實時熒光PCR 技術檢測妊娠晚期孕婦B 族鏈球菌(GBS)感染的臨床效能

江平

江蘇省連云港市婦幼保健院中心實驗室，江蘇連云港 222002

當前臨床對于B 族鏈球菌 (group B streptococcus，GBS)的篩查主要有實時熒光PCR、細菌培養(yǎng)、核酸探針檢測、特異性抗原或抗體測定幾種方法，其中細菌培養(yǎng)法一直被視為金標準，不過該檢查所需時間很長，同時孕婦生殖系統(tǒng)中細菌種類多，普通培養(yǎng)基中會抑制GBS 的生長，出現(xiàn)漏診情況[1-2]。 另外選擇抗原檢測或者抗體檢測雖然可以迅速得到檢測結果， 不過存在比較明顯的假陽性或假陰性率[3]。 針對部分孕期沒有篩查GBS 的臨產(chǎn)孕婦，在短時間內獲得準確的篩查結果非常重要，PCR 檢測所需時間短，檢測結果具備良好靈敏度，被視作篩查GBS 的有效方法[4-5]。 該研究具體以2017 年10 月—2018 年12 月該院6 710 例妊娠晚期孕婦為對象， 分析實時熒光PCR 技術對于GBS 感染的篩查價值，現(xiàn)報道如下。

1 對象與方法

1.1 研究對象

以該院6 710 例妊娠晚期孕婦為對象， 年齡：20～43歲之間，年齡平均（32.66±10.09）歲。 孕婦孕周在35～37 周之間，均為單胎妊娠。 全部孕婦均排除剖宮產(chǎn)分娩；參與研究前1 個月有感染性疾病史； 以往有抗菌素全身使用或者局部使用史。 該研究孕婦均對研究內容知情同意，簽訂同意書，且研究獲得醫(yī)院倫理委員會批準。

1.2 方法

儀器試劑：B 族鏈球菌核酸檢測試劑盒；PCR 分析儀；微生物鑒定系統(tǒng)；GBS-DNA 提取試劑和擴增試劑盒；API菌種鑒定系統(tǒng)；全自動血培養(yǎng)系統(tǒng)。

采集標本：選擇1 無菌拭子深入肛門中，在括約肌上2～3 cm 的位置進行輕輕旋轉， 收集孕婦直腸部位的分泌物，同樣采集2 次，裝入1 個無菌套管中，視作1 份標本，進行密封保存。 另外將孕婦外陰分泌物擦凈后選擇1 無菌拭子深入孕婦陰道內1/3 處，旋轉1 圈后收集陰道分泌物，采集2 次，裝入1 個無菌套管中，視作1 份標本，進行密封保存。 標本采集完成后保證在1 h 之內送檢。

基因測序檢測： 在醫(yī)學檢驗中心比對編碼CAMP 蛋白序列、標本中基因序列，陽性標準為都有B 族鏈球菌特有的基因序列。

細菌培養(yǎng)檢測：在5%羊血培養(yǎng)基中接種陰道分泌物標本、直腸分泌物標本，分區(qū)、劃線，放在5%～10%二氧化碳培養(yǎng)箱中，培養(yǎng)箱溫度設置為35℃。實施持續(xù)24 h 的培養(yǎng)，按照菌落形態(tài)以及溶血情況，對可疑菌落進行涂片染色，借助顯微鏡進行觀察。 接著實施菌種鑒定，需要進行的試驗類型包括桿菌肽試驗、溶血試驗、七葉苷試驗、膽汁溶解試驗、觸酶試驗、馬尿酸鈉水解試驗、CAMP 試驗。

熒光PCR 檢測：先處理標本，將1 mL 滅菌生理鹽水加入無菌拭子管中， 高速進行10 min 的震蕩， 將拭子擠干，向試管移放標本懸液，在13 000 r/min 的速度下進行持續(xù)10 分鐘的離心處理，去除上清液后，將1 mL 滅菌生理鹽水加入剩下的沉淀物中，繼續(xù)在13 000 r/min 的速度下進行持續(xù)10 min 的離心處理，再次去除上清液。取沉淀物加入DNA 提取液，提取液主要成分為Tris-HCl、NaOH、Triton、EDTA，混勻，置99～100℃加熱10 min。 13 000RPM離心10 min。 PCR 反應液的主要成分為Taq 酶、UNG 酶、引物、探針、dNTP，取35 μL 至反應管，在PCR 反應管中加入樣本上清5 μL。 實施PCR 擴增，UNG 反應，50℃2 分鐘； 預變性，95℃5 min；PCR，95℃15 s，45 個循環(huán)；60℃時分別檢測FAM 和HEX 通道熒光信號，選擇反應體系40 μL?？瞻准瓣栃詫φ掌诽崛⊥?。

