(cè)量抑菌圈直徑，根據(jù)美國(guó)臨床實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)研究所出版的《藥敏實(shí)驗(yàn)指南》的標(biāo)準(zhǔn)判定菌株對(duì)不同藥物的敏感性。如表2和圖1所示，大腸桿菌M13對(duì)12種抗生素表現(xiàn)出抗性R，其中四環(huán)素（TC）、阿莫西林/克拉維酸（AMC）、頭孢噻肟（CTX）、美羅培南（IPM）、呋喃妥因（FD）、甲氧芐啶/磺胺異惡唑（SXT）、洛美沙星（LOM）7種抗生素未發(fā)現(xiàn)抑菌圈，表明M13對(duì)這7種抗性很強(qiáng)，對(duì)慶大霉素（GM）、卡那霉素（K）、環(huán)丙沙星（CIP）、阿奇霉素（AZM）表現(xiàn)出敏感S。質(zhì)控菌ATCC25922全為S，證明ATCC25922對(duì)所有抗生素敏感，進(jìn)一步說(shuō)明實(shí)驗(yàn)的準(zhǔn)確性。

表1 細(xì)菌耐藥性測(cè)試所選擇的16種抗生素

表2 大腸桿菌M13和ATCC25922的藥敏試驗(yàn)

2.2 納米TiO2和四環(huán)素對(duì)大腸桿菌生長(zhǎng)的影響

圖2中A和E表示四環(huán)素對(duì)敏感菌ATCC25922和耐藥菌M13的生長(zhǎng)的影響，對(duì)敏感菌ATCC25922的抑制作用相對(duì)較強(qiáng)；B和F表示TiO2-NPs對(duì)ATCC25922和M13的生長(zhǎng)的影響，敏感菌ATCC25922在A(yíng)3-A6濃度生長(zhǎng)完全被抑制，而耐藥菌M13在M1-M3濃度下生長(zhǎng)幾乎不受抑制，在M4-M6濃度下生長(zhǎng)抑制作用在逐步增強(qiáng)；C和G表示不同濃度的TC中加入500 mg/L的TiO2-NPs，結(jié)果表明敏感菌ATCC25922生長(zhǎng)幾乎完全被抑制，而耐藥菌M13的生長(zhǎng)在25 h后出現(xiàn)抑制現(xiàn)象；D和H表示不同濃度的TiO2-NPs中加入0.5 mg/L的TC，結(jié)果與BF（TiO2-NPs單獨(dú)暴露）的生長(zhǎng)曲線(xiàn)趨勢(shì)相近，說(shuō)明在TiO2-NPs存在的前提下TC的加入對(duì)ATCC25922和M13作用并不明顯。圖CG與AE相比則可以看出，在TC存在的前提下TiO2-NPs的加入對(duì)敏感菌抑制作用增強(qiáng)，而對(duì)耐藥菌生長(zhǎng)抑制變化不大。這些結(jié)果表明TiO2-NPs要比TC具有更強(qiáng)的細(xì)胞毒性，而且TiO2-NPs的加入增強(qiáng)了四環(huán)素對(duì)敏感菌ATCC25922的生長(zhǎng)抑制作用。

圖1 大腸桿菌M13和ATCC25922藥敏試驗(yàn)圖片

2.3 納米TiO2和四環(huán)素對(duì)菌株的抑菌率

圖3是TiO2-NPs和TC在單獨(dú)及共暴露條件下對(duì)敏感菌ATCC25922和耐藥菌M13抑菌率的影響。從圖3-A中可以看出TiO2-NPs單獨(dú)和聯(lián)合暴露下對(duì)其抑菌率在80%-100%之間，其中在不同濃度的TC中加入500 mg/L的TiO2-NPs時(shí)，與單獨(dú)添加TC相比，其抑菌性出現(xiàn)了明顯的升高，而在不同濃度的TiO2中添加0.5 mg/L的TC時(shí)，其抑菌率達(dá)到了90%以上。從圖3-B可看出總體抑菌率在40%以下，單獨(dú)添加TiO2-NPs要比TC具有更強(qiáng)的抑菌性，不同濃度梯度的TC加入500 mg/L的TiO2-NPs與TC單獨(dú)暴露下箱線(xiàn)圖相似，其抑菌率都在40%以下且略高于TC。從整體上可以看出，TiO2-NPs和TC對(duì)耐藥菌M13的抑菌率要低于敏感菌，表明耐藥菌M13不僅對(duì)抗生素具有抗性，同時(shí)對(duì)納米TiO2也具有一定的抗性。