1.3 統(tǒng)計方法

數(shù)據(jù)通過SPSS 22.0 統(tǒng)計學軟件分析，計數(shù)資料表示為[n(%)]，經(jīng)χ2檢驗，P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 實時熒光PCR、基因測序法比較

以基因測序法為金標準，實時熒光PCR 對于GBS 篩查的靈敏度為97.62%， 特異度為99.68%， 準確度為99.55%，陽性預測值為95.35%，陰性預測值為99.84%，見表1。

表1 實時熒光PCR、基因測序法對于GBS 檢出情況比較（n）

2.2 實時熒光PCR、細菌培養(yǎng)法比較

實時熒光PCR 檢出GBS 陽性率為6.41%， 細菌培養(yǎng)法檢出GBS 陽性率為5.37%，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），見表2。

表2 實時熒光PCR、細菌培養(yǎng)法檢出GBS 陽性率比較

3 討論

早期細菌培養(yǎng)法是篩查GBS 感染的重要方法， 還包括培養(yǎng)后菌落的協(xié)同凝集試驗、膠乳凝集試驗，對于GBS的判定主要是通過觀察溶血性、菌落特點，并通過顯微鏡進行形態(tài)觀察，以及結合生化試驗結果[6-7]。 不過這種檢測需要花費1～2 d 時間才能得到結果， 同時操作上比較繁瑣，直腸、陰道部位的細菌還會對GBS 的繁殖形成抑制，培養(yǎng)存在比較明顯的難度， 并且對于大樣本篩查要求的快速性無法滿足，檢測陽性率無法保證[8-9]。 該組通過細菌培養(yǎng)，陽性率僅為5.37%，不足實時熒光PCR 檢出的陽性率6.41%， 也明顯低于基因測序法檢出的陽性率6.26%（χ2=6.590，P＜0.05）。 與楊潔等[10]研究顯示的細菌培養(yǎng)檢出陽性率3.4%比較也有一定差異。

當前熒光PCR 檢測在臨床得到越來越廣泛的應用，通過不同種屬GBS 的特異性核酸序列進行引物的設計，借助熒光探針進行標記，通過先進PCR 檢測儀器的應用，能夠在2～3 h 之內獲得檢測結果， 適用于大樣本的篩查，且結果靈敏度較高[11-12]。 該研究6 710 例孕婦經(jīng)實時熒光PCR 篩查顯示靈敏度為97.62%，特異度為99.68%，準確度為99.55%， 陽性預測值為95.35%， 陰性預測值為99.84%。 杜淑嫻等[13]研究顯示，PCR 法篩查GBS 感染的靈敏度為80.9%，特異性為99.1%，其中特異度結果與該研究具有一致性， 但靈敏度結果明顯更低， 考慮為研究對象、檢測操作、技術水平差異引起。

相比之下，實時熒光PCR 技術對于GBS 感染篩查的陽性率要高于細菌培養(yǎng)，其中一個原因是采集標本后，受到環(huán)境溫度、保存條件等各個因素的影響，GBS 部分可能出現(xiàn)死亡，這種情況下細菌培養(yǎng)會顯示為陰性結果，但熒光PCR 法可以將死亡后的GBS 檢測出來。 相關指南指出，最高接近2/5 的GBS 會傳遞給新生兒，其中接近3%的新生兒會出現(xiàn)GBS 感染，5%的新生兒會直接死亡[14]，所以做好GBS 感染篩查，及時發(fā)現(xiàn)孕婦GBS 感染，能夠指導臨床盡早治療干預，減少甚至避免向新生兒傳遞，提升生育質量。

綜上所述， 實時熒光PCR 技術檢測妊娠晚期孕婦B族鏈球菌感染準確度、靈敏度及特異度均較高，有助于指導臨床積極采取干預措施，控制GBS 感染，減少對分娩的影響。