2.4 納米TiO2暴露對(duì)兩菌株的損傷作用

在模擬太陽(yáng)光催化試驗(yàn)研究光催化劑負(fù)載效應(yīng)時(shí)發(fā)現(xiàn)，0.5 g/L的TiO2-NPs對(duì)大腸桿菌抑菌效率較高［25］。該結(jié)果與用太陽(yáng)能反應(yīng)器研究TiO2-NPs抑制懸浮的大腸桿菌結(jié)果一致［26］。故本實(shí)驗(yàn)選取了500 mg/L的TiO2-NPs作為觀(guān)察對(duì)象，如圖4，結(jié)果發(fā)現(xiàn)敏感菌ATCC25922菌體損傷嚴(yán)重，不僅有穿孔，菌體的表面也出現(xiàn)了嚴(yán)重的破損。耐藥菌只出現(xiàn)了穿孔現(xiàn)象，再一次證明了TiO2-NPs對(duì)敏感菌的的傷害更強(qiáng)，而對(duì)于耐藥菌損傷程度則小很多，穿孔現(xiàn)象的產(chǎn)生可能是TiO2-NPs顆粒產(chǎn)生的活性自由基對(duì)細(xì)胞壁和細(xì)胞膜的破壞，造成的菌體損傷。從表觀(guān)上可以看出耐藥菌M13對(duì)TiO2-NPs存在一定程度的耐受性。

3 討論

微生物產(chǎn)生耐藥的本質(zhì)是細(xì)菌在抗菌藥物壓力下，受多種調(diào)控因子調(diào)控，多重耐藥機(jī)制并存的適應(yīng)性機(jī)制［27］?？股啬退幮缘某霈F(xiàn)和擴(kuò)散是不可避免的［28］。其耐藥機(jī)制主要有3種：外排泵、抗生素失活以及核糖體保護(hù)機(jī)制［29］。外排泵機(jī)制是細(xì)菌中耐藥性存在最多的一種耐藥機(jī)制，它是通過(guò)阻止抗生素在作用于自身靶細(xì)胞前排出抗生素，最終使細(xì)胞避免抗生素的傷害。在存在翻譯抑制性TC的情況下，細(xì)菌獲得抗性取決于A(yíng)crAB-TolC多藥外排泵，其能將少量的TC排出細(xì)胞外，讓細(xì)菌得以維持最低限度的蛋白合成功能，并且可以啟動(dòng)TetA表達(dá)，進(jìn)而菌株表現(xiàn)出TC抗性［30］。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)藥敏測(cè)試發(fā)現(xiàn)了耐藥菌對(duì)TC具有抗性，從生長(zhǎng)曲線(xiàn)和抑菌率中發(fā)現(xiàn)，在所有選擇濃度的TC單獨(dú)暴露下，耐藥菌的生長(zhǎng)幾乎不受抑制，外排泵可能是耐藥菌中四環(huán)素抗性的的主要調(diào)控因子。

圖2 TiO2-NPs和TC對(duì)大腸桿菌生長(zhǎng)的影響

有研究發(fā)現(xiàn)納米TiO2在較低濃度下就達(dá)到了抑菌效果［31］，與本實(shí)驗(yàn)TiO2-NPs在低濃度下暴露的結(jié)果一致。TiO2-NPs在低于500 mg/L單獨(dú)暴露時(shí)，對(duì)敏感菌的抑菌率為54%-80%，高于500 mg/L暴露時(shí)，對(duì)敏感菌的抑菌率為92%-100%；而耐藥菌在其濃度低于500 mg/L時(shí)，對(duì)敏感菌的抑菌率在10%左右，高于500 mg/L時(shí)，對(duì)耐藥菌的抑菌率為20%-40%，實(shí)驗(yàn)結(jié)果與張明等［32］的研究一致，說(shuō)明TiO2-NPs對(duì)于耐藥菌和敏感菌都有生長(zhǎng)抑制作用，對(duì)敏感菌作用更強(qiáng)。在TiO2-NPs高濃度暴露下，耐藥菌的抑菌率依然沒(méi)有達(dá)到60%以上，說(shuō)明耐藥菌對(duì)TiO2-NPs也存在一定的抗性機(jī)制。從而可推測(cè)細(xì)菌的一些對(duì)抗生素的抗性機(jī)制，對(duì)TiO2-NPs也適用。

TC是具有多個(gè)可電離官能團(tuán)的兩性分子，如三羰基甲烷、酚二酮和二甲氨基，這有助于增加它們與金屬氧化物的結(jié)合［33］。研究發(fā)現(xiàn)TC和TiO2-NPs不僅抑制微生物生長(zhǎng)［34-35］，而且在共暴露時(shí)還發(fā)現(xiàn)了毒性增強(qiáng)效應(yīng)［36］。同時(shí)在研究TC對(duì)TiO2-NPs在溶液里的行為時(shí)發(fā)現(xiàn)，TC吸附后導(dǎo)致TiO2-NPs的表面電荷增加，當(dāng)TC濃度逐漸升高時(shí)，TiO2-NPs會(huì)發(fā)生聚集現(xiàn)象并逐漸增強(qiáng)［37］。由于TiO2-NPs存在尺寸效應(yīng)，它的毒性隨粒徑變化而變化，較小的顆粒聚集之后會(huì)增加與細(xì)胞接觸的表面積，更有利于其在細(xì)胞上的附著并抑制細(xì)胞內(nèi)和細(xì)胞外物質(zhì)運(yùn)輸［19］，從而導(dǎo)致細(xì)胞代謝的中斷或死亡［20］，這些研究均說(shuō)明TC和TiO2-NPs之間存在協(xié)同作用，會(huì)增強(qiáng)對(duì)微生物的毒性作用，與本研究結(jié)果一致。在本研究中兩者在共暴露情況下有增強(qiáng)其毒性的效應(yīng)，如對(duì)菌株生長(zhǎng)抑制作用增強(qiáng)。

微生物之間的基因水平轉(zhuǎn)移是微生物獲得耐藥基因的一種重要途徑，包括游離DNA和可移動(dòng)元件的獲取。例如，質(zhì)粒、轉(zhuǎn)座子、整合子、基因盒和噬菌體等［38］。換而言之，即使是非致病微生物的耐藥基因也可以作為致病微生物的生態(tài)基因庫(kù)［39］。最新研究發(fā)現(xiàn)，細(xì)菌之間在細(xì)胞膜被破壞后，通過(guò)質(zhì)粒進(jìn)行耐藥性的傳播，耐藥菌通過(guò)質(zhì)粒將自身含有的抗性傳給敏感菌使其獲得耐藥性［30］。本研究對(duì)敏感菌ATCC25922和耐藥菌M13的形貌觀(guān)察中均發(fā)現(xiàn)，在低劑量500 mg/L的TiO2-NPs濃度下，部分細(xì)胞出現(xiàn)穿孔現(xiàn)象亦或是破損；也有部分細(xì)胞生長(zhǎng)良好，表明TiO2-NPs對(duì)細(xì)胞壁和細(xì)胞膜具有一定的損傷作用，造成攜帶有耐藥的遺傳物質(zhì)泄露，在一定程度上會(huì)促進(jìn)耐藥性的傳播［40-41］。

圖3 TC和TiO2-NPs對(duì)大腸桿菌的抑菌率

圖4 TiO2-NPs對(duì)大腸桿菌菌體形態(tài)的影響

4 結(jié)論

本研究對(duì)雞糞中分離出的大腸桿菌M13和質(zhì)控菌株（E.coliATCC25922）進(jìn)行藥敏測(cè)試發(fā)現(xiàn)，M13具有12重抗性且包含TC抗性。與單獨(dú)添加梯度濃度四環(huán)素相比，納米TiO2的加入進(jìn)一步抑制了敏感菌的生長(zhǎng)，而耐藥菌變化不大。TiO2-NPs單獨(dú)和聯(lián)合暴露下對(duì)M13的抑菌率均在40%以下，而敏感菌在80%-100% 之間，耐藥菌M13除了耐抗生素，對(duì)納米TiO2也存在抗性，說(shuō)明微生物對(duì)抗生素和其它環(huán)境毒性因子的抗性機(jī)制存在著一些共性